染色体步移技术

染色体步移技术(Genome walking）：这是一项重要的分子生物学研究技术，使用这种技术可以有效获取与已知序列相邻的未知序列。

染色体步移技术主要有以下几方面的应用：①根据已知的基因或分子标记连续步移，获取人、动物和植物的重要调控基因，可以用于研究结构基因的表达调控。

如分离克隆启动子并对其功能进行研究；②步查获取新物种中基因的非保守区域，从而获得完整的基因序列；③鉴定T-DNA或转座子的插入位点，鉴定基因枪转基因法等转基因技术所导致的外源基因的插入位点等；④用于染色体测序工作中的空隙填补，获得完整的基因组序列；⑤用于人工染色体PAC、YAC和BAC的片段搭接。

对于基因组测序已经完成的少数物种（如人、小鼠、线虫、水稻、拟南芥等）来说，可以轻松地从数据库中找到某物种已知序列的侧翼序列。

但是，对于大多数生物而言，在不了解它们的基因组序列以前，想要知道一个已知区域两侧的DNA序列，只能采用染色体步移技术。

常用的方法有：1. 反向pCR（reverse PCR）:其基本点是用适当内切酶裂解核心区外分子，使这些酶切片段自身连接形成环状分子，从而将边侧区域转化为内部区域。

用与核心区末端同源的引物，但其3’端趄向未知区域，可以进步用pCR扩增环中的未知区域。

反向pCR程序目前，反向pCR所扩增的片段的大小实际上限为3-4kb。

在许多情况下，首先需要进行Southern杂交来确定内切酶用以产生大小适于环化及反向pCR的片段的末端片段。

能裂解核心区的内切酶使反向pCR只能扩增引物所定模板(依赖于引物)的上游或上游区，而不裂解核心区的酶则使两上边侧序列都扩增，并带有由内切酶和环化类型决定的接点。

对于扩增左翼或右翼序列，初试时最好靠近识别上个碱基位位的酶，并已知在核心区有其方便的裂解位点。

如果用反向pCR 从含有大量不同的克隆片段的同一载体中探测杂交探针，建议事先在载体中引入合适的酶切位点。

用T4连接酶在稀DNA浓度下环化更容易形成单环。

某理工大学生物工程学院《现代分子生物学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、分析题（5分，每题5分）1. 写出从组织中抽取RNA的关键步骤，并解释如何判断RNA质量。

答案：（1）从组织中提取RNA的步骤如下：①将组织在液氮中所磨碎，每50～100mg组织加入1ml TRIzol 裂解液溶解样品，充分吹打混匀。

②每1ml TRIzol加入2.0ml氯仿，剧烈震荡15s，室温放置5min。

③4℃，10000g离心15min，此时RNA主要就集中在水相中。

④将水相转移至新的离心管中，加入等体积异丙醇，室温放置10min。

⑤4℃，10000g离心10min，其时可在离心管底部观察到白色沉淀，即为RNA。

⑥用75冷的乙醇洗涤沉淀，4℃，7500g以下，离心5min，弃上清。

⑦超净台中吹干，加入无RNase的水溶解。

（2）检测RNA质量的方法如下：①凝胶成像：取适量RNA溶液加入电泳缓冲液后，跑琼脂糖凝胶电泳，如果28S和18S条带明亮、清晰，并且28S的亮度在18S条带的两倍以上，则认为RNA的质量是好的。

②吸光度检测：使用紫外分光光度计检测RNA样品在260nm、280nm处的吸光度，若两者的比值在1.8～2.0时，可认为RNA纯度良好，蛋白质等其他物质自然界的污染可以接受。

解析：2、判断题（55分，每题5分）1. 增强子和沉默子是具有位置和方向效应的DNA元件。

（）答案：错误解析：增强子和沉默子是不具有位置和方向效应的DNA元件。

2. 细胞的分化是多细胞生物体发育的基础，也是单细胞生物体生活的周期变化的基础。

（）答案：正确解析：3. 叶绿体的rRNA核糖体是由16S、5S、23S、5.8S组成的。

（）答案：错误解析：叶绿体蛋白合成所有的核糖体的沉降系数为70S，由大小不等的两个亚基（50S和30S）组成，和原核生物的核糖体十分相似。

遗传学名词解释第一章遗传：子代与亲代相似的现象。

变异：子代与亲代不相同的现象。

遗传学：研究生物遗传和变异现象与规律的科学。

第二章染色体：完整的包裹在蛋白质基质中的DNA分子。

真核生物细胞处于分裂期，DNA逐渐螺旋化卷曲，呈现有固定形态的棒状小体。

染色质：细胞未分裂时，呈现出伸展和高度分散状态、没有固定形态结构的纤细网状物。

着丝粒：一种盘状结构，2条染色单体连接的部位。

主缢痕：着丝粒不会被染料染色，所以在光学显微镜下表现为染色体上一缢缩部位(无色间隔点)，所以又称为主缢痕。

次缢痕：某些染色体的一个或两个臂上往往还具有另一个染色较淡的缢缩部位，称为次缢痕；通常在染色体短臂上。

随体：次缢痕的末端的圆形或略长形的突出体，称为随体。

核仁组织中心：次缢痕在细胞分裂时，紧密地与核仁相联系。

与核仁的形成有关，因此也称为核仁组织中心(NOR)。

同源染色体：大小及形态相同，分别来源于父本和母本的一对染色体。

非同源染色体：形态结构不同的各对染色体。

性染色体：许多物种中，存在的一对形态和结构不同的同源染色体。

常染色体：除性染色体之外的其它染色体。

染色体组型或核型：由体细胞中全套染色体按形态特征(包括染色体长度、着丝点位置、臂比、随体有无等)和大小顺序排列构成的图形。

染色体带：当染色体被酶或其它化学药品处理后，经过染色显示出的深浅不同的带纹。

带型：不同的染色体具有的不同形态带的组成。

染色体显带：染色体带显示的过程。

由于实验中处理方法的不同，可以获得不同的带型模式，如Q带、G带、N带、R带和C带等。

显带的机制：一般认为所显示的带为异染色质在染色体上分布的区域。

异染色质：在细胞间期染色质线中，染色很深的区段。

常染色质：染色质线中染色很浅的区段。

半保留复制：一个DNA分子经过复制形成两个完全相同的子代DNA分子，子代DNA分子中都保留了亲代DNA双链中的一条，这种方式称为半保留复制。

无丝分裂：指通过细胞核拉长（呈哑铃状），中部缢缩形成2个相似的子细胞的过程。

１依赖酶切连接的PCR这类方法首先对基因组DNA酶切之后，然后让酶切产物自我成环或在酶切产物末端加上相应的接头。

以已知序列上的特异引物或接头上的锚定引物，扩增已知序列的上下游侧翼序列。

1.1 反向PCR反向PCR（inversPCR，IPCR）是Triglia等提出的扩增已知序列上游和下游未知序列的方法。

该方法的基本原理是对已知序列进行分析，选择已知序列中没有的限制性内切酶位点，酶切基因组DNA后，酶切片段环化自连，然后利用已知序列设计的反向引物，扩增已知序列两侧的未知序列，原理如图１。

因此，这种方法包含以下３个步骤：（１）基因组DNA 酶切；（２）线性酶切产物环化；（３）已知序列处设计的反向引物扩增目标片段。

在PCR 扩增之前，也可以根据已知序列用合适的内切酶将环化的DNA切割成线性DNA，这样更利于PCR反应的进行。

图1：反向PCR原理图最初，IPCR用于扩增基因组DNA的侧翼未知序列，后来利用T4聚合酶补平双链cDNA 末端后再环化，可以有效扩增已知cDNA的侧翼未知序列。

然而，IPCR存在技术缺点：（１）环化过程难以控制，基因组DNA酶切后，不同的酶切片段连接成线性串联体，致使非特异性扩增；（２）基因组DNA酶切位点随机分布，可能产生过长的酶切片段导致PCR扩增效率下降，成功率降低。

Benkel等在此基础上对IPCR的反应体系改进，可以扩增长达40Kb的片段。

Kohda等在对基因组DNA酶切之后，环化连接过程中，酶切位点之间加上一段桥连片段，有效扩增侧翼片段，这种方法称为桥连反向PCR（BI-PCR）。

BI-PCR扩增的特异性更高，操作更加简便。

最近，Tsaftaris等利用改进的滚环复制反向PCR从植物基因组DNA中成功分离出3Kb的启动子序列。

以IPCR为代表的连接成环PCR策略是首次利用PCR技术进行的染色体步移技术。

以此为基础，对基因组DNA酶切，在酶切末端加上接头或通过相应的方法在酶切末端加上已知序列，获得目标序列的PCR扩增的染色体步移技术大量涌现。

基因的染色体定位关键词：基因定位荧光原位杂交放射杂交体在人类基因组计划（HGP）中有二大部分内容，一是在2005年之前完成对人类基因组DNA约3×109个核苷酸序列的测定，同时完成对基因的染色体定位工作；二是开展基因功能的研究。

基因定位与基因序列两者相辅相成，基因染色体的定位既有助于基因序列的测定，又有利于对基因结构和功能的研究，有利于进一步提示生物的遗传信息。

基因测序技术，尤其是大规模测序技术的建立，极大地提高了基因测序的速度。

到1999年1月25日为止，全世界已测出全部人类基因序列的7.3%，而部分生物，如酵母、大肠杆菌等的序列已全部测定完毕，这样cDNA的染色体定位工作就显得尤为迫切。

然而由于目前的基因大规模测序是建立在基因定位的基础之上，而基因组的染色体定位（基因作图）工作跟不上基因测序技术的发展，因而成了限制基因序列测定的主要因素。

基因的染色体定位方法多种多样，它可分为基因的遗传作图和物理作图，而物理作图中最主要是荧光原位杂交（FISH）和放射杂交体（RH）二种。

本文就目前主要的几种基因作图方法作一介绍。

1 荧光原位杂交（FISH）原位杂交（ISH）原早被用于染色体组型和核酸分布的分析，后来，随着技术的发展，它被用于基因染色体定位的研究，特别是非同位素标记技术的发展，使得ISH的应用日前广泛。

目前它已被用于肿瘤的细胞遗传改变、人类的早期发育、核与基因组的分子结构、不同种属间的基因图谱比较、动物的细胞发生和无数的基因定位研究。

用于基因染色体定位的FISH已被称为CO-FISH或COD-FISH （chromosome orientation and direction FISH）[1]。

CO-FISH技术是以生物素或地高辛等半抗原为标记物，采用随机引物法或缺口平移法标记DNA探针，将探针变性后即可用于细胞分裂中期或间期细胞核染色体的原位杂交并产生DNA-DNA杂交体，这种杂交体可以被与半抗原有高度亲和力的荧光标记分子所检测到，而这种杂交信号又可以被与荧光分子偶联的单抗所放大。

河南农业大学考研专业课《现代分子生物学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、分析题（5分，每题5分）1. 写出原核表达实验步骤。

答案：原核表达实验步骤如下：（1）按上述步骤提取该组织的RNA，反转录为cDNA。

（2）以cDNA为模板，用上述引物扩增出带酶切位点的A基因片段。

（3）用BamHI和EcoRI分别切割目的片段和表现形式，连接酶将A基因和载体连接起来构成重组质粒。

（4）将并购质粒大肠杆菌转入感受态的大肠杆菌BL21中，涂布，根据载体所携带抗性的标记筛选出稳定遗传重组质粒的单克隆。

（5）摇菌、扩大培养，待菌液繁衍到对数生长期，收集菌体，裂解、收集蛋白质。

（6）将总蛋白制备成溶液通过镍柱，由于A蛋白携带有His标签，可以被吸附在镍柱上以，然后加缓冲液将吸附在镍柱上的A蛋白洗脱下来，即可得到A蛋白溶液。

解析：2、判断题（55分，每题5分）1. 组蛋白基因、rRNA基因和tRNA基因等都属于串联重复基因，它们的产物都是细胞所大量需要的。

（）答案：正确解析：串联重复基因的特点下述：①各成员之间有高度的序列一致性，甚至完全相同；②拷贝数高，常会十几个甚至几百个；③是非转录的间隔区短而一致。

组蛋白基因、rRNA基因和tRNA基因等都属于串联重复基因，它们的产物都是细胞所大量需要有的。

2. 一个基因就是一个转录单位。

（）答案：错误解析：转录单位是一段可被 RNA聚合酶转录成一条已连续的mRNA的DNA，包括转录起始和终止无线电波。

转录单位有别于基因，转录单位可能同时包含一个基因，也可能同时包含几个基因，另外，转录单位还包含启动子，非编码序列等。

所以，转录单位包含的DNA范围比基因广。

3. DNA中AT含量越高，其Tm值越高。

（）[扬州大学2019研]解析：4. 同一种真核mRNA前体，由于在不用细胞或组织中的差异剪辑，可以表达出多种氨基酸序列、长度及糖基化程度不同的多肽。

附录1．名词解释A腺嘌呤(adenine)abortive transduction 流产转导：转导的DNA片段未掺入到受体的染色体中，此DNA片段不能复制，只能传给两个子细胞中的一个，沿着单个细胞线传递。

acentric chromosome无着丝粒染色体：指缺乏着丝粒的染色体或染色单体。

achondroplasia 软骨发育不全：人类的一种常染色体显性遗传病，表型为四肢粗短，鞍鼻，腰椎前凸。

acroce n tric chromosome近端着丝粒染色体：着丝粒位于染色体末端附近。

active site 活性位点：蛋白质结构中具有生物活性的结构域。

adap t ation适应：在进化中一些生物的可遗传性状发生改变，使其在一定的环境能更好地生存和繁殖。

adenine 腺嘌呤：在DNA中和胸腺嘧啶配对的碱基。

albino 白化体：一种常染色体隐性遗传突变。

动物或人的皮肤及毛发呈白色，主要因为在黑色素合成过程中，控制合成酪氨酸酶的基因发生突变所致。

allele等位基因：一个座位上的基因所具有的几种不同形式之一。

allelic frequencies等位基因频率：在群体中存在于所有个体中某一个座位上等位基因的频率。

allelic exclusion等位排斥：杂合状态的免疫球蛋白基因座中，只有一个基因因重排而得以表达，其等位基因不再重排而无活性。

allopolyploi d y异源多倍体：多倍体的生物中有一套或多套染色体来源于不同物种。

Ames test埃姆斯测验法： Bruce Ames 于1970年人用鼠伤寒沙门氏菌（大鼠）肝微粒体法来检测某些物质是否有诱变作用。

amino acids氨基酸：是构成蛋白质的基本单位，自然界中存在20种不同的氨基酸。

aminoacyl-tRNA氨基酰- tRNA：tRNA的氨基臂上结合有相应的氨基酸，并将氨基酸运转到核糖体上合成蛋白质。

aminoacyl-tRNA synthetase氨基酰- tRNA合成酶：催化一个特定的tRNA结合到相应的tRNA分子上。

染色体步移技术（Genome Walking）染色体步行是一种常用的克隆已知基因旁侧序列的技术。

染色体步行是指由生物基因组或基因组文库中的已知序列出发逐步探知其旁邻的未知序列或与已知序列呈线性关系的目的序列的核苷酸。

现有的染色体步行PCR技术包括反向PCR、锅柄PCR、连接介导PCR、热不对称PCR、SON PCR等染色体步移技术主要有以下几方面的应用：1. 根据已知的基因或分子标记连续步移，获取人、动物和植物的重要调控基因，可以用于研究结构基因的表达调控。

如分离克隆启动子并对其功能进行研究；2. 步查获取新物种中基因的非保守区域，从而获得完整的基因序列；3. 鉴定T-DNA 或转座子的插入位点，鉴定基因枪转基因法等转基因技术所导致的外源基因的插入位点等；4. 用于染色体测序工作中的空隙填补，获得完整的基因组序列；5. 用于人工染色体PAC、Y AC 和BAC 的片段搭接。

其主要原理是根据已知DNA 序列，分别设计三条同向且退火温度较高的特异性引物（SP Primer），与退火温度较低的兼并引物，进行热不对称PCR 反应。

现在有很多Genome Walking Kit，相应的说明书都介绍得很详尽，下面给你发一个原理图：依据TaKaRa的试剂盒，具体的操作步骤如下：1. 基因组DNA 的获取。

基因组DNA 的质量是侧翼序列获取成功与否的关键因素之一。

建议不要使用只经过简单组DNA（例如：只进行细胞热处理或蛋白酶处理）作为模板，而要使用经过充分纯化的完整的基因组DNA。

此外，由于本方法灵敏度极高，模板DNA 一定不要污染，所需的DNA 量不要少于3 μg。

2. 已知序列的验证。

在进行PCR 实验之前必须对已知序列进行验证，以确认已知序列的正确性。

具体方法为：根据已知序列设计特异性引物（扩增长度最好不少于500 bp），对模板进行PCR 扩增，然后对PCR 产物进行测序，再与参考序列比较确认已知序列的正确性。

螺旋讲堂2010年第4期总第23期染色体步移内容概览：一、染色体步移技术概述二、常见的染色体步移技术介绍1、结合基因组文库的染色体步移技术1）物理剪切法构建亚克隆文库2）限制性内切酶法构建亚克隆文库2、基于PCR 技术的染色体步移技术1）连接成环PCR 2）外源接头介导PCR（1）连接载体的PCR（2）连接单链接头的PCR（3）连接双链接头PCR3）半随机引物PCR 策略（1）新Alu-PCR（2）DW-ACP TM PCR（3）热不对称交错PCR （TAIL-PCR ）三、染色体步移技术之TAIL-PCR1、TAIL-PCR 的原理2、TAIL-PCR 的优点以及技术难点3、TAIL-PCR的操作流程4、TAIL-PCR 中的注意事项5、常见问题分析生物人的网上家园plum螺旋网HelixNet 染色体步移技术是一种常用的克隆已知片段旁侧序列的技术。

本文中主要总结了近年来染色体步移技术的发展情况，介绍了结合基因组文库的染色体步移技术和基于PCR 的染色体步移技术，并且比较了他们之间的优缺点，最后着重与大家一起讨论一下TAIL-PCR 的相关内容，希望能对大家有所帮助。

一、染色体步移技术概述染色体步移(Chromosome walking)又称为基因组步移（Genome walking）是指由生物基因组或基因组文库中的已知序列出发，逐步探知其旁邻的未知序列或与已知序列呈线性关系的目标序列的方法。

对于已经完成基因组测序的模式生物种(如人、小鼠、线虫、水稻、拟南芥等)，可直接从数据库中轻松的找到已知序列的侧翼序列。

但是目前为止，自然界中大多数生物基因组DNA序列仍未知，要想知道一个已知区域两侧的DNA序列，染色体步移无疑是一种非常有效的方法。

因此，染色体步移技术在现代分子生物学研究中较为重要，本文主要就染色体步移的相关方法，不同方法之间的比较，着重以TAIL-PCR的原理，实验操作及注意事项等进行讨论。