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菌落PCR
菌落PCR与我们通常的普通DNA的PCR的不同在于，直接以单个菌作为模板。
是一种可以快速鉴定菌落是否为含目的质粒的阳性菌落。
操作简单，快接，阳性率较高，在转化鉴定中较常见。
操作方法：
1，挑取单个菌落，可以用高压灭菌的牙签。
现在含抗性的平板上画线，做保种用，然后置于20ultriton－x100中搅和一下，将相应的菌和板子上的画线区做上对应的记号
2，将装有20ulTritonx－100的EP管100度煮2分钟
3，按照菌中预期包含的质粒加好PCR体系，建议做20ul体系，模板加煮过的菌的上清1ul 4，上机即可。
退火温度可以稍低，虽然没有什么根据可言，但是个人经验，推荐比质粒PCR 时稍低
5，电泳，看结果，阳性的菌落对应的板子可以直接挑菌小摇，保种或者送测序都可以
方法细节：
用枪头挑选单菌落到装有20uL水的pcr管中，然后悬浮菌液。
在做PCR时，吸取1uL做摸板，但电泳检测后，选有阳性克隆相对的菌液10uL与试管的液体培养基中培养。
这样做，既初步检测了阳性克隆，又保存了所需要的菌落。
当然，在挑菌时也有用接种环挑的，有用牙签挑的，看个人的爱好了
我们都是直接拿牙签挑单菌落往PCR反应体系中搅拌一下，一般都能鉴定出来。
想节省麻烦的话，还可以菌落鉴定同时挑单克隆，用1.5的EP管装1mL左右培养基，牙签挑出菌落后先在培养基上搅拌然后再放到PCR反应体系中。
菌液PCR的经验已有578 次阅读 2013-6-19 11:27 |系统分类:科研笔记由于课题组所需，我需要构建数量可观的真核表达载体和融合载体起初我也查到相关菌落PCR的文献，和导师商量，导师一口回绝了他的理由和我所搜集到的理由一样：假阳性。
我们实验室一博士师姐需要做一个真核表达载体挑选了60个菌落，运用目的基因的上下游引物做PCR，出来条带的有有52个。
按照经验选取比较亮的14个提取质粒，酶切和PCR双鉴定。
结果仅有一个为阳性克隆，其余均为假阳性（假阳性主要考虑来源于未与载体结合的插入片段）。
也难怪老板一口回绝，只是我需要做的基因太多，最凶猛的时候我一个星期要用两个200次的TianGen的质粒小提，累死人不偿命。
后来我自己对着图谱研究了一下（我所使用的是pCDNA3.0载体、pCDNA3.1 myc his C载体和pEGFP载体）.0的MCS两端有T7和SP6如果我用T7和SP6作为引物，则1.P出大小约150bp的片段，则为MCS序列，无插入片段2,若有插入片段，则应该为目的大小+152bp如下图所示：后再改进为T7+目的基因下游引物（目的基因-R），或者目的基因上游引物（目的基因-F)+SP6，因为即使用T7+SP6证明有插入但也不能确定为目的片段这样既解决了假阳性也解决了基因的特异性问题如下图：总结如下：1.PCR引物的选择（此点至关重要，这也是菌液PCR的独特魅力所在）选择一个载体上的特异性序列和一个目的基因上的特异性序列作为引物如：pCDNA3.0载体：T7+目的基因-R 或SP6+目的基因-FpCDNA3.1 myc his C（只有上游T7无下游SP6）：T7+目的基因-RpEGFP（MCS两侧无通用序列）：自己设计靠近两侧的特异性引物（也可以求助于测序公司，如：上海英骏/Invitrogen，他们有绝大多数载体的测序用的引物序列）仔细的阅读你的载体图，选择针对阳性重组子的特异性引物组合2.菌落的处理（我用的是质粒小提，用15ml离心管摇菌，通常加5ml培养基）挑取新鲜菌落于含抗性的（LB）培养基中，37°C 200rpm摇床摇2-4小时以上（通常赶时间的话我就在摇后3小时做，这时我的PCR循环数就要相应多些，设置为32-35个循环，若不赶时间的话，我都是取摇过夜的活化菌做模板，此时我的PCR循环数就相应少些，一般28-30个循环）3.菌液的处理无需特殊处理菌液或取1-2ul菌液稀释为100倍体积，沸水浴10-15mins甚至于在稀释体系中按1/1000加triton（这个我没做过）提出加triton的人说这是为了破膜，以便能够释放出带目的基因的质粒，不过我觉得此步骤多次一举，细胞膜在沸水浴中肯定会变形掉我试过沸水浴15mins，其效果和无需处理的菌液（实际上我在PCR的体系上做了手脚，后述）近似，所以后来我就没有再那么麻烦的去稀释，煮沸4.pcr体系：无特殊要求同普通PCR，我一般使用20ul或25ul体系，鉴定用嘛，不用太铺张，过少的体系也不推荐，除非你很信任你的“枪”和你的加样的力度5.模板的量：1-2ul未处理的和处理过的菌液均可以加1-2ul作为模板，需要说明的是PCR的反应是一个微量反应，用于检测10的负3-6次方级别，如果用未做任何处理的菌落来做PCR其量过于大，菌落通常都是10的6次方级别（因为我看到最近有一帖是一位仁兄直接用菌落做模板，我没有做过验证，但从原理上来说是不推荐的）6.退火温度：55-58°C此步我没有详细的论证，因为我的目的基因我都做过梯度PCR，其退火温度均可以用55°C 或者58°C完成T7，SP6的退火温度400-900bp的产物大概为55°我也有62度为最佳退火温度的产物，但是用T7+目的基因-R在58°C和55°C均可以P 出目的条带7.循环数：取决于模板的拷贝数，最少的我试过28个，最多的也不过35个，均可以P出来8.预变形时间：因为嫌稀释菌液煮沸的过程很麻烦，所以后来我就直接取的活化菌液，考虑到的确可能细胞膜变形不完全，导致扩增的模板未能完全释放，以致扩增效率降低，我将预变形的时间改为10-15mins，效果不错，之前煮沸过的菌液自然不需要考虑这一步以上就是学弟的一点个人经验，绝大部分经过自己的验证，如有觉得不妥的地方还请大家多多指正！再次高呼：菌液PCR在阳性克隆的筛选中异常的方便和廉价，高度推崇！！！P.S. 通过长时间的魔鬼试验进程，我现在基本可以做到用肉眼高精度的识别菌落，一般挑取的菌落90%以上均为阳性菌落，所以这篇文章暂时定位于小鸟级别的分生试验者，老鸟。
菌液pcr的注意事项菌液PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种常用的分子生物学技术，用于扩增目标DNA片段。
在进行菌液PCR实验时，需要注意以下几个关键事项。
首先，要保证实验区域的无菌环境。
菌液PCR实验需要在无菌条件下进行，以避免外部的DNA污染。
实验者在进行操作前，应当清洁工作台，并喷洒酒精或其它消毒剂进行表面消毒。
同时，自己的实验操作要规范，避免自身的DNA污染。
其次，要选择合适的菌液样本。
菌液PCR的样本应该是含有目标DNA的菌液。
在选择菌液样本时，可以使用培养物中的菌液，或者是从病人或环境样品中提取的菌液。
选择样品时，应注意选择富含目标DNA的菌液，并避免有抑制PCR反应的物质存在。
然后，要优化PCR反应体系。
菌液PCR反应体系的优化是保证实验成功的关键因素之一。
首先，要选择适当的引物和模板浓度。
引物是起始PCR反应的关键，要确保引物与目标DNA序列完全互补，并且在PCR反应中能够扩增出需要的DNA片段。
模板浓度过高可能会导致PCR反应不稳定，影响扩增效果；而浓度过低则可能使扩增效果不明显。
其次，要选择适宜的酶和缓冲液。
常用的PCR酶有Taq酶和Pfu酶，它们在不同的温度和条件下具有不同的适应性。
在选择缓冲液时，要根据实验需求选择合适的酶活动温度和反应条件。
此外，还要注意控制PCR反应体系的pH值和离子浓度。
最后，要进行PCR反应的质量控制和结果分析。
为了保证PCR反应的可靠性，应当进行负对照实验。
在负对照实验中，将不加入模板DNA的样品作为反应组分之一，检测PCR反应是否存在假阳性。
此外，应当分析PCR扩增反应后产物的结果。
PCR扩增产物可以通过琼脂糖凝胶电泳进行分离和检测。
实验者应当根据需要选择适当的电泳条件，并根据PCR模板片段大小和扩增效果，判断实验结果的准确性。
综上所述，菌液PCR实验需要在无菌环境下进行，选择适当的菌液样本，优化PCR反应体系，进行质量控制和结果分析等。
菌液PCR的经验由于课题组所需，我需要构建数量可观的真核表达载体和融合载体起初我也查到相关菌落PCR 的文献，和导师商量，导师一口回绝了他的理由和我所搜集到的理由一样：假阳性我们实验室一博士师姐需要做一个真核表达载体挑选了60个菌落，运用目的基因的上下游引物做PCR，出来条带的有有52个。
按照经验选取比较亮的14个提取质粒，酶切和PCR双鉴定结果仅有一个为阳性克隆，其余均为假阳性（假阳性主要考虑来源于未与载体结合的插入片段）只是我需要做的基因太多，最凶猛的时候我一个星期要用两个200次的TianGen 的质粒小提，累死人不偿命后来我自己对着图谱研究了一下（我所使用的是pCDNA 3.0载体、pCDNA3.1 myc his C载体和pEGFP载体）.0的MCS两端有T7和SP6如果我用T7和SP6作为引物，则1.P出大小约150bp的片段，则为MCS序列，无插入片段2,若有插入片段，则应该为目的大小+152bp如下图所示：后再改进为T7+目的基因下游引物（目的基因-R），或者目的基因上游引物（目的基因-F)+SP6因为即使用T7+SP6证明有插入但也不能确定为目的片段这样既解决了假阳性也解决了基因的特异性问题如下图：总结如下：1.PCR引物的选择（此点至关重要，这也是菌液PCR的独特魅力所在）选择一个载体上的特异性序列和一个目的基因上的特异性序列作为引物如：pCDNA3.0载体：T7+目的基因-R或SP6+目的基因-FpCDNA3.1 myc his C（只有上游T7无下游SP6）：T7+目的基因-RpEGFP（MCS两侧无通用序列）：自己设计靠近两侧的特异性引物（也可以求助于测序公司，如：上海英骏/Invitrogen，他们有绝大多数载体的测序用的引物序列）仔细的阅读你的载体图，选择针对阳性重组子的特异性引物组合2. 菌落的处理（我用的是质粒小提，用15ml离心管摇菌，通常加5ml培养基）挑取新鲜菌落于含抗性的（LB）培养基中37°C 200rp m摇床摇2-4小时以上（通常赶时间的话我就在摇后3小时做，这时我的PCR循环数就要相应多些，设置为32-35个循环，若不赶时间的话，我都是取摇过夜的活化菌做模板，此时我的PCR循环数就相应少些，一般28-30个循环）3. 菌液的处理无需特殊处理菌液或取1-2ul菌液稀释为100倍体积，沸水浴10-15mins甚至于在稀释体系中按1/1000加triton（这个我没做过）提出加triton的人说这是为了破膜，以便能够释放出带目的基因的质粒，不过我觉得此步骤多次一举，细胞膜在沸水浴中肯定会变形掉我试过沸水浴15mins，其效果和无需处理的菌液（实际上我在PCR的体系上做了手脚，后述）近似，所以后来我就没有再那么麻烦的去稀释，煮沸4. pcr体系：无特殊要求同普通PCR，我一般使用20ul或25ul体系，鉴定用嘛，不用太铺张，过少的体系也不推荐，除非你很信任你的“枪”和你的加样的力度5. 模板的量：1-2ul未处理的和处理过的菌液均可以加1-2ul作为模板，需要说明的是PCR的反应是一个微量反应，用于检测10的负3-6次方级别，如果用未做任何处理的菌落来做PCR其量过于大，菌落通常都是10的6次方级别（因为我看到最近有一帖是一位仁兄直接用菌落做模板，我没有做过验证，但从原理上来说是不推荐的）6. 退火温度：55-58°C此步我没有详细的论证，因为我的目的基因我都做过梯度PCR，其退火温度均可以用55°C或者58°C完成T7，SP6的退火温度400-900bp的产物大概为55°我也有62度为最佳退火温度的产物，但是用T7+目的基因-R在58°C和55°C 均可以P出目的条带7. 循环数：取决于模板的拷贝数，最少的我试过28个，最多的也不过35个，均可以P出来8 .预变形时间：因为嫌稀释菌液煮沸的过程很麻烦，所以后来我就直接取的活化菌液，考虑到的确可能细胞膜变形不完全，导致扩增的模板未能完全释放，以致扩增效率降低，我将预变形的时间改为10-15mins，效果不错，之前煮沸过的菌液自然不需要考虑这一步以上就是学弟的一点个人经验，绝大部分经过自己的验证，如有觉得不妥的地方还请大家多多指正！再次高呼：菌液PCR在阳性克隆的筛选中异常的方便和廉价，高度推崇！！！P.S. 通过长时间的魔鬼试验进程，我现在基本可以做到用肉眼高精度的识别菌落，一般挑取的菌落90%以上均为阳性菌落，所以这篇文章暂时定位于小鸟级别的分生试验者，老鸟。
菌液pcr原理菌液PCR原理。
菌液PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种用于扩增微生物菌液中DNA的技术，它可以快速、高效地复制目标DNA片段。
这项技术在微生物学和生物医学研究中具有广泛的应用，可以帮助科研人员快速获得目标DNA序列，并进行进一步的分析和研究。
菌液PCR的原理主要包括DNA提取、PCR扩增和PCR产物检测三个步骤。
首先，需要对微生物菌液进行DNA提取。
DNA提取的目的是将微生物菌液中的DNA分离出来，为后续的PCR扩增提供原料。
DNA提取的方法多种多样，常用的包括酚/氯仿法、磁珠法和柱式提取法等。
通过这些方法，可以有效地将微生物菌液中的DNA提取出来，并得到纯净的DNA样品。
接下来是PCR扩增的步骤。
PCR扩增是利用DNA聚合酶酶（DNA polymerase）对目标DNA片段进行不断的复制，从而获得大量的目标DNA。
PCR扩增的关键是引物的设计，引物是用来识别目标DNA序列并进行扩增的短链DNA分子。
在PCR反应中，引物与目标DNA序列特异性结合，DNA聚合酶酶则在引物的引导下合成新的DNA链。
经过多轮循环，可以快速地获得数以百万计的目标DNA分子。
最后是PCR产物的检测。
PCR产物可以通过凝胶电泳、实时荧光定量PCR等方法进行检测和分析。
凝胶电泳是一种常用的分离DNA片段的方法，可以根据DNA片段的大小进行分离和检测。
而实时荧光定量PCR则可以实时监测PCR反应过程中产生的PCR产物，能够准确地定量目标DNA的数量。
总的来说，菌液PCR技术通过DNA提取、PCR扩增和PCR产物检测三个步骤，可以快速、高效地扩增微生物菌液中的DNA。
这项技术在微生物学研究、临床诊断和生物工程等领域具有重要的应用价值，为科研人员提供了强大的工具，帮助他们更好地理解微生物的遗传特性和生物学功能。
细菌基因敲除步骤
一、构建基因敲除载体
1.设计并合成含有目的基因同源臂的敲除载体。
2.将目的基因同源臂与敲除载体进行连接。
3.转化连接产物至合适的感受态细胞。
4.通过蓝白斑筛选，挑选含有敲除载体的菌落进行扩增培养。
二、将载体转化入感受态细菌
1.将含有敲除载体的菌液进行离心，收集沉淀。
2.沉淀用冰冷的0.1M CaCl2溶液洗涤，离心后弃上清。
3.沉淀物用感受态细胞悬浮，冰浴30分钟。
4.加入适量的DNA溶液，42℃热激60秒，冰浴2分钟。
5.加入LB培养基，37℃振摇1小时，使细菌复苏。
三、挑选转化子并进行PCR验证
1.将转化后的细菌涂布在含有抗生素的固体培养基上，37℃培养16-24小时。
2.挑选单一菌落，接种至LB液体培养基中培养。
3.通过PCR方法对细菌进行基因型验证。
4.对阳性克隆进行全基因组测序，确认基因敲除成功。
四、在培养基中筛选基因敲除株
1.将PCR验证成功的菌液进行扩大培养。
2.取适量菌液进行平板划线分离单菌落。
3.将单菌落接种至LB液体培养基中培养。
4.通过菌落PCR和Southern blot验证敲除成功。
五、保存敲除菌株并分析表型变化
1.将敲除成功的菌株进行甘油保藏或冷冻干燥保存。
2.对保存的敲除菌株进行表型分析，包括菌落形态、生长曲线和生化特性等
方面。
3.根据实验目的对敲除菌株进行相关表型实验和数据分析。
菌液PCR经验总结如下：1.PCR引物的选择（此点至关重要，这也是菌液PCR的独特魅力所在）选择一个载体上的特异性序列和一个目的基因上的特异性序列作为引物4 d i+ b' D9 _4 _. D6 R5 K如：pCDNA3.0载体：T7+目的基因-R或SP6+目的基因-FpCDNA3.1 myc his C（只有上游T7无下游SP6）：T7+目的基因-R9 i' {( P3 O& M2 gpEGFP（MCS两侧无通用序列）：自己设计靠近两侧的特异性引物（也可以求助于测序公司，如：上海英骏/Invitrogen，他们有绝大多数载体的测序用的引物序列）2.菌落的处理（我用的是质粒小提，用15ml离心管摇菌，通常加5ml培养基）- ^5 m5 T8 j" a( t( F挑取新鲜菌落于含抗性的（LB）培养基中* f2 B5 a* q( E$ ~4 p37°C 200rpm摇床摇2-4小时以上, y9 \& F& Y$ a& P/ N, v. R2 r（通常赶时间的话我就在摇后3小时做，这时我的PCR循环数就要相应多些，设置为32-35个循环，若不赶时间的话，我都是取摇过夜的活化菌做模板，此时我的PCR循环数就相应少些，一般28-30个循环）3.菌液的处理无需特殊处理菌液或取1-2ul菌液稀释为100倍体积，沸水浴10-15mins 甚至于在稀释体系中按1/1000加triton（这个我没做过）J提出加triton的人说这是为了破膜，以便能够释放出带目的基因的质粒，不过我觉得此步骤多次一举，细胞膜在沸水浴中肯定会变形掉,我试过沸水浴15mins，其效果和无需处理的菌液（实际上我在PCR的体系上做了手脚，后述）近似，所以后来我就没有再那么麻烦的去稀释，煮沸4.pcr体系：无特殊要求同普通PCR，我一般使用20ul或25ul体系，鉴定用嘛，不用太铺张，过少的体系也不推荐，除非你很信任你的“枪”和你的加样的力度r5.模板的量：1-2ul, ~6 U. i5 _0 @1 z K# ]' w未处理的和处理过的菌液均可以加1-2ul作为模板，需要说明的是PCR的反应是一个微量反应，用于检测10的负3-6次方级别，如果用未做任何处理的菌落来做PCR其量过于大，菌落通常都是10的6次方级别（因为我看到最近有一帖是一位仁兄直接用菌落做模板，我没有做过验证，但从原理上来说是不推荐的）7 v6 O# l" ~; G+ G1 E4 ^7 v2 ^# ^2 b8 m9 T' r( V" l J: c6.退火温度：55-58°C此步我没有详细的论证，因为我的目的基因我都做过梯度PCR，其退火温度均可以用55°C或者58°C完成,T7，SP6的退火温度400-900bp的产物大概为55°我也有62度为最佳退火温度的产物，但是用T7+目的基因-R在58°C和55°C均可以P出目的条带7 @4 D# s. P0 j' a+ l2 u7.循环数：取决于模板的拷贝数，最少的我试过28个，最多的也不过35个，均可以P 出来' x& I2 H; W! L6 B* W# A& h, Q0 F8.预变形时间：因为嫌稀释菌液煮沸的过程很麻烦，所以后来我就直接取的活化菌液，考虑到的确可能细胞膜变形不完全，导致扩增的模板未能完全释放，以致扩增效率降低，我将预变形的时间改为10-15mins，效果不错，之前煮沸过的菌液自然不需要考虑这一步a5 w7 C% _. S2 W% M7 s再次高呼：菌液PCR在阳性克隆的筛选中异常的方便和廉价，高度推崇3 b% u& Z7 P: Q$ I- Q4 Q1 y# V补充说明如下：7 v/ [$ Z% S$ X' D V8 `% k7 k鉴于很多同仁提到的假阳性的问题8 D- e' X5 S' E3 J我补充说明一下) M3 C" D; g! G( q- b1 y0 n* c4 W$ ]& j* @1 h# |0 M1.我需要做菌液PCR的目的是为了选取基因重组中的阳性克隆+ w* |. }0 Q" H5 x% {1 Z如果只是鉴定已获取的阳性质粒或是扩增,则不存在假阳性一说i) n2.我后面也补充说明了) R9 B' q3 \. _4 L* o通过调整合适的插入片段和载体的比例，基本上可以使得每个长出的菌落均为阳性菌落# n6 a$ R6 s( s$ G, _7 u后一组我后来通过浓度梯度做出来的图片# ?: p( G0 q5 T! M# w0 O* g插入片段和载体的mol比分别为4:1，7:1，10:1' j1 H3 N- D- w5 R8 b3种比率中7：1的是阳性连接比率最高的6 [4 B0 N% }6 _ S! j8 q0 c: f, [4：1的空载体最多所以，我想强调的是：通过调整合适的插入片段和载体的mol比例是可以完全做到长出的菌落全部为阳性菌落的另外，在挑取菌落的时候也是有讲究的,对于阳性菌落和无插入片段的载体菌落大小上是有一定区别的我在文章后来提到的通过选择具有一定特征的菌落以达到很高的阳性率也是可以做到的就是这个意思G" {我想通过这些手段也完全可以使菌液PCR显得多余所以我在文章的开头也说了,这篇文章应该是适合各位新手开始做重组时候的方法+ \3 |/ B9 O* i最后还有一个因素就是大家做重组的步骤上或许也有一些原因1 y- Y4 v) ?2 M+ w' h8 Z/ h, f7 P! T我用的是Invitrogen的T4 DNA ligase P$ {, n& X T( Q6 t4 T条件：26°C2-4h （我知道最好是16度过夜，只是苦于我们这里的实验室老师不让我们用PCR仪过夜，其他的设备又不能维持稳定的温度，且还和室温有关）转化：取1-2ul转化20ulTop10感受态细胞最后取150ul涂板，37°C过夜! j中间我也冥思苦想，考虑假阳性的源头最后考虑到的唯一的可能就是来自于未能和载体连接上的插入片段+ z7 M( N0 c1 ^我是直接取的连接产物去做转化2 F# s: B2 X1 r- _+ d* V- J（Invitrogen推荐的是将连接产物稀释至少10倍以上之后取2ul转化）: V- l b* S2 o3 d+ _自然这部分未能连接上的片段也被带入到扩增体系中0 A8 R' w7 u8 y) Y7 ~- ]最后这部分微量的插入片段被PCR仪扩增出来。
菌液PCR的具体操作方法一、前言菌液PCR是一种重要的分子生物学技术，用于扩增目标DNA片段。
本文将介绍菌液PCR的具体操作步骤及注意事项。
二、实验准备在进行菌液PCR之前，需要准备以下实验材料和设备： 1. PCR试剂盒：包括PCR 引物、Taq DNA聚合酶、dNTPs等。
2. 菌液样品：含有目标DNA片段的菌株培养物。
3. PCR扩增仪：用于控制PCR反应的温度。
4. 离心机：用于离心试剂和样品。
5. PCR管：用于混合反应体系。
6. 电源：用于供电。
三、菌液PCR的具体操作步骤3.1 DNA提取1.取一定量的菌液样品，将其转移到离心管中。
2.使用离心机将菌液离心10分钟，以沉淀菌细胞。
3.弃去上清液，加入适量的细胞裂解缓冲液。
根据不同的菌株和实验要求，可选择不同的细胞裂解方法，如热裂解、酶裂解等。
4.在细胞裂解液中加入蛋白酶K，并在37℃下孵育一段时间，以使细胞蛋白被降解。
5.加入等体积的酒精，使DNA沉淀。
6.使用离心机将混合液离心10分钟，以沉淀DNA。
7.弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀的DNA。
8.干燥DNA沉淀，最后加入适量的去离子水溶解DNA。
3.2 PCR反应体系的配置1.准备一份PCR反应液的配方表，根据实验需要计算出所需试剂的用量。
2.在PCR管中按照配方表的要求依次加入PCR引物、Taq DNA聚合酶、dNTPs等试剂，最后加入DNA模板。
3.使用微量移液器或自动化液体处理系统将各试剂充分混合。
3.3 PCR反应的设置1.将装有PCR反应液的PCR管放入PCR仪中。
2.根据目标DNA片段的长度和引物的特性，设定PCR反应的温度程序，包括变性、退火和延伸阶段的温度和时间。
3.开始PCR反应。
3.4 PCR反应后的处理1.取出PCR管，将反应液转移到离心管中。
2.使用离心机将反应液离心，以沉淀PCR产物。
3.弃去上清液，加入适量的缓冲液溶解PCR产物。
4.进行PCR产物的分析，可以使用凝胶电泳等方法。
P C R实验原理及步骤PCR，又称聚合酶链式反应，基本原理类似于 DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR 由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成。
实验方法原理①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。
重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
PCR反应体系10×扩增缓冲液10 ul4种dNTP混合物各200 umol/L引物各10～100 pmol模板DNA 0.1～2 ugTaq DNA聚合酶 2.5 uMg2+ 1.5 mmol/L加双或三蒸水至 100 ul模板制备（1）PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。
（2）模板的取材主要依据PCR的扩增对象，可以是病原体标本如病毒、细菌、真菌等。
也可以是病理生理标本如细胞、血液、羊水细胞等。
法医学标本有血斑、精斑、毛发等。
（3）标本处理的基本要求是除去杂质，并部分纯化标本中的核酸。
多数样品需要经过SDS和蛋白酶K处理。
难以破碎的细菌，可用溶菌酶加EDTA处理。
所得到的粗制DNA，经酚、氯仿抽提纯化，再用乙醇沉淀后用作PCR反应模板。
PCR反应条件控制1. PCR反应的缓冲液提供合适的酸碱度与某些离子。
2. 镁离子浓度总量应比dNTPs的浓度高，常用1.5 mmol/L。
PCR扩增的原理与操作步骤PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，用于在体外扩增特定的DNA片段。
PCR技术的应用非常广泛，包括基因克隆、基因突变分析、DNA测序等众多领域。
1. 变性（Denaturation）：在变性步骤中，将DNA样品加热至95°C，使DNA双链解开，生成两条单链DNA模板。
2. 退火（Annealing）：将温度降低至50-65°C，引物与模板DNA 进行互补配对。
引物是根据扩增片段的序列设计的，它能够与模板DNA的两侧互补区域形成氢键。
3. 延伸（Extension）：将温度升高至72°C，添加DNA聚合酶酶（一般使用Taq聚合酶），开始合成新的DNA链。
聚合酶以5'到3'方向在引物上作用，延伸DNA链，合成与模板DNA互补的新链。
此步骤形成了两条新的DNA双链。
1.准备反应混合液：将PCR反应所需的试剂按照表格中的比例加入酶标管或PCR管中。
反应混合液主要包括DNA模板、引物、酶、缓冲液和dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸盐）。
2.加热变性：将反应混合液放入热冷热循环仪或PCR仪中升温至95°C，使DNA双链解开。
3.退火：将温度降低至引物的退火温度，通常为50-65°C。
此步骤使引物与模板DNA的互补区域结合。
4. 延伸：将温度升高至72°C，添加DNA聚合酶酶（Taq聚合酶）和dNTPs，开始合成新的DNA链。
5.循环反应：重复2-4步骤的多轮循环。
每一轮循环会使DNA片段数量指数级增加。
6.终止反应：最后一轮循环结束后，将PCR反应管温度降至冷却状态，终止反应。
可以将PCR产物保存在低温下，或继续进行下一步实验。
需要注意的是，PCR扩增的实验条件因不同的实验目的和DNA片段而有所不同。
如引物的设计需要根据具体的扩增序列设计，反应条件的时间和温度也需要根据扩增片段的长度和GC含量进行调整。
菌液pcr原理菌液PCR原理。
菌液PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种用于扩增目标DNA片段的技术，它利用DNA聚合酶和一系列的引物来在体外复制DNA。
菌液PCR是一种非常重要的分子生物学技术，广泛应用于基因克隆、基因组学研究、医学诊断和法医学等领域。
本文将介绍菌液PCR的原理及其应用。
菌液PCR的原理。
菌液PCR的原理主要包括三个步骤，变性、退火和延伸。
在变性步骤中，PCR反应体系中的DNA双链被高温（通常为94-98摄氏度）所分离，形成两条单链DNA。
接下来是退火步骤，此时PCR反应体系降温，引物与目标DNA序列结合，形成引物-目标DNA复合物。
最后是延伸步骤，DNA聚合酶在适当的温度下将引物延伸成新的DNA 链，从而形成两条完整的双链DNA。
重复这一过程，就可以在短时间内扩增目标DNA片段。
菌液PCR的应用。
菌液PCR技术在许多领域都有着重要的应用。
在基因克隆中，菌液PCR可以快速、高效地扩增目标基因，为后续的克隆工作提供充分的材料。
在基因组学研究中，菌液PCR可以用于检测基因型、分析基因组结构等。
在医学诊断中，菌液PCR可以用于检测病原体、遗传疾病等。
在法医学中，菌液PCR可以用于犯罪案件的DNA鉴定等。
总结。
菌液PCR是一种非常重要的分子生物学技术，它在基因克隆、基因组学研究、医学诊断和法医学等领域都有着广泛的应用。
通过对菌液PCR的原理及其应用的介绍，我们可以更好地理解这一技术在生物学研究和临床诊断中的重要性，为我们的科研工作和临床实践提供更多的帮助。
希望本文对您有所帮助，谢谢阅读！。
真菌菌体直接PCR扩增的方法研究林艳云;陈忆婷;黄晓明;林峻【摘要】真菌属于真核微生物,它种类繁多,与人类的健康密切相关,同时某些真菌还能被安全地利用于食品生产和生物化工领域。
真菌分子生物学研究是微生物研究的一个重要领域,但由于真菌的细胞壁结构特殊,抗逆性强,使得真菌的核酸提取尤其困难。
为实现对真菌基因组的快速提取与扩增,本研究尝试利用市售常见的细胞裂解液对4种典型真菌的细胞进行破壁处理,然后直接使用PCR技术实现对真菌基因组的快速扩增。
结果显示黑曲霉513.88(Aspergillus niger 513.88)和里氏木霉(Trichoderma reesei)这两种重要的真菌可以使用细胞裂解液处理后实现直接PCR扩增。
【期刊名称】《生物化工》【年(卷),期】2018(004)006【总页数】4页(P7-10)【关键词】真菌基因组;裂解;直接PCR扩增【作者】林艳云;陈忆婷;黄晓明;林峻【作者单位】[1]福州大学至诚学院,福建福州350001;[1]福州大学至诚学院,福建福州350001;[2]福州大学生物科学与工程学院,福建福州350108;[2]福州大学生物科学与工程学院,福建福州350108;【正文语种】中文【中图分类】Q503真菌的种类繁多，既有对人类生产生活有益的真菌，同时也有对人类健康有害的病原真菌[1]。
真菌与其他微生物共同作用，对生态环境具有重要的作用，能够保持生态系统中有序的物质循环和能量流动[2]。
真菌可以作为生态系统的分解者[3]，具有生物防治病原体[4]、富集重金属[5-6]、降解农药[7-8]等多种作用。
现今人们进一步加大对真菌资源的开发利用，例如利用黑曲霉代谢系统及产酶系统来生产柠檬酸[9]、木聚糖酶[10]、淀粉酶[11]等；米曲霉可作为发酵调味品的生产菌株[12]，普遍用于蛋白酶和淀粉水解酶的生产，同时它被美国食品与药品管理局认定为安全微生物菌种[13]；利用里氏木霉的代谢特点可将木质纤维转化为生物质原料[14]，生产可再生能源，不仅能实现对废物的再利用，也能提供新型能源。
PCR扩增的原理和操作步骤PCR（polymerase chain reaction）是一种体外合成DNA的方法，能够迅速、高效地扩增特定DNA片段。
PCR广泛应用于基因工程、医学诊断、犯罪侦破等领域，其原理和操作步骤如下：一、PCR扩增的原理：PCR的主要步骤包括三个温度区间：变性（Denaturation）、退火（Annealing）和延伸（Extension）。
1. 变性（Denaturation）：PCR反应开始时，将含有所需DNA模板的反应液加热至95℃，使DNA的两条链解开，此过程称为变性。
在此过程中，DNA双链断裂，成为单链，失去了互补配对的能力。
2. 退火（Annealing）：将反应液降温至合适的温度，引物与目标DNA的互补序列进行特异性结合。
引物（primer）是一小段能够与目标序列互补配对的DNA序列，分别位于所需片段的两侧。
此引物具有互补配对能力，可稳定结合目标序列，防止在扩增过程中扩增非目标序列。
3. 延伸（Extension）：在引物的选择性作用下，加入DNA聚合酶，使其在适宜的温度下从引物的5'端延伸，合成互补链。
采用热稳定性的DNA聚合酶（如Taq DNA聚合酶），能够在较高温度下稳定工作。
通过循环进行上述三个步骤，每一个循环成功，将产生一个DNA双链，再通过新一轮的变性、退火和延伸，不断重复多次循环，扩增出大量目标DNA片段。
二、PCR扩增的操作步骤：1.DNA提取与纯化：首先，从待扩增的样品中提取出DNA，并净化以去除杂质和抑制物。
可以使用DNA提取试剂盒或手工方法进行提取。
2.引物设计与合成：选择适当的引物是PCR扩增的关键。
引物应与目标DNA序列互补配对，并应具备一些额外特性，如熔点适宜、长度适中等。
引物的设计可参考已知序列，也可使用生物信息学工具进行设计。
3.PCR反应体系准备：按照PCR反应所需的组成物质，准备PCR反应液。
主要包括目标DNA模板、引物、dNTP（脱氧核苷酸三磷酸酯）、Mg2+（镁离子）、缓冲液和DNA聚合酶等。
真菌菌体直接PCR扩增的方法研究
林艳云;陈忆婷;黄晓明;林峻
【期刊名称】《生物化工》
【年(卷),期】2018(004)006
【摘要】真菌属于真核微生物,它种类繁多,与人类的健康密切相关,同时某些真菌还能被安全地利用于食品生产和生物化工领域.真菌分子生物学研究是微生物研究的一个重要领域,但由于真菌的细胞壁结构特殊,抗逆性强,使得真菌的核酸提取尤其困难.为实现对真菌基因组的快速提取与扩增,本研究尝试利用市售常见的细胞裂解液对4种典型真菌的细胞进行破壁处理,然后直接使用PCR技术实现对真菌基因组的快速扩增.结果显示黑曲霉513.88(Aspergillus niger 513.88)和里氏木霉(Trichoderma reesei)这两种重要的真菌可以使用细胞裂解液处理后实现直接PCR扩增.
【总页数】4页(P7-10)
【作者】林艳云;陈忆婷;黄晓明;林峻
【作者单位】福州大学至诚学院,福建福州 350001;福州大学至诚学院,福建福州350001;福州大学生物科学与工程学院,福建福州 350108;福州大学生物科学与工程学院,福建福州 350108
【正文语种】中文
【中图分类】Q503
【相关文献】
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3.真菌菌体直接PCR扩增的方法研究 [J], 林艳云;陈忆婷;黄晓明;林峻;
4.土壤AM真菌PCR扩增方法优化 [J], 武慧;田媛;周晓馥
5.应用PCR扩增DNA直接测序及微量蛋白直接测序新技术发现珠蛋白基因新的突变类型 [J], 谢慎思
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目录2.1菌株的分离纯化 (1)2.1.1菌株的分离 (1)2.1.2菌株的纯化 (1)2.2菌株的鉴定 (2)2.2.1革兰氏染色镜检 (2)2.2.2菌株的生化鉴定 (2)2.3药敏试验 (3)2.3.1药物的配制 (3)2.3.2质控 (4)2.3.3MIC（最小抑菌浓度）实验 (4)2.4 CTX- M型基因的PCR扩增模板的提取 (7)2.5 CTX- M型基因的PCR扩增 (7)2.5.1 PCR 扩增引物及条件 (7)2.5.2电泳检测PCR扩增产物 (8)2.1菌株的分离纯化2.1.1菌株的分离2.1.1.1实验的准备1.分离管的准备：本实验需要100个50ml离心管（1）用过的离心管，将盖子拧开，加入清洁剂，沸水浴10min，毛刷清洁；（2）没入加入清洁剂的水中，灌满水，不要留有大气泡；（3）放入超声清洁机中超声清洁45min，25℃,100Hz；（4）倒出管中水，灌满去离子水，再超声20min，25℃，100 Hz；（5）倒出管中水，重复（4）一次；（6）倒出管中水，放入60℃烘箱中烘干；（7）待烘干后装入保鲜袋中，扎孔通气，再用报纸或牛皮纸包好，放入高压锅中高压灭菌，121℃，20min；（8）高压后取出放入烘箱中，烘干后待用。
2.BPW（蛋白胨水）的配制：按所选试剂的规格进行配制，再送入高压锅中高压灭菌，高压后放入烘箱中烘干待用。
注意瓶装液体高压前一定要盖子拧松。
3.试管的准备：本实验需要100根试管（1）塞子拔出，与试管一起放入清洁剂水中，沸水浴煮沸10min，毛刷清洁；（2）10个一捆，于烘箱中烘干后，塞上塞子，报纸或牛皮纸包好，高压；（3）取出后烘干待用。
4.LB肉汤培养液的准备：本实验需要100根LB管根据所选购商品说明配制，将配制好的LB培养液，分装到100根干净试管，每根3ml，包好后于121℃高压15min，烘干待用。
5.麦康凯琼脂培养基的准备：按所选商品说明配制，121℃高压15min，温度稍凉后于超净台中倒板，待吹干后收板待用。
此方法可能很多师兄师姐们都在用，只是当时的确没有找到相关的详细说明，学弟再次把自己摸索出来的一点心得写出来，高手就多多指正，没做过的就相互学习下，见笑）由于课题组所需，我需要构建数量可观的真核表达载体和融合载体起初我也查到相关菌落PCR的文献，和导师商量，导师一口回绝了他的理由和我所搜集到的理由一样：假阳性我们实验室一博士师姐需要做一个真核表达载体挑选了60个菌落，运用目的基因的上下游引物做PCR，出来条带的有有52个按照经验选取比较亮的14个提取质粒，酶切和PCR双鉴定结果仅有一个为阳性克隆，其余均为假阳性（假阳性主要考虑来源于未与载体结合的插入片段）也难怪老板一口回绝只是我需要做的基因太多，最凶猛的时候我一个星期要用两个200次的TianGen的质粒小提，累死人不偿命后来我自己对着图谱研究了一下（我所使用的是pCDNA3.0载体、pCDNA3.1 myc his C载体和pEGFP载体）.0的MCS两端有T7和SP6如果我用T7和SP6作为引物，则1.P出大小约150bp的片段，则为MCS序列，无插入片段2,若有插入片段，则应该为目的大小+152bp如下图所示：后再改进为T7+目的基因下游引物（目的基因-R），或者目的基因上游引物（目的基因-F)+SP6因为即使用T7+SP6证明有插入但也不能确定为目的片段这样既解决了假阳性也解决了基因的特异性问题如下图：总结如下：1.PCR引物的选择（此点至关重要，这也是菌液PCR的独特魅力所在）选择一个载体上的特异性序列和一个目的基因上的特异性序列作为引物如：pCDNA3.0载体：T7+目的基因-R或SP6+目的基因-FpCDNA3.1 myc his C（只有上游T7无下游SP6）：T7+目的基因-RpEGFP（MCS两侧无通用序列）：自己设计靠近两侧的特异性引物（也可以求助于测序公司，如：上海英骏/Invitrogen，他们有绝大多数载体的测序用的引物序列）仔细的阅读你的载体图，选择针对阳性重组子的特异性引物组合2.菌落的处理（我用的是质粒小提，用15ml离心管摇菌，通常加5ml培养基）挑取新鲜菌落于含抗性的（LB）培养基中37°C 200rpm摇床摇2-4小时以上（通常赶时间的话我就在摇后3小时做，这时我的PCR循环数就要相应多些，设置为32-35个循环，若不赶时间的话，我都是取摇过夜的活化菌做模板，此时我的PCR循环数就相应少些，一般28-30个循环）3.菌液的处理无需特殊处理菌液或取1-2ul菌液稀释为100倍体积，沸水浴10-15mins甚至于在稀释体系中按1/1000加triton（这个我没做过）提出加triton的人说这是为了破膜，以便能够释放出带目的基因的质粒，不过我觉得此步骤多次一举，细胞膜在沸水浴中肯定会变形掉我试过沸水浴15mins，其效果和无需处理的菌液（实际上我在PCR的体系上做了手脚，后述）近似，所以后来我就没有再那么麻烦的去稀释，煮沸4.pcr体系：无特殊要求同普通PCR，我一般使用20ul或25ul体系，鉴定用嘛，不用太铺张，过少的体系也不推荐，除非你很信任你的“枪”和你的加样的力度5.模板的量：1-2ul未处理的和处理过的菌液均可以加1-2ul作为模板，需要说明的是PCR的反应是一个微量反应，用于检测10的负3-6次方级别，如果用未做任何处理的菌落来做PCR 其量过于大，菌落通常都是10的6次方级别（因为我看到最近有一帖是一位仁兄直接用菌落做模板，我没有做过验证，但从原理上来说是不推荐的）6.退火温度：55-58°C此步我没有详细的论证，因为我的目的基因我都做过梯度PCR，其退火温度均可以用55°C或者58°C完成T7，SP6的退火温度400-900bp的产物大概为55°我也有62度为最佳退火温度的产物，但是用T7+目的基因-R在58°C和55°C均可以P出目的条带7.循环数：取决于模板的拷贝数，最少的我试过28个，最多的也不过35个，均可以P出来8.预变形时间：因为嫌稀释菌液煮沸的过程很麻烦，所以后来我就直接取的活化菌液，考虑到的确可能细胞膜变形不完全，导致扩增的模板未能完全释放，以致扩增效率降低，我将预变形的时间改为10-15mins，效果不错，之前煮沸过的菌液自然不需要考虑这一步以上就是学弟的一点个人经验，绝大部分经过自己的验证，如有觉得不妥的地方还请大家多多指正！再次高呼：菌液PCR在阳性克隆的筛选中异常的方便和廉价，高度推崇！！！P.S. 通过长时间的魔鬼试验进程，我现在基本可以做到用肉眼高精度的识别菌落，一般挑取的菌落90%以上均为阳性菌落，所以这篇文章暂时定位于小鸟级别的分生试验者，老鸟。
目录2.1菌株的分离纯化 (1)2.1.1菌株的分离 (1)2.1.2菌株的纯化 (1)2.2菌株的鉴定 (2)2.2.1革兰氏染色镜检 (2)2.2.2菌株的生化鉴定 (2)2.3药敏试验 (3)2.3.1药物的配制 (3)2.3.2质控 (4)2.3.3MIC（最小抑菌浓度）实验 (5)2.4 CTX- M型基因的PCR扩增模板的提取 (7)2.5 CTX- M型基因的PCR扩增 (7)2.5.1 PCR 扩增引物及条件 (7)2.5.2电泳检测PCR扩增产物 (8)2.1菌株的分离纯化2.1.1菌株的分离2.1.1.1实验的准备1.分离管的准备：本实验需要100个50ml离心管（1）用过的离心管，将盖子拧开，加入清洁剂，沸水浴10min，毛刷清洁；（2）没入加入清洁剂的水中，灌满水，不要留有大气泡；（3）放入超声清洁机中超声清洁45min，25℃,100Hz；（4）倒出管中水，灌满去离子水，再超声20min，25℃，100 Hz；（5）倒出管中水，重复（4）一次；（6）倒出管中水，放入60℃烘箱中烘干；（7）待烘干后装入保鲜袋中，扎孔通气，再用报纸或牛皮纸包好，放入高压锅中高压灭菌，121℃，20min；（8）高压后取出放入烘箱中，烘干后待用。
2.BPW（蛋白胨水）的配制：按所选试剂的规格进行配制，再送入高压锅中高压灭菌，高压后放入烘箱中烘干待用。
注意瓶装液体高压前一定要盖子拧松。
3.试管的准备：本实验需要100根试管（1）塞子拔出，与试管一起放入清洁剂水中，沸水浴煮沸10min，毛刷清洁；（2）10个一捆，于烘箱中烘干后，塞上塞子，报纸或牛皮纸包好，高压；（3）取出后烘干待用。
4.LB肉汤培养液的准备：本实验需要100根LB管根据所选购商品说明配制，将配制好的LB培养液，分装到100根干净试管，每根3ml，包好后于121℃高压15min，烘干待用。
5.麦康凯琼脂培养基的准备：按所选商品说明配制，121℃高压15min，温度稍凉后于超净台中倒板，待吹干后收板待用。
