下载文档原格式
第1篇一、实验目的1. 掌握小鼠肝组织中核酸的提取方法。
2. 了解DNA和RNA的组成差异及其鉴定方法。
3. 掌握防止核酸酶降解的措施。
4. 分析实验结果，验证实验方法的有效性。
二、实验原理核酸是生物体内重要的生物大分子，包括DNA和RNA两种类型。
DNA主要存在于细胞核中，负责遗传信息的存储和传递；RNA则参与蛋白质的合成和调控等生物学过程。
本实验旨在从小鼠肝组织中提取核酸，并对其进行鉴定和分析。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：小鼠肝脏、小牛胸腺细胞、氯化钠、柠檬酸钠、盐酸、硫酸、3，5-二羟甲苯、二苯胺、无水乙醇、氯仿等。
2. 实验仪器：高速冷冻离心机、电子天平、研磨器、恒温水浴锅、移液器、离心管等。
四、实验方法1. 小鼠肝匀浆制备：（1）取新鲜小鼠肝脏，用生理盐水洗净，去脂。
（2）将肝脏剪成小块，加入适量的生理盐水，用研磨器进行研磨。
（3）将研磨好的肝匀浆转移至离心管中，离心去除细胞碎片。
（4）收集上清液，即为肝匀浆。
2. 核酸提取：（1）取适量的肝匀浆，加入适量的氯化钠溶液，混匀。
（2）加入柠檬酸钠溶液，混匀，置于冰浴中10分钟。
（3）加入等体积的氯仿，混匀，静置10分钟。
（4）将混合液转移至新的离心管中，离心，收集上层水相。
（5）加入等体积的无水乙醇，混匀，静置30分钟。
（6）将混合液转移至新的离心管中，离心，收集沉淀。
（7）用75%乙醇洗涤沉淀，离心，收集沉淀。
3. DNA和RNA的鉴定：（1）取适量的DNA沉淀，加入适量的盐酸和硫酸，共热，观察颜色变化。
（2）取适量的RNA沉淀，加入适量的3，5-二羟甲苯和二苯胺，共热，观察颜色变化。
4. 防止核酸酶降解：（1）选取核酸酶含量较低的材料，如小牛胸腺细胞等。
（2）在制备肝匀浆时，应尽量在冰冷条件下进行。
（3）尽快加入含0.01 mol/L柠檬酸钠的0.14 mol/L氯化钠溶液，以抑制脱氧核糖核酸酶。
五、实验结果与分析1. 肝匀浆制备成功，细胞破碎充分。
附件6 RT-PCR检测汉坦病毒基因及分型材料：（1）急性期病人血清、鼠肺、鼠血或分离的汉坦病毒（2）引物：引物序列（5’～3’）位置片段（bp）逆转录引物TAGTAGTAGACTCC 1~14 LMS通用外引物AAAGTAGGTGITAYATCYTIACAATGTGG 1910~1939 M(+) GTACAICCTGTRCCIACCCC 2373~2354 M(-)型特异性引物汉滩病毒GAATCGATACTGTGGGCTGCAAGTGC 1958~1984 M(+) GGATTAGAACCCCAGCTCGTCTC 2318~2340 M(－) 汉城病毒GTGGACTCTTCTTCTCATTATT 1936~1957 M(+) TGGGCAATCTGGGGGGTTGCATG 2331~2353 M(－) S片段引物ATGTTGCCTGGGGIAAAGAGG 1200~1220 S(+) GCGCACTAGTAGTAGTAGACTCCCTAAAGA 1670~1696 S(-)方法：（1）病毒RNA的提取：采用TRIzol按说明提取，制备模板RNA；（2）逆转录、合成cDNA：采用SuperScrip TM II或AMV逆转录酶，按说明书进行；（3）PCR扩增：反应条件为95℃预变性10分钟，94℃60秒、55℃60秒、72℃45秒、扩增30～35个循环，72℃延伸12分钟。
（4）扩增产物用1～2％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
若条带的分子量与预期片段大小相同，则表明为特异性扩增产物。
必要时，可进行：（5）PCR片段的回收和核苷酸序列测定：切下特异分子量条带，用QIAquick 凝胶回收试剂盒回收（按其说明书进行），自动测序仪测序。
意义：扩增到特异性条带可确诊汉坦病毒并明确其型别，序列测定还可以对汉坦病毒的变异情况进行研究。
中俄双边七个口岸地区鼠传疾病病原体调查曹晓梅;王静;孙肖红;胡孔新;魏莲;高旭;赵刚;王玉梅【期刊名称】《寄生虫与医学昆虫学报》【年(卷),期】2011(018)003【摘要】对2007年中俄联合监测小组在中俄边境7个口岸地区捕获的鼠进行病原体检测,以了解中俄边境鼠传疾病病原体携带情况.采用RT-PCR法检测鼠肺标本中的汉坦病毒RNA.PCR方法检测鼠肝脏、脾脏中的鼠疫杆菌、土拉杆菌、莫氏立克次氏体的DNA核酸.PCR方法检测肾脏中钩端螺旋体DNA核酸.ELISA方法检测血清中出血热病毒总抗体.胶体金法检测鼠疫杆菌抗体、钩端螺旋体抗体、土拉杆菌抗体、莫氏立克次氏体抗体.结果显示鼠疫杆菌抗体、钩端螺旋体抗体、土拉杆菌抗体、立克次体抗体检测结果均为阴性.鼠疫杆菌、土拉杆菌、立克次体,钩端螺旋体的DNA核酸检测结果均为阴性.汉坦病毒3例核酸阳性,出血热总抗体8例阳性.结果表明中国抚远、俄罗斯布市、哈巴3个口岸地区应该注意肾综合征出血热的防控.【总页数】5页(P184-188)【作者】曹晓梅;王静;孙肖红;胡孔新;魏莲;高旭;赵刚;王玉梅【作者单位】中国检验检疫科学研究院,北京,100123;中国检验检疫科学研究院,北京,100123;中国检验检疫科学研究院,北京,100123;中国检验检疫科学研究院,北京,100123;中国检验检疫科学研究院,北京,100123;中国检验检疫科学研究院,北京,100123;黑龙江出入境检验检疫局,哈尔滨,150001;黑龙江出入境检验检疫局,哈尔滨,150001【正文语种】中文【相关文献】1.2012年中俄边境黑河口岸地区蜱携带病原体调查研究 [J], 闻静;赵刚;焦丹;王建华;王晓丹;王国政;时晓杰2.中俄双边口岸鼠类及体表寄生虫调查 [J], 曹晓梅;胡孔新;王静;赵刚;李明;郭晓明;杨军;温占清3.对满洲里口岸中俄贸易双边本币结算调查与思考 [J],4.南昌口岸鼠、蝇、蚊及其携带病原体的调查 [J], 刘小真;万筱荣;刘中韬;肖经和;汪雁南;王纲荣;陈洪兵;徐小强5.黑龙江省中俄边境七个口岸蜱类调查 [J], 崔文富;张少华;呼满霞;张健;郑超;范东辉;孙秀峰;崔永民;韩成军;赵晓龙;牛志兴;张阳;徐向东;杜忠河;李振江因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
汉坦病毒Vero细胞灭活疫苗候选毒种筛选(一)【摘要】目的将肾综合征出血热疫苗后备筛选毒株适应于Vero细胞，并对其抗原性和免疫原性进行研究。
方法将新分离的4株汉坦病毒接种敏感动物，在乳沙鼠脑内连续传代，比较脑内病毒抗原的含量以及乳鼠的发病情况；在Vero细胞中传代，比较培养液中的病毒滴度和抗原滴度以及细胞的病变情况；利用筛选出的毒株研制Vero细胞灭活疫苗，研究疫苗的免疫原性。
结果4株病毒经乳沙鼠脑内传代，鼠脑悬液的病毒滴度和抗原滴度分别达7 00～7 75LgCCID50/ml和1∶320～1∶1280；4株毒株经Vero细胞连续传5代，培养液病毒滴度和抗原滴度分别达6 50～7 50LgCID50/ml和1∶160～1∶768；疫苗免疫家兔2针后，其中出血热病毒株ZJ4与ZJ5株疫苗免疫血清对同型毒株的中和效价达到1∶10。
结论ZJ4与ZJ5两毒株已适应于Vero细胞，且具有病毒滴度高和免疫原性良好的特性，适合用作Vero 细胞肾综合征出血热疫苗理想的候选毒株。
【关键词】汉坦病毒肾综合征出血热(HFRS)是一种严重危害人体健康的自然疫源性疾病。
在各种预防HFRS的措施中，疫苗是一种最特异和最有效的预防手段。
迄今为止，本实验室已经研究出HFRSⅠ型、Ⅱ型和双价及双价纯化沙鼠肾灭活疫苗并已投入规模生产。
经现场流行病学调查，疫区人群的保护率在95%以上，为预防HFRS起到了重要的作用〔1，2〕。
但疫苗的毒种Z10野鼠型(HTN)和Z37家鼠型(SEO)均为20世纪80年代分离，距今已将近20年，随着时间的推移，HFRS 的流行及临床症状有较大的变化，这预示着引起该病的病毒有可能发生变异。
因此，必须选择疫苗的后备毒株，一旦发生目前疫苗保护率不高或不能保护时，即可用后备毒株生产疫苗。
2001～2002年，我们从浙江省的HFRS疫区鼠肺中分离到了9株汉坦病毒，筛选出病毒滴度较高、抗原性较好的4株毒株〔3〕，再将4株毒株在Vero细胞中的增殖特性、抗原性和免疫原性进行研究，从中筛选出ZJ4与ZJ5毒株为汉坦病毒Vero细胞灭活疫苗理想的候选毒株。
内部资料“艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治”科技重大专项传染病监测技术平台项目发热伴出血症候群监测方案 (2012版专项实施管理办公室二〇一一年十二月目录I. 流行病学设计 (1)一、监测目的 (1)二、监测哨点医院的设置 (1)三、监测病例定义 (1)四、监测任务 (1)五、监测流程 (2)六、数据收集、分析和反馈 ...........................................2Ⅱ . 标本的采集、运送及保存 (4)一、标本的采集 (4)二、标本的运送 (4)三.标本的保存 .....................................................5 III. 病毒检测内容及流程 (6)一、血液标本检测流程图 (6)二、血液标本的病毒检测方法 .........................................6 IV . 细菌检测内容及流程 . . (9)一、标本检测流程图 (9)二、标本处理 (10)三、各种标本的实验室检测方法 ......................................11 V . 寄生虫检测内容及流程 . (13)一、标本检测 (13)二、实验室检测方法 ................................................13Ⅵ . 质量控制与信息管理 (14)一、质量控制 (14)二、信息管理方案 ..................................................17 VII. 附件 ............................................................................................................................ 19附件1 发热伴出血症候群病例信息调查表 .............................19附件 2 发热伴出血症候群病例标本采样种类指导表 .....................20附件 3 发热伴出血症状症候群标本采集与处理、运送操作程序 .. (21)附件 4 发热伴出血症候群核酸提取方法 ...............................25附件 5 出血汉坦病毒、新疆出血热病毒、登革病毒实验室检测操作规程 ...30附件 6 新布尼亚病毒实验室检测操作规程 .............................69附件 7 鼠疫菌实验室检测操作规程 ...................................70附件 8 猪链球菌实验室检测操作规程 .................................79附件 9 钩端螺旋体实验室检测操作规程 ...............................82附件 10 立克次体实验室检测操作规程 .. (89)附件 11 人嗜吞噬细胞无形体实验室检测操作规程 .....................101附件 12 查菲埃立克体实验室检测操作规程 ...........................105附件 13 巴贝西亚虫实验室检测操作规程 .............................108附件 14 发热伴出血症候群实验室质量控制 ...........................112附件 15 发热伴出血症候群细菌学实验检测结果汇总表 .................114附件 16 发热伴出血症候群病毒学实验检测结果汇总表 .................115附件 17 质量控制与信息管理工作用表 . (116)I. 流行病学设计一、监测目的1、了解我国不同地区的发热伴出血症候群的病原谱构成。
5株鼠样品中分离汉坦病毒毒株S基因序列比较与分析胡群;邹春颖;马思杰;童淑梅;梅勇【摘要】目的了解近年来从宁波口岸捕获的鼠类样品中分离的5个汉坦病毒株遗传学差异.方法利用RT-PCR方法,对5个汉坦病毒株S基因全长进行扩增、克隆和测序,并将这5个毒株的S基因序列分别与GenBank登录的20个汉坦病毒感毒株进行比较分析.结果 DX1507株和DX1408株S基因核苷酸序列长度为1766 bp与汉城型(SEOV)病毒株Rn-DH27同源性最为接近,LJ1112株S基因核苷酸序列长度为1772 bp与汉城型(SEOV)病毒株Cherwell同源性最为接近,DX0903株和BL1402株S基因核苷酸序列长度为1725 bp与大别山型(DABV)病毒株Yongjia-Nc-95和Yongjia-Nc-38同源性最为接近.结论宁波口岸分离到的汉坦病毒株分别为汉城型和大别山型,对宁波口岸开展汉坦病毒传播防控有重要意义.【期刊名称】《中国人兽共患病学报》【年(卷),期】2016(032)005【总页数】4页(P502-505)【关键词】汉坦病毒;宁波;序列分析;S基因【作者】胡群;邹春颖;马思杰;童淑梅;梅勇【作者单位】大榭出入境检验检疫局,宁波315812;大榭出入境检验检疫局,宁波315812;大榭出入境检验检疫局,宁波315812;大榭出入境检验检疫局,宁波315812;大榭出入境检验检疫局,宁波315812【正文语种】中文【中图分类】R373汉坦病毒(Hantavirus, HV)是重要的人兽共患病病原体，人类感染HV后主要导致2种严重疾病，即肾综合征出血热(hemorrhagic fever withrenal syndrome，HFRS)和汉坦病毒肺综合征(hantaviruspulmonary syndrome，HPS)。
HV流行范围之广泛、危害严重，已经成为一个全球性的公共卫生问题[1-2]，近年来不断有新型或新亚型病毒被发现，已知HV至少可分为40个血清型/基因型，其中已证实至少有22个型的HV可引起人类疾病[3-4]。
三峡库区重庆段2014-2016年汉坦病毒鼠类宿主监测分析彭靖尧;黄为;凌华;毛德强;夏宇;蔡同建【摘要】目的通过对三峡库区重庆段2014-2016年汉坦病毒鼠类宿主的监测分析,分析鼠种构成及带毒特征,为三峡库区重庆段肾综合征出血热的防治提供依据.方法在三峡库区重庆段设置4个监测点,每年捕获鼠类宿主动物,分类后取其肺组织应用聚合酶链反应(PCR)方法进行汉坦病毒检测分型及带毒率分析.结果 2014-2016年在各监测点总共捕鼠8种637只,其中黄胸鼠280只,占总捕获数43.96％,平均鼠密度为3.94％;鼠肺汉坦病毒检出阳性35份,均为汉城型病毒,带毒率为5.49％;室内(4.59％)和户外鼠密度(3.39％)差异有统计学意义(x2=15.32,P＜0.05);主城区鼠密度(0.88％)与区县鼠密度(6.04％)差异有统计学意义(x2 =272.88,P＜0.05).结论三峡库区重庆段多种鼠类携带汉城型病毒,优势鼠种为黄胸鼠,主城区以外的各区县更应加强鼠患的防治.%Objective To analyze the composition of rodent host species and the viruliferous rat rate of Hantavirus,so as to offer essential scientific basis for hemorrhagic fever of renal syndrome(HFRS) prevention and control in Chongqing section of Three Gorges Reservoir.Methods Four monitoring stations were set in Chongqing section of Three Gorges Reservoir,and rats were captured every year during 2014-1016.Rats were taxonomically identified and their lung tissues were collected and tested for Hantavirus nucleotide sequences and host infection rate by real-time PCR test.Results Eight kinds of 637 rats were captured during 2014-2016 included 280 rattus flavipectus(43.96％).The average density of rodents was 3.94％.A total of 35 Hantavirus nucleotide positive lung samples were detected with uniform genotype Seoulvirus(SEOV).The rate of Hantavirus carrier was 5.49％.The difference of the density of rodents had statistical significance between outdoor(3.39 ％) and indoor(4.59 ％)(x2=15.32,P＜0.05).And the difference of the density of rodents had statistical significance in main city zone(0.88 ％) compared with other districts(6.04％)(x2 =272.88,P＜0.05).Conclusion Only genotype SEOV of Hantavirus is found in rodent host in this study and the dominant rat species is rattus flavipectus in Chongqing section of Three Gorges Reservoir.The districts far from main city zone should strengthen the prevention and control of the rodents.【期刊名称】《检验医学与临床》【年(卷),期】2017(014)023【总页数】3页(P3447-3448,3452)【关键词】汉坦病毒;肾综合征出血热;鼠密度;带毒率【作者】彭靖尧;黄为;凌华;毛德强;夏宇;蔡同建【作者单位】陆军军医大学(第三军医大学)军事预防医学院军队流行病学教研室,重庆400038;重庆市疾病预防控制中心 400042;重庆市疾病预防控制中心 400042;重庆市疾病预防控制中心 400042;重庆市疾病预防控制中心 400042;重庆市疾病预防控制中心 400042;陆军军医大学(第三军医大学)军事预防医学院军队流行病学教研室,重庆400038【正文语种】中文汉坦病毒隶属布尼亚病毒科，为分节段的负链RNA病毒，鼠类为自然宿主，其感染人类时会引发肾综合征出血热(HFRS)[1]。
902V〇L31 No. 8Journal of Aerospace Medicine Aug 2020染源为黑线姬鼠、褐家鼠等。
褐家鼠分布广、数量多，繁殖 能力强，为居民区优势鼠种，是汉坦病毒的主要宿主。
因此，日常监测中需重点关注，应制定有效的防制措施，严格 控制鼠密度。
按照ISO/IEC17025:2017条款要求，对三种 检测方法进行了方法验证，证实三种检测方法均可正确运 用，其中方法2的检测下限、重复性更好，推荐作为日常检 测的首选方法。
ISO/IEC17025:2017规定，“在引人检测 或校准之前，实验室应证实能够正确地运用这些标准方法”。
研究中的三种方法均来自于行业标准，但要正式使 用，仍需进行方法验证。
三种方法特异性、灵敏性、抗干扰 能力、亚型检测能力基本相同，但检测下限、重复性、等方 面存在一定的差异。
检测下限方面，第一轮PCR扩增，汉 滩病毒检测，方法2与方法3相同，优于方法1;汉城病毒 检测，方法3优于方法1,方法2优于方法1;第二轮PCR 扩增，汉滩病毒检测，方法2与方法3相同，优于方法I ;汉 城病毒检测，方法3优于方法1,方法2优于方法3。
因此，总体来说，检测方法2效果最好。
接着使用该方法，在多个 口岸鼠类监测中多次检出汉坦病毒核酸阳性样本。
近年 来，广东地区H FRS发病率逐年上升，以广州市、佛山市、深 圳市、东莞市、珠海市出现的病例数最多（占82. 6%)[7_9],珠海市自建市以来发生过多起病例，并呈散发流行。
病例 多发生于城乡结合处和环境复杂的地域，患者病情严重，预后差。
1995年3月在珠海市香洲区前山镇首次发现3例 H FRS疑似病例，经省、市卫生防疫站联合调查和疫源检索，证实为本地感染n°]。
珠海市区和口岸地区鼠间均存在 有汉坦病毒的感染。
黄利群等报道珠海市鼠间汉坦病毒 感染率呈上升趋势,鼠间流行传播教严重。
朱汉荣等调 查，鼠带毒率为2.69% [^13]，略低于全国平均阳性率(2. 75%)1141。
黑龙江黑河口岸鼠类及蜱类携带巴尔通体的调查鞠文东;王艳梅;徐宁;耿聪;韩茜宇;刘岩;程成;焦丹;黄洋【摘要】目的调查黑龙江黑河口岸鼠类及蜱类携带巴尔通体的情况.方法利用布旗法和夹夜法捕获蜱类及鼠类样本,其中捕获蜱类样本640只,鼠类样本8只,对样本进行处理后,利用PCR方法检测巴尔通体,获得的阳性样本通过基因测序进一步鉴定.结果在蜱类检测中,仅在森林革蜱中检测到巴尔通体,阳性数为22只,在森林革蜱中的感染率为3.77％(22/583);在鼠类检测中,仅在黑线姬鼠中检测到巴尔通体,阳性率为33.33％(2/6).结论黑龙江黑河口岸存在鼠类及蜱类携带巴尔通体的情况,提示应重点关注巴尔通体感染,并开展鼠类及蜱类携带巴尔通体的常态化监测.【期刊名称】《口岸卫生控制》【年(卷),期】2018(023)002【总页数】4页(P60-63)【关键词】黑河口岸;鼠类及蜱类;巴尔通体;监测【作者】鞠文东;王艳梅;徐宁;耿聪;韩茜宇;刘岩;程成;焦丹;黄洋【作者单位】黑龙江国际旅行卫生保健中心黑龙江,哈尔滨,150001;黑龙江国际旅行卫生保健中心黑龙江,哈尔滨,150001;黑龙江国际旅行卫生保健中心黑龙江,哈尔滨,150001;黑龙江国际旅行卫生保健中心黑龙江,哈尔滨,150001;黑龙江国际旅行卫生保健中心黑龙江,哈尔滨,150001;黑龙江国际旅行卫生保健中心黑龙江,哈尔滨,150001;黑龙江国际旅行卫生保健中心黑龙江,哈尔滨,150001;黑河出入境检验检疫局黑龙江,黑河,164300;黑龙江省森工总医院黑龙江,哈尔滨,150001【正文语种】中文【中图分类】R181.8黑河口岸是黑龙江对俄口岸中客运量最大口岸之一，举足轻重的客运大口岸地位，决定了口岸稳定安全的公共卫生环境对其的重要性，巴尔通体具有传播广泛、感染迅速、致病性强等特点，通过家畜及宠物既可传染给人类，长期以来地方卫生检疫的盲点导致相关疾病的蔓延，对口岸卫生安全构成潜在的威胁，本研究对中俄边境黑河口岸地区的蜱类、鼠类进行本底调查，对该地区的蜱类、鼠类所携带的巴尔通体（Bartonella）进行监测及检测，目的在于明确中俄黑河口岸地区蜱及鼠类种群状况及其携带的病原体本底情况，该研究对于及时快速监测中俄边境口岸地区的蜱媒、鼠媒携带巴尔通体具有重要意义。
