糖胺聚糖的分析测定方法

糖胺聚糖的提取方法
糖胺聚糖是细胞壁结构中最重要的基本成分，它们可以充当胞内
信号介质，从而在细胞代谢和细胞功能之间起着重要作用。

糖胺聚糖
提取主要分为酶水解法、溶剂提取法以及大肠杆菌法三种。

酶水解法是最常用的提取方法。

该方法利用糖醛酶即β-葡萄糖醛酶，将细胞壁中的糖胺聚糖水解为低聚糖，然后通过适当的净化步骤
来分离出糖胺聚糖，从而实现糖胺聚糖的提取。

优点是反应条件温和，容易操作；缺点是效率较低，易受到外界条件的影响，糖胺聚糖的提
取量也较小。

溶剂提取法是利用有机溶剂提取细胞壁的特性，将其有机溶剂添
加到所需的细胞壁中，并利用溶剂把聚糖结合在一起，把其从细胞壁
中解离出来，实现糖胺聚糖的提取。

优点是操作简便，效率高；缺点
是有机溶剂的毒性和污染问题，甲醇和乙醚等溶剂的使用有可能导致
生态破坏。

大肠杆菌法是根据细胞壁膜糖胺聚糖与大肠杆菌膜糖蛋白的亲和力，以及大肠杆菌膜糖蛋白的被动转移性质，将细胞壁中的糖胺聚糖
转移到大肠杆菌膜糖蛋白表面，并通过反哺技术，将糖胺聚糖从膜糖
蛋白中抽取出来，从而实现糖胺聚糖的提取。

优点是操作简单，抗菌
能力强；缺点是抽取率不够高，容易受污染。

总之，目前有三种方法可以提取糖胺聚糖，它们都具有自己的优
缺点，因此，在实际使用中应根据具体情况充分考虑，以期更好地实
现所需的提取效果。

硫酸软骨素药效成分糖胺聚糖含量分析研究薛洪宝;梁丽丽;常华兰;田天;顾文杰;刘志祥;宫文武【期刊名称】《宁夏师范学院学报》【年(卷),期】2018(039)010【摘要】为探索硫酸软骨素成品制剂药效成分糖胺聚糖含量的分析检测方法,采用强阴离子交换硅胶填充柱高效液相色谱法对硫酸软骨素水解产物酸性黏多糖类物质含量进行分析检测.结果表明,该方法能对硫酸软骨素生产进行过程控制,且操作简捷易行,可靠性高,能为酸性黏多糖类物质的生产及研发提供有效的技术信息.【总页数】9页(P62-70)【作者】薛洪宝;梁丽丽;常华兰;田天;顾文杰;刘志祥;宫文武【作者单位】蚌埠医学院公共基础学院,安徽蚌埠233030;安徽宏业药业有限公司生产技术部,安徽蚌埠233045;蚌埠医学院公共基础学院,安徽蚌埠233030;蚌埠医学院公共基础学院,安徽蚌埠233030;蚌埠医学院公共基础学院,安徽蚌埠233030;蚌埠医学院公共基础学院,安徽蚌埠233030;安徽宏业药业有限公司生产技术部,安徽蚌埠233045;安徽省蚌埠市食品药品监督管理局药化生产科,安徽蚌埠233000【正文语种】中文【中图分类】TQ464【相关文献】1.高效液相色谱法测定复方盐酸氨基葡糖硫酸软骨素片中硫酸软骨素的含量 [J], 邢怀阳;赵仁;沈蔡月;吕凌2.糖胺聚糖的荧光标记及其与硫酸软骨素抗体的相互作用 [J], 韩章润;王玉峰;刘鑫;吴建东;曹欢;赵峡;柴文刚;于广利3.含玻璃酸钠的复方硫酸软骨素滴眼液中硫酸软骨素的含量测定 [J], 万秀玉;姜雯;潘继飞;张天民4.蛋白聚糖NG2中硫酸软骨素糖胺聚糖链调节稳定转染NG2的U251细胞迁移能力 [J], 刘钧松;霍锐;威廉·B·斯道卡普;池元斌;房学迅5.鲐鱼软骨糖胺聚糖的硫酸软骨素的结构及其与生长因子的相互作用 [J], 周跃钢因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

糖胺聚糖代谢一、糖胺聚糖简介糖胺聚糖（Glycosaminoglycan，GAG）是一类天然存在的线性多糖，由重复的二糖单位构成，是构成细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的主要成分之一。

糖胺聚糖由己糖胺和糖醛酸组成，常见的糖胺聚糖包括透明质酸（hyaluronic acid）、硫酸软骨素（chondroitin sulfate）、硫酸角质素（keratan sulfate）等。

二、糖胺聚糖代谢过程1.合成途径：糖胺聚糖的合成在细胞内进行，需要一系列酶的参与。

合成过程中涉及到的基本物质包括单糖、二糖和多糖。

合成步骤包括单糖的活化、单糖之间的连接以及多糖链的延伸和修饰。

其中，糖胺聚糖的单糖单位通常在核苷二磷酸激酶的催化下，由特定的核苷二磷酸供体合成。

2.修饰过程：在合成过程中，糖胺聚糖需要进行一系列的修饰，包括硫酸化、乙酰化、磷酸化等。

这些修饰可以影响糖胺聚糖的物理性质和生物活性，从而调节其在生物体内的功能。

3.分解途径：糖胺聚糖在生物体内可以被分解为更小的分子，如单糖和二糖。

这个过程主要发生在细胞内，需要特定的酶进行催化。

分解后的产物可以进一步被细胞利用或排出体外。

三、糖胺聚糖代谢与疾病1.癌症：研究表明，一些肿瘤细胞能够异常表达糖胺聚糖，这可能与其恶性转化和转移有关。

同时，异常的糖胺聚糖代谢也可能影响肿瘤细胞的免疫识别和抗肿瘤免疫反应。

例如，一些肿瘤细胞可以过度表达透明质酸酶等酶类，促进透明质酸的分解代谢，从而影响肿瘤的生长和扩散。

此外，异常的糖胺聚糖代谢还可能影响肿瘤细胞的粘附、迁移和扩散等行为。

因此，研究糖胺聚糖代谢与肿瘤的关系可以为肿瘤的诊断和治疗提供新的思路和方法。

2.炎症性疾病：炎症过程中，异常的糖胺聚糖代谢可能导致组织损伤和疾病进展。

例如，一些慢性炎症性疾病可能与过量表达或异常修饰的糖胺聚糖有关。

此外，异常的糖胺聚糖代谢还可能影响炎症细胞的迁移、活化和功能，从而影响炎症的发展和消退。

第二讲糖的分析方法一、中性糖的测定1．还原糖的次亚碘酸盐定量法适用：各种醛糖；适用于测定淀粉酶解时糖苷键水解的百分率，也可测定淀粉酶产物的寡聚糖链长。

基本反应：CH2OH(CHOH)n CHO+I2+3NaOH→CH2OH(CHOH)nCOONa+2NaI+2H2O (氧化)I2+2Na2S2O3→Na2S4O6+ NaI (滴定) 2．3,5-二硝基水杨酸（DNS）比色法原理：在碱性溶液中，3,5-二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原成棕红色氨基化合物，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。

注意：该法不是化学计量反应，戊糖、已糖和双糖与DNS反应的生色度A500/μmol糖的值分别是：戊糖（木糖、阿拉伯糖）：0.42；已糖（葡萄糖、半乳糖、甘露糖）：0.46；双糖（麦芽糖、乳糖）：0.65。

有人认为还原糖的醛基被氧化为羧基，但当量不准确，不同的糖类产生不等等量的色度，表明它的化学反应是较复杂的。

3．Somogyi-Nelson法还原糖将铜试剂还原成氧化亚铜，在浓硫酸存在下与砷钼酸生成蓝色溶液，在560nm下的光密度与还原糖浓度呈比例关系。

注意：比方法重复性较好，产物稳定，测定范围10-180μg/mL。

4．苯酚-硫酸法苯酚-硫酸试剂可与游离的或寡糖、多糖中的已糖、糖醛酸（或甲苯衍生物）起显色反应，已糖在490nm处，戊糖及糖醛酸在480nm处有最大吸收，吸收值与糖含量呈线性关系。

注意：（1）该法颜色持久，较稳定；（2）每种糖的显色值不同，故不宜直接用于杂多糖的定量测定；分析杂多糖时，可根据各种单糖的组成比及主要组分单糖的标准曲线的校正系数加以校正计算。

（3）有颜色的样品，测定值偏高；（4）此法较适于检测凝胶柱部分收集样品中相对糖量的分析。

5．蒽酮-硫酸法糖类遇浓硫酸脱水生成糠醛或其衍生物，可与蒽酮试剂缩合产生颜色物质，反应后溶液呈蓝绿色，于620nm处有最大吸收，显色与多糖含量呈线性关系。

动物源细胞外基质中糖胺聚糖物质的检测方法糖胺聚糖（GAGs）是一类多糖物质，广泛存在于动物组织的细胞外基质中。

它们在维持细胞外基质结构和功能、参与细胞信号传导、细胞增殖和分化等生物学过程中起着重要作用。

在许多疾病中，GAGs 的合成、代谢和降解出现异常，因此对GAGs的检测具有重要的临床和生物学意义。

本文将介绍动物源细胞外基质中GAGs物质的检测方法。

1. 琼脂糖凝胶电泳法琼脂糖凝胶电泳法是一种常用的GAGs分离和定量方法。

该方法基于GAGs的不同电荷密度和分子大小，在琼脂糖凝胶中进行电泳分离。

首先将细胞外基质样品经过酸水解或酶解处理，将GAGs水解成单糖和糖酸，然后通过琼脂糖凝胶电泳将其分离。

根据GAGs在琼脂糖凝胶中的迁移距离和标准品的比较，可定量测定样品中GAGs的含量。

该方法简单易行，但需要对样品进行水解处理，同时对不同类型的GAGs分离效果有所不同。

2. 高效液相色谱法高效液相色谱法（HPLC）是一种高分辨率、高灵敏度的分离和定量方法。

该方法基于GAGs的不同结构和化学性质，在反相或离子交换柱上进行分离。

首先将细胞外基质样品经过酸水解或酶解处理，然后通过HPLC将其分离，根据峰面积或峰高度定量测定样品中GAGs的含量。

该方法分离效果好，灵敏度高，但需要对样品进行水解处理，同时需要使用昂贵的仪器和试剂。

3. 酶联免疫吸附测定法酶联免疫吸附测定法（ELISA）是一种高灵敏度、高特异性的GAGs 检测方法。

该方法基于GAGs与特定抗体的结合，在酶标板上进行检测。

首先将细胞外基质样品或GAGs标准品加入到抗体涂层的酶标板中，然后加入特定的检测抗体，再加入酶标记的二抗，最后通过底物反应检测信号。

根据标准品的反应曲线和样品的光密度值，可定量测定样品中GAGs的含量。

该方法灵敏度高，特异性好，但需要使用昂贵的试剂和仪器。

4. 质谱法质谱法是一种高分辨率、高灵敏度的GAGs检测方法。

该方法基于GAGs的质量和分子结构，在质谱仪上进行分析。

动物源细胞外基质中糖胺聚糖物质的检测方法动物源细胞外基质（ECM）是组成组织和器官的关键成分之一，它包含多种生物大分子，如蛋白质、多糖和糖蛋白。

其中，糖胺聚糖是一类重要的多糖物质，它们在细胞外基质中发挥着重要的生物学功能。

本文将介绍几种常见的检测糖胺聚糖物质的方法。

一、显微镜观察显微镜观察是最常用的糖胺聚糖物质检测方法之一、通过染色或荧光标记等方式，可以直接观察细胞外基质中的糖胺聚糖分子。

目前，常用的染色方法有甲苯胺蓝（toluidine blue）染色和伊红（Safranin O）染色等。

这些染料可与糖胺聚糖分子结合，形成特定的颜色，从而能够在显微镜下直接观察到。

二、糖胺聚糖定量分析检测1.二氧化硫比色法(SO2-4比色法)二氧化硫比色法是一种常用的糖胺聚糖定量分析方法。

该方法是基于糖胺聚糖的特性，与孟骥反应，生成带有特征吸收峰的染料。

该染料的吸光度与糖胺聚糖的含量成正比，可以通过分光光度计测定吸光度，并用标准曲线法计算待测样品中糖胺聚糖的浓度。

2.硫酸铜比色法硫酸铜比色法是一种常用的糖胺聚糖含量测定方法。

该方法是通过硫酸铜与糖胺聚糖发生反应，生成浅蓝色络合物，并通过测定紫外光谱吸收峰的变化来定量糖胺聚糖的含量。

该方法简单易行，对样品的要求较低，适用于不同类型的糖胺聚糖物质。

三、免疫检测免疫检测是一种常用的糖胺聚糖检测方法，基于糖胺聚糖与特异性抗体的结合反应。

通过使用特异性的抗体，可以将糖胺聚糖物质从样品中分离出来，并形成可观察的免疫复合物。

常用的免疫检测方法有免疫组化染色和酶联免疫吸附测定法（ELISA）等。

免疫组化染色方法：在这种方法中，使用特异性的抗体和二抗，将糖胺聚糖与荧光标记或酶标记的二抗结合，然后通过显微镜观察并分析成像结果。

这种方法可以提供对糖胺聚糖分子在细胞外基质中的定位和表达水平的信息。

ELISA方法：这是一种高效的糖胺聚糖定量方法。

通过将样品中的糖胺聚糖与特异性的抗体结合，形成抗原-抗体复合物，然后使用酶标记的二抗来检测这些复合物。

动物源细胞外基质中糖胺聚糖物质的检测方法动物源细胞外基质（ECM）是一种重要的生物材料，它由多种复杂的分子组成，其中糖胺聚糖（GAGs）是其中一种重要的成分。

GAGs 在ECM中扮演着重要的生物学功能，包括细胞黏附、细胞信号传导、细胞生长和分化等。

因此，检测ECM中的GAGs物质是非常重要的。

本文将介绍一种检测ECM中GAGs的方法。

一、实验原理本实验采用二甲基亚砜（DMSO）-显色剂法检测GAGs。

GAGs与DMSO在高温下反应，生成葡萄糖醛酸和2-氨基-2-脱氧葡萄糖，然后用显色剂检测2-氨基-2-脱氧葡萄糖，从而间接检测GAGs的含量。

二、实验步骤1、制备样品将ECM样品放入离心管中，加入PBS缓冲液，振荡混匀后离心，去除上清液，再加入1 ml DMSO，放入高温水浴中加热30 min。

2、检测GAGs加入1 ml显色剂，混匀后室温下静置10 min，然后在波长为520 nm的光谱仪上检测吸光度。

3、计算GAGs含量根据标准曲线计算出样品中GAGs的含量。

三、实验结果使用本方法检测了不同来源的ECM样品中GAGs的含量。

结果表明，不同来源的ECM中GAGs含量存在差异，其中骨骼肌ECM中GAGs含量最高，肝脏ECM中GAGs含量最低。

四、实验优缺点本方法简单、快速、灵敏，适用于大规模样品的检测。

但是，样品的前处理过程可能影响到GAGs的含量，因此需要注意样品的处理过程。

五、实验应用本方法可用于检测不同来源的ECM中GAGs的含量，为研究ECM 的生物学功能提供了一种可靠的手段。

同时，该方法还可用于检测肿瘤组织中的GAGs含量，为肿瘤的诊断和治疗提供参考。

六、实验总结本文介绍了一种检测ECM中GAGs的方法，该方法简单、快速、灵敏，适用于大规模样品的检测。

该方法可用于研究ECM的生物学功能和肿瘤的诊断和治疗。

糖胺聚糖的物化分析鉴定方法熊双丽，金征宇（江南大学食品学院，江苏无锡214036）摘要综述了糖胺聚糖物化特性的研究状况及其各取代基的定性和定量鉴别方法。

关键词糖胺聚糖；定性分析；定量分析中图分类号Q539文献标识码A文章编号0517- 661（1 2005）12- 2373- 03糖胺聚糖是指包含氨基、糖醛酸及各种取代基的动物多糖，主要有软骨素类、透明质酸、肝素类物质。

其来源不同，具体成分和种类、结构完全不同，显现不均一性和微不均一性。

近年来，随着结构分子生物学和天然药食、生物可降解材料的兴起和发展，糖胺聚糖在分子生物学、生理学、病理学、药理学及临床应用方面的研究取得了巨大进展，对糖胺聚糖的提取、纯化及分析检测技术也日新月异。

笔者综述了糖胺聚糖的物化分析鉴定方法、原理及优缺点，旨在为糖胺聚糖的构效和应用研究提供参考。

1 糖胺聚糖物化特性研究糖胺聚糖属生物大分子，聚阴离子特性，其生物活性与本身的物化特性和生化特性有关。

为进一步了解糖胺聚糖分子的构效关系，拓宽其在医药、食品、保健品及生物材料的应用范围，深入研究其物化特性很有必要。

现阶段的研究主要集中在溶解性、流变学特性、溶液行为及改性等方面。

Tom ihata 等用水溶性的碳二亚胺对透明质酸进行交联，该交联剂本身不与透明质酸的多糖链进行化学合成，只参与促进多糖链上2 个羧基形成酸酐，随即与另一条链上的羟基成酯，借此使单链产生交联[1，2]。

不同交联度的透明质酸在体内的降解时间不同，许多研究者利用该特性将其作为缓释药物的载体，制备药物缓释制剂[3]。

2 糖胺聚糖的分析鉴定2.1 糖醛酸的定量测定主要有光谱法和色谱法。

①C/O 法，即将糖胺聚糖直接进行咔唑/硫酸法和地衣酚/盐酸法反应测定，以葡萄糖醛酸作参比标准测得己糖醛酸的含量，由前者C 和后者O 比值进行己糖醛酸的鉴别[5]。

②Jacob 先用碳酸钠将糖胺聚糖中可能存在的内酯水解，并使糖醛酸成盐，再用硼氢化钠将糖醛酸盐还原为醛糖酸盐，同时将醛糖还原为糖醇，醛糖酸盐加热后变为内酯，后者与正丙胺生成相应的酰胺，最后将糖醇和糖酰胺全乙酰化[8]。

糖胺聚糖简介糖胺聚糖是一种复杂的碳水化合物，存在于许多生物体中，包括高等植物、动物和某些微生物。

其合成和降解涉及一系列复杂的生物化学反应。

一、糖胺聚糖的合成糖胺聚糖的合成是在细胞内进行的，需要多种酶的参与。

首先，一个基本的糖单元，如半乳糖或葡萄糖胺，被连接到糖链的起始端。

然后，这些基本单位通过特定的连接方式，如β-1,3-或β-1,4-糖苷键，连接成更长的糖链。

这些连接方式是由特定的糖基转移酶控制的。

随着糖链的增长，它们可能会进一步被修饰，例如添加硫酸根或乙酰基，这增加了它们的复杂性和多样性。

二、糖胺聚糖的降解糖胺聚糖的降解过程同样复杂。

首先，糖胺聚糖可能会被特定的酶分解成较小的片段。

然后，这些片段可能会被进一步降解为单糖或更简单的糖类。

在这个过程中，硫酸根和乙酰基等修饰可能会被去除，还原糖链的基本结构。

三、糖胺聚糖与糖代谢的关系糖胺聚糖的合成和降解与糖代谢紧密相关。

一方面，糖胺聚糖的合成需要消耗能量和特定的糖类作为原料。

另一方面，糖胺聚糖的降解可以产生能量和简单的糖类，这些可以被进一步转化为其他类型的化合物或用于其他生物化学过程。

四、糖胺聚糖在生物体中的作用糖胺聚糖在生物体中发挥着多种作用。

由于其独特的物理化学性质，它们可以作为细胞间的信号分子、润滑剂、保护物质等。

例如，在某些植物中，糖胺聚糖可以作为防御物质，对抗病原体和害虫的侵害。

在动物中，它们可以作为细胞外基质的一部分，支持并保护细胞。

五、未来的研究展望尽管我们对糖胺聚糖的合成和降解有一定的了解，但仍然存在许多未知领域。

例如，我们仍不清楚这些复杂过程的精确机制，或者这些化合物在各种生物化学过程中的具体作用。

此外，随着基因组学和代谢组学等新方法的出现，我们可以更深入地研究这些化合物在生物体内的合成和降解过程。

这些研究可能会揭示新的生物化学过程和机制，从而为未来的生物工程和医学应用提供新的可能性。

六、结论总的来说，糖胺聚糖是一种重要的化合物，其合成和降解涉及复杂的生物化学过程。

多糖含量测定的方法综述
多糖是一类在生物体内具有重要功能的分子，如淀粉、纤维素、糖胺聚糖等。

多糖的含量测定对于生物医学研究、食品工业、环境保护等领域有重要的意义。

本文综述了常见的多糖含量测定方法，包括酚-硫酸法、安尔式法、酚-硫酸法、苏丹黑法、纳斯列酸法等。

1. 酚-硫酸法
酚-硫酸法是一种常用的多糖含量测定方法。

其基本原理是多糖与浓硫酸反应生成醛糖，再与酚反应形成紫色化合物，通过测量紫外吸收光度来确定多糖的含量。

该方法具有简单、灵敏、准确的特点，广泛应用于多糖含量的测定。

2. 安尔式法
安尔式法是一种常用的纤维素含量测定方法。

其原理是纤维素在硫酸中加热分解，生成肟化物，再与安尔式试剂反应形成有色化合物，通过测量光密度来确定纤维素的含量。

该方法适用于纤维素含量较高的样品，能够快速、准确地测定纤维素含量。

多糖含量测定方法多种多样，选择合适的方法取决于研究对象的不同。

以上综述了常见的多糖含量测定方法，希望能够为相关领域的科研工作者提供一定的参考。

第３９卷第３期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀中南民族大学学报（自然科学版）㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀Ｖｏｌ．３９Ｎｏ．３２０２０年６月㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀ＪｏｕｒｎａｌｏｆＳｏｕｔｈ⁃ＣｅｎｔｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｆｏｒＮａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ（ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＥｄｉｔｉｏｎ）㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀Ｊｕｎ．２０２０㊀㊀收稿日期㊀２０２０⁃０２⁃１２㊀㊀∗通信作者㊀赵金华（１９６５⁃），男，教授，博士，研究方向：天然产物心血管药理学与新药研发，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｚｈａｏ．ｊｉｎｈｕａ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ㊀㊀基金项目㊀国家自然科学基金资助项目（８１７７３７３７；８１７０３３７４）白玉蜗牛糖胺聚糖的分离纯化及结构表征王玭，宁子陌，时响，高娜，赵金华∗（中南民族大学药学院，民族药学国家级实验教学示范中心，武汉４３００７４）摘㊀要㊀为了研究白玉蜗牛中糖胺聚糖（ＡＦＧ）理化性质和化学结构，采用酶解⁃碱解处理法提取白玉蜗牛粗多糖，以季铵盐沉淀法和离子交换柱层析法纯化获得ＡＦＧ，得率为０．８８％．理化性质分析显示，ＡＦＧ为均一性的酸性粘多糖（Ｍｗ为２３８４０Ｄａ）；单糖组成分析及１ＨＮＭＲ谱图显示，ＡＦＧ是由等摩尔的Ｄ⁃乙酰氨基葡萄糖（Ｄ⁃Ｎ⁃ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ，ＧｌｃＮＡｃ）和Ｌ⁃艾杜糖醛酸硫酸酯（２⁃ｓｕｌｆａｔｅｄＬ⁃ｉｄｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ，ＩｄｏＡ２Ｓ）组成的糖胺聚糖；采用β⁃消除解法获得其解聚产物（ｄＡＦＧ），ＵＶ及１Ｈ／１３ＣＮＭＲ显示其非还原端为不饱和己糖醛酸，此与β⁃消除解聚法的糖苷键选择性解聚特点相符．结论：白玉蜗牛所含ＡＦＧ由等摩尔的ＧｌｃＮＡｃ和ＩｄｏＡ２Ｓ交替连接形成，其具有类似于肝素的结构特点；β⁃消除解聚可用于制备低分子量的ＡＦＧ解聚产物．关键词㊀白玉蜗牛；糖胺聚糖；理化性质；β⁃消除解聚中图分类号㊀Ｏ６５７．７１；ＴＱ４６４㊀文献标志码㊀Ａ㊀文章编号㊀１６７２⁃４３２１（２０２０）０３⁃０２６３⁃０７ｄｏｉ：１０．１２１３０／ｚｎｍｄｚｋ．２０２００３０８引用格式㊀王玭，宁子陌，时响，等．白玉蜗牛糖胺聚糖的分离纯化及结构表征［Ｊ］．中南民族大学学报（自然科学版），２０２０，３９（３）：２６３⁃２６９．ＷＡＮＧＰｉｎ，ＮＩＮＧＺｉｍｏ，ＳＨＩＸｉａｎｇ，ｅｔａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＧＡＧｆｒｏｍＣｈｉｎｅｓｅｗｈｉｔｅｊａｄｅｓｎａｉｌ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＳｏｕｔｈ⁃ＣｅｎｔｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｆｏｒＮａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ（ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＥｄｉｔｉｏｎ），２０２０，３９（３）：２６３⁃２６９．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＧＡＧｆｒｏｍＣｈｉｎｅｓｅｗｈｉｔｅｊａｄｅｓｎａｉｌＷＡＮＧＰｉｎ，ＮＩＮＧＺｉｍｏ，ＳＨＩＸｉａｎｇ，ＧＡＯＮａ，ＺＨＡＯＪｉｎｈｕａ（ＮａｔｉｏｎａｌＤｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎＣｅｎｔｅｒｆｏｒＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＥｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙＥｄｕｃａｔｉｏｎ，ＳｃｈｏｏｌｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｏｕｔｈ⁃ＣｅｎｔｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｆｏｒＮａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ，Ｗｕｈａｎ４３００７４，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀Ｔｏｓｔｕｄｙｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓａｎｄｃｈｅｍｉｃａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏ⁃ｇｌｙｃａｎ（ＡＦＧ）ｆｒｏｍｗｈｉｔｅｊａｄｅｓｎａｉｌ（Ａｃｈａｔｉｎａｆｕｌｉｃａ），ｔｈｅｃｒｕｄｅｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｏｆｗｈｉｔｅｊａｄｅｓｎａｉｌｗａｓｅｘｔｒａｃｔｅｄａｆｔｅｒｐｒｏｔｅｄｙｓｉｓａｌｋａｌｉｎｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ．ＡＦＧｗａｓｐｕｒｉｆｉｅｄｂｙｂｅｎｚｅｔｈｏｎｉｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅａｎｄａｎｉｏｎｅｘｃｈａｎｇｅｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ａｎｄｔｈｅｙｉｅｌｄｗａｓ０．８８％．ＡＦＧｉｓａｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓａｃｉｄｉｃｍｕｃｏｐｏｌｙｓａ⁃ｃｃｈａｒｉｄｅｗｉｔｈＭｗｏｆ２３８４０Ｄａ，ａｎｄｃｈｅｍｉｃａｌｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ，ＩＲａｎｄＮＭＲｓｐｅｃｔｒａｓｈｏｗｅｄＡＦＧｗａｓｃｏｍｐｏｓｅｄｏｆ２⁃ｓｕｌｆａｔｅｄｉｄｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ（ＩｄｏＡ２Ｓ）ａｎｄＮ⁃ａｃｅｔｙｌ⁃ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ（ＧｌｃＮＡｃ）．ＡＦＧｗａｓｄｅｐｏｌｙｍｅｒｉｚｅｄｂｙβ⁃ｅｌｉｍｉｎａｔｉｖｅｄｅｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｔｏｙｉｅｌｄｄＡＦＧ．ＴｈｅＵＶａｎｄ１Ｈ／１３ＣＮＭＲｓｐｅｃｔｒａｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｄＡＦＧｗａｓｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔｗｉｔｈＡＦＧｅｘｃｅｐｔｔｈｅｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄｕｒｏｎｉｃａｃｉｄａｔｔｈｅｎｏｎ⁃ｒｅｄｕｃｉｎｇｅｎｄ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＡＦＧｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｗｈｉｔｅｊａｄｅｓｎａｉｌ（Ａｃｈａｔｉｎａｆｕｌｉｃａ）ｉｓｃｏｍｐｏｓｅｄｏｆａｕｎｉｆｏｒｍｒｅｐｅａｔｉｎｇｄｉｓａｃｃｈａｒｉｄｅｏｆ４⁃Ｌ⁃ＩｏｄＡ２Ｓ⁃α１，４⁃Ｄ⁃ＧｌｃＮＡｃ⁃α１．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀Ａｃｈａｔｉｎａｆｕｌｉｃａ；ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ；ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ；β⁃ｅｌｉｍｉｎａｔｉｖｅｄｅｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ㊀㊀糖胺聚糖（ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ，ＧＡＧ）是一类由己糖醛酸（或己糖）和氨基己糖交替连接而成的多糖类化合物．常见的ＧＡＧ有硫酸软骨素㊁硫酸角质素㊁硫酸乙酰肝素㊁肝素（ｈｅｐａｒｉｎ，ＨＰ）㊁透明质酸等．其中，肝素是由氨基葡萄糖（ＧｌｃＮＡｃ）和艾杜糖醛酸ＩｄｏＡ（９０％）或葡萄糖醛酸（ＧＬｃＡ）（１０％）以α１，４糖苷键交替连接形成，且存在Ｎ⁃硫酸基，Ｏ⁃硫酸基以及Ｎ⁃乙酰化等多种结构修饰［１］，因此其一级结构较为复杂．肝素因含有与抗凝血酶ＩＩＩ特异性结合的特殊的戊糖序列而具有强效的抗凝抗血栓活性，另外，肝素还具有抑制肿瘤生成与转移㊁抑制血管生成㊁抗炎等多种生物活性［２］．上世纪９０年代，Ｋｉｍ等［３］首次从非洲大蜗牛（Ａｃｈａｔｉｎａｆｕｌｉｃａ）体内分离出一种新型的糖胺聚糖，是由ＧｌｃＮＡｃ与ＩｄｏＡ２Ｓ通过α（１ң４）糖苷键连接的糖胺聚糖，其化学结构近似肝素及硫酸乙酰肝素而更为规则，该ＧＡＧ不具有抗凝血活性，而具有抗炎㊁抑制血管生成㊁抑制肿瘤生长㊁抑制成纤维细胞生长因子ＦＧＦ⁃２活性等显著的药理活性［４］．白玉蜗牛（Ａｃｈａｔｉｎａｆｕｌｉｃａ）属柄眼目玛瑙螺科，是非洲大蜗牛的白化亚种，是我国已大量人工养殖的陆生贝壳类食材，具有丰富的营养成分和广泛的医药保健价值．本文以白玉蜗牛肉为原料，对其所含的糖胺聚糖（ＡＦＧ）进行提取纯化，采用具有糖苷键选择性的β⁃消除解聚法对ＡＦＧ进行解聚，分析ＡＦＧ单糖组成和硫酸羧酸摩尔比，结合ＡＦＧ及ｄＡＦＧ的理化性质及波谱分析法解析其基本化学结构，为阐明其构效关系及药理机制奠定基础．１㊀实验仪器与材料１．１㊀仪器电导率仪（ＤＤＳＪ⁃３０８Ａ，上海仪电），紫外可见光分光光度计（ＵＶ２４５０，Ｓｈｉｍａｄｚｕ公司），全自动数字旋光仪（ＡｕｔｏｐｏｌＩＶ⁃Ｔ，美国Ｒｕｄｏｌｐｈ），傅立叶变换中红外光谱仪（Ｔｒａｃｅｒ⁃１００，日本岛津），超导核磁共振仪（ＡｄｖａｎｃｅⅢ６００ＭＨｚ，瑞士布鲁克），高效液相色谱仪（Ａｇｉｌｅｎｔ１２６０，美国安捷伦）．１．２㊀实验材料与试剂白玉蜗牛（Ａｃｈａｔｉｎａｆｕｌｉｃａ），购于湖北逸锋白玉蜗牛养殖专业合作社．ＳｅｐｈａｄｅｘＧ１０（ＧＥ，美国），ＡｍｂｅｒｌｉｔｅｒＦＰＡ９８（Ｃｌ－）阴离子树脂（罗门哈斯，美国），阳离子交换树脂［Ｄｏｗｅｘˑ５０Ｗˑ８１００ ２００（Ｈ），陶氏，美国］．碱性蛋白酶（２０万单位／ｇ，索莱宝），３０％Ｈ２Ｏ２㊁三氯甲烷㊁五氧化二磷㊁Ｎ，Ｎ⁃二甲基甲酰胺㊁氯化苄㊁金属钠（ＡＲ，国药集团）；Ｌ⁃艾杜糖醛酸（ＩｄｏＡ，上海源叶），Ｌ⁃（⁃）⁃半乳糖（Ｇａｌ）㊁１⁃苯基⁃３⁃甲基⁃５⁃吡唑啉酮（ＰＭＰ）㊁三氟乙酸（阿拉丁），１，９⁃二甲基亚甲蓝（ＤＭＭＢ）㊁Ｄ⁃葡萄糖（Ｇｌｃ）（Ｓｉｇｍａ），Ｄ⁃半乳糖胺盐酸盐（ＧａｌＮ㊃ＨＣｌ）㊁苄索氯铵（麦克林），氨基葡萄糖（ＧｌｃＮ）（上海荣泰制药）．２㊀实验方法２．１㊀ＡＦＧ的提取纯化取干燥白玉蜗牛肉（去内脏）８００ｇ粉碎，主要提取纯化步骤如下［５］．酶解：加入１０倍量去离子水，搅拌，５０ħ下加入碱性蛋白酶（终浓度为１％），并缓慢加入６ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ保持ｐＨ在９左右，酶解２４ｈ．碱解：加入６ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ至终浓度为０．５ｍｏｌ／Ｌ，５０ħ碱解２ｈ，冷却至室温，６ｍｏｌ／ＬＨＣｌ调ｐＨ至中性，静置过夜，离心去沉淀．上清加入９５％食用乙醇至终浓度为６０％，静置过夜，离心得沉淀．脱色：沉淀用５倍量去离子水溶解，加入３０％Ｈ２Ｏ２使其终浓度为３％，ｐＨ保持在１０左右，５０ħ脱色２ｈ，冷却至室温后，６ｍｏｌ／ＬＨＣｌ调ｐＨ至中性，离心去沉淀，得脱色液．盐析醇沉：脱色液加入９５％食用乙醇以终浓度为４０％和６０％分级醇沉．６０％醇沉的沉淀即为粗多糖．纯化：粗多糖用去离子水溶解，１０ｋＤａ超滤脱盐后，缓慢加６２．５ｍｇ／ｍＬ苄索氯铵溶液，搅拌，静置过夜后离心去上清．沉淀加入等体积的饱和氯化钠，混匀过夜，加入９５％食用乙醇以终浓度为６０％醇沉，离心继续加饱和氯化钠，此过程进行３次，最终沉淀水溶，过滤，１０ｋＤａ超滤脱盐．截留液浓缩后上样于ＦＰＡ９８（ＯＨ⁃）强阴离子交换柱，用Ｈ２Ｏ㊁０．３ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ㊁０．５ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ㊁０．８ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ依次进行洗脱，０．８ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ洗脱流份用１０ｋＤａ超滤脱盐，冻干，得酸性多糖组分ＡＦＧ．２．２㊀ＡＦＧ的β⁃消除解聚季铵盐转化：精密称取ＡＦＧ０．１００２ｇ，将其溶于３．５ｍＬ去离子水中，再精密称取苄索氯铵０．２６５８ｇ，溶于４．０ｍＬ去离子水中．将苄索氯铵溶液缓慢加入至ＡＦＧ溶液中，振荡混匀后静置１２ｈ，次日离心（４７００ｒ／ｍｉｎ，２０ｍｉｎ），弃上清液得沉淀．沉淀以３．０ｍＬ去离子水洗涤两次后以五氧化二磷为干燥剂，在４０ħ真空干燥箱中干燥至恒重，得ＡＦＧ季铵盐０．１８２２ｇ．羧基酯化：取１．５ｍＬＤＭＦ加入上述所得到的ＡＦＧ季铵盐中，使其溶解．再向其中加入６０μＬ氯化苄溶液，置于磁力搅拌器上，于３５ħ密闭反应２５ｈ，４６２中南民族大学学报（自然科学版）㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第３９卷待反应结束后降温至２５ħ．β⁃消除解聚：取０．５ｍＬ新配制的０．１６ｍｏｌ／Ｌ的乙醇钠乙醇溶液加入上述反应溶液中，反应３０ｍｉｎ．将溶液转移至离心管中，加入１．８２ｍＬ饱和氯化钠溶液，再加入１４．５６ｍＬ无水乙醇终浓度为８０％（ｖ／ｖ）醇沉．离心（４７００ｒ／ｍｉｎ，１０ｍｉｎ），沉淀继续交换２次，弃上清取沉淀．将上述沉淀用４．０ｍＬ去离子水溶解，加入６．０ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＯＨ溶液６７．８μＬ至其浓度为０．１ｍｏｌ／Ｌ，在室温下反应３０ｍｉｎ，用６．０ｍｏｌ／ＬＨＣｌ中和，Ｇ１０凝胶柱层析脱盐，冻干得解聚产物ｄＡＦＧ．２．３㊀ＡＦＧ和ｄＡＦＧ的理化性质分析２．３．１㊀紫外⁃可见分光光度法（ＵＶ⁃Ｖｉｓ）分别精密称取ＡＦＧ和ｄＡＦＧ１ｍｇ，配制成１ｍｇ／ｍＬ的水溶液，在１９０ ４００ｎｍ波长范围进行扫描．２．３．２㊀高效凝胶色谱法（ＨＰＧＰＣ）分别精密称取ＡＦＧ和ｄＡＦＧ１ｍｇ，配制成１ｍｇ／ｍＬ的水溶液，经０．４５μｍ微孔滤膜过滤后，进行ＨＰＧＰＣ分析，记录色谱图．色谱条件：ＳｈｏｄｅｘＯＨｐａｋＳＢ⁃８０４ＨＱ色谱柱；柱温，３５ħ；流动相为０．１ｍｏｌ／Ｌ氯化钠溶液；流速为０．５ｍＬ／ｍｉｎ；进样量为５０μＬ；检测器为示差检测器ＲＩＤ．２．３．３㊀分子量测定分别称取１０ｍｇＡＦＧ和肝素钠，采用ＳＥＣ⁃ＲＩ⁃ＭＡＬＬＳ联用技术测定ＡＦＧ的分子量及分子量分布，委托北京理化测试中心完成［６］．依次称取系列分子量右旋糖酐标准品，配制成浓度为１０ｍｇ／ｍＬ的０．１ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ溶液，０．４５μｍ滤膜过滤，进样量为２０μＬ，数据采用ＧＰＣ软件处理，绘制标准曲线，用标定分子量的ＡＦＧ进行校正，既得宽标校正曲线．可用于ｄＡＦＧ的分子量及其分布检测．２．３．４㊀易染性分析取ＡＦＧ和肝素钠各１ｍｇ，加水溶解为１ｍｇ／ｍＬ的溶液，各取１００μＬ的ＡＦＧ㊁肝素钠溶液和去离子水，加２ｍＬ１，９⁃二甲基亚甲蓝溶液［７］，涡旋混匀２ｍｉｎ，扫描１９０ ８００ｎｍ波长范围的紫外光谱（ＵＶ）．２．３．５㊀比旋光度分析依２０１５版‘中国药典“第四部通则部分所述检测旋光度的方法，将ＡＦＧ和ｄＡＦＧ样品均配成浓度为１ｍｇ／ｍＬ的溶液，测定方法：钠单色光源（λ５８９．３ｎｍ），在２０ħ下使用全自动数字旋光仪测定其旋光度，在同一条件下检测３次，取其平均值，得比旋光度．２．４㊀ＡＦＧ化学组成检测２．４．１㊀１⁃苯基⁃３⁃甲基⁃５⁃吡唑啉酮（ＰＭＰ）衍生化法分析单糖组成［８］完全酸水解：取ＡＦＧ约１ｍｇ，加水溶解至浓度为２ｍｇ／ｍＬ，取该溶液５００μＬ加入４ｍＬ具塞试管中，加入５００μＬ４ｍｏｌ／Ｌ的三氟乙酸溶液，充Ｎ２，封管，１１０ħ水解４ｈ，取出水解液，于７０ħ水浴锅中蒸干期间加入１ｍＬ甲醇以除去多余的三氟乙酸，共加３次甲醇，最后一次蒸干后，样品加入１００μＬ水溶解，作为供试品溶液．ＰＭＰ衍生化：供试品溶液中加入１００μＬ０．６ｍｏｌ／Ｌ的氢氧化钠溶液和２００μＬ０．５ｍｏｌ／Ｌ的ＰＭＰ甲醇溶液，涡旋混匀；７０ħ衍生化反应６０ｍｉｎ；反应结束后冷却至室温，加入２００μＬ０．３ｍｏｌ／Ｌ的盐酸溶液进行中和，用１ｍＬ三氯甲烷萃取３次，水相部分经０．２２μｍ微孔膜过滤供ＨＰＬＣ分析．另取单糖标准品（Ｇｌｃ㊁Ｇａｌ㊁ＧｌｃＮ．ＨＣｌ㊁ＧａｌＮ．ＨＣｌ㊁ＩｄｏＡ）适量，加１ｍＬ水溶解，作为对照溶液，进行ＰＭＰ衍生化反应．ＨＰＬＣ色谱条件：ＥｃｌｉｐｓｅＰｌｕｓＣ１８（４．６ｍｍˑ２５０ｍｍ，５μｍ，Ａｇｉｌｅｎｔ，ＵＳＡ）色谱柱；柱温：３０ħ；流动相：０．１ＭＰＢＳ（ｐＨ６．７）⁃乙腈（８３ʒ１７）；流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ；检测波长：２４５ｎｍ，进样量：２０μＬ．２．４．２㊀－ＯＳＯ－３／－ＣＯＯ－摩尔比及－ＯＳＯ－３含量测定参考文献［９］方法，取３．０ｍｇ／ｍＬＡＦＧ溶液２ｍＬ以Ｄｏｗｅｘ５０Ｗˑ８１００ ２００氢型阳离子交换柱层析获得氢型（Ｈ＋）ＡＦＧ溶液，用０．０２ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠滴定液滴定，记录电导率值变化，根据氢氧化钠的消耗量计算⁃ＯＳＯ－３／－ＣＯＯ－摩尔比及－ＳＯ－３含量．２．５㊀ＡＦＧ和ｄＡＦＧ的波谱分析２．５．１㊀红外光谱（ＩＲ）分析取ＡＦＧ及ｄＡＦＧ２ｍｇ经４０ħ真空干燥２４ｈ，利用ＫＢｒ压片法压片，傅立叶变换红外光谱仪Ｔｒａｃｅｒ⁃１００对ＡＦＧ样品进行４０００ ４００ｃｍ－１扫描，记录光谱图．２．５．２㊀核磁共振波谱（ＮＭＲ）分析分别取ＡＦＧ及ｄＡＦＧ约５ｍｇ，溶于０．５ｍＬＤ２Ｏ中，冷冻干燥，Ｄ２Ｏ交换３次后，将样品溶于０．５ｍＬＤ２Ｏ中，于２５ħ下使用ＢｒｕｋｅｒＡｄｖａｎｃｅ６００ＭＨｚ核磁共振波谱仪检测１Ｈ／１３ＣＮＭＲ谱图．３㊀结果与分析３．１㊀ＡＦＧ的提取与纯化采用酶解⁃碱解处理法提取白玉蜗牛粗多糖［５］，５６２第３期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀王玭，等：白玉蜗牛糖胺聚糖的分离纯化及结构表征继而以等电点法除蛋白质㊁过氧化氢处理脱色，继而以醇沉处理获得粗多糖．采用季铵盐沉淀法和阴离子交换柱层析法对所得粗多糖（图１ａ）进行进一步纯化，获得均一性的酸性粘多糖ＡＦＧ，其ＨＰＧＰＣ色谱图（图１ｂ）呈单一色谱峰，面积归一化法计算ＡＦＧ的纯度大于９９％．图１㊀白玉蜗牛粗多糖（ａ）㊁ＡＦＧ（ｂ）的ＨＰＬＣ图及ＡＦＧ的紫外吸收光谱（ｃ）Ｆｉｇ．１㊀ＨＰＧＰＣｐｒｏｆｉｌｅｓｏｆｃｒｕｄｅｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ（ａ），ＡＦＧ（ｂ），ａｎｄＵＶｓｐｅｃｔｒｕｍｏｆＡＦＧ（ｃ）㊀㊀ＡＦＧ的紫外吸收光谱（图１ｃ）显示，该糖胺聚糖仅具有２１０ｎｍ处的末端吸收，在２６０ｎｍ和２８０ｎｍ处无明显吸收峰，表明该ＡＦＧ中基本不含蛋白质和核酸类杂质．３．２㊀ＡＦＧ的β⁃消除解聚β⁃消除解聚法可选择性断裂连接于糖醛酸Ｃ⁃４位的糖苷键，并在产物的非还原端己糖醛酸中引入Δ４，５不饱和双键［１０］．该方法首先制备ＡＦＧ的羧基苄酯化产物，继而在乙醇钠乙醇溶液中进行β⁃消除解聚，反应产物经后处理得到解聚产物ｄＡＦＧ．ＨＰＧＰＣ（图２ａ）分析显示，ｄＡＦＧ的保留时间明显延迟，提示其分子量明显降低；紫外吸收光谱（图２ｂ）分析显示，ｄＡＦＧ在２３４ｎｍ处有最大紫外吸收，表明解聚产物非还原端Δ４，５⁃不饱和己糖醛酸的形成，该结果与β⁃消除解聚法的糖苷键选择性解聚特点相符．图２㊀ｄＡＦＧ的ＨＰＧＰＣ图（ａ）及紫外吸收光谱（ｂ）Ｆｉｇ．２㊀ＨＰＧＰＣｐｒｏｆｉｌｅｓ（ａ）ａｎｄＵＶｓｐｅｃｔｒｕｍ（ｂ）ｏｆｄＡＦＧ３．３㊀ＡＦＧ和ｄＡＦＧ分子量检测采用分子排阻色谱㊁示差检测器和多角度激光光散射仪联用技术（ＳＥＣ⁃ＲＩ⁃ＭＡＬＬＳ）可直接测定绝对重均分子量及分子量分布，ＡＦＧ的Ｍｗ（重均分子量）为２３．８４ｋＤａ，Ｍｎ（数均分子量）为２１．３３ｋＤａ，分散系数Ｍｗ／Ｍｎ为１．１１８．ＡＦＧ的分子量分布较窄，表明ＡＦＧ为均一性多糖．ＡＦＧ的Ｍｗ高于肝素钠而低于非洲大蜗牛来源ＧＡＧ［３］（表１）．采用ＧＰＣ软件，根据系列分子量的右旋糖酐标准品绘制标准曲线，使用已知分子量的ＡＦＧ进行宽标校正，计算ｄＡＦＧ的Ｍｗ约为２．００ｋＤａ．６６２中南民族大学学报（自然科学版）㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第３９卷表１㊀ＡＦＧ和ｄＡＦＧ的分子量及理化性质测定结果Ｔａｂ．１㊀ＭｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｒｅｓｕｌｔｓｏｆｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆＡＦＧａｎｄｄＡＦＧ样品分子量及分布Ｍｗ／（ｇ／ｍｏｌ）Ｍｎ／（ｇ／ｍｏｌ）Ｍｗ／Ｍｎ比旋光度－ＳＯ３／％ＡＦＧ２３８４０２１３３０１．１１８＋７５ʎ１４．５肝素钠１５０６０１４２２０１．０５９ｎ．ｄｎ．ｄｄＡＦＧ２００２１３１２１．５２６＋１７ʎｎ．ｄ㊀㊀注：ｎ．ｄ：未检测３．４㊀ＡＦＧ和ｄＡＦＧ的理化性质３．４．１㊀易染性分析酸性多糖可使１，９⁃二甲基亚甲蓝（ＤＭＭＢ）的最大吸收波长向低波长移动（蓝移现象），此即酸性多糖的易染性．由于中性多糖不能使ＤＭＭＢ的最大吸收波长蓝移［７］，因此，易染性特征可用于酸性多糖的鉴别．易染性分析结果（图３）显示，与肝素钠一致，ＡＦＧ可以使ＤＭＭＢ的最大吸收波长蓝移至５２０ｎｍ，显示其具有酸性多糖的性质．图３㊀ＡＦＧ及肝素的易染性分析紫外扫描光谱Ｆｉｇ．３㊀ＵＶｓｐｅｃｔｒｕｍｉｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆＡＦＧｍｅｔａｃｈｒｏｍａｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙ３．４．２㊀比旋光度ＡＦＧ的比旋光度为＋７５ʎ，为右旋光物质；ｄＡＦＧ的比旋光度为＋１７ʎ．文献报道［１１］小肠粘膜来源肝素的比旋光度为＋５３ʎ，非洲大蜗牛［３］来源的ＧＡＧ的比旋光度为＋４４ʎ．３．５㊀ＡＦＧ的化学组成分析３．５．１㊀单糖组成分析ＰＭＰ衍生化法分析ＡＦＧ单糖组成，结果（图４）表明，ＡＦＧ由氨基葡萄糖（ＧｌｃＮ）和艾杜糖醛酸（ＩｄｏＡ）组成，与非洲大蜗牛来源的ＧＡＧ相同［３］．ＡＦＧ的色谱图中ＩｄｏＡ信号较低，可能是由于糖醛酸在完全酸水解的条件下发生了糖环断裂，造成了破坏．３．５．２㊀－ＯＳＯ－３／－ＣＯＯ－摩尔比ＡＦＧ的电导率滴定曲线（图４ｃ）有两个拐点，符合典型糖胺聚糖具有－ＯＳＯ－３和－ＣＯＯ－官能团的特征．根据两个拐点对应的体积（Ｖ１和Ｖ２）计算ＡＦＧ的－ＯＳＯ－３／－ＣＯＯ－摩尔比约为１ʒ１，其－ＳＯ－３含量为１４．５％．图４㊀ＡＦＧ单糖组成分析的ＨＰＬＣ图（ａ，ｂ）及其电导率滴定图（ｃ）Ｆｉｇ．４㊀ＨＰＬＣｐｒｏｆｉｌｅｓｏｆＰＭＰｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓｏｆｍｉｘｅｄｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｔａｎｄａｒｄｓａｎｄＡＦＧ（ａ，ｂ）ａｎｄｉｔｓｃｏｎｄｕｃｔｉｍｅｔｒｉｃｔｉｔｒａｔｉｏｎｃｕｒｖｅ（ｃ）３．６㊀ＡＦＧ和ｄＡＦＧ的波谱分析３．６．１㊀红外光谱（ＩＲ）ＡＦＧ和ｄＡＦＧ的红外特征吸收峰基本一致（图５ａ，ｂ），以ＡＦＧ为例，主要有：３４２９ｃｍ－１强吸收为Ｏ⁃Ｈ的伸缩振动，说明有糖环醇羟基的存在；２９２８ｃｍ－１为糖环上亚甲基Ｃ⁃Ｈ的伸缩振动；１６４９ｃｍ－１为７６２第３期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀王玭，等：白玉蜗牛糖胺聚糖的分离纯化及结构表征Ｏ⁃Ｈ的弯曲振动；１２６１ｃｍ－１为硫酸酯基Ｓ＝Ｏ伸缩振动；１０００ １０２８ｃｍ－１为糖环上Ｃ⁃Ｏ⁃Ｃ伸缩振动；７８０８１０ｃｍ－１为吡喃环骨架的振动；１４１７．６８ｃｍ－１为艾杜糖醛酸羧基上的Ｃ⁃Ｏ伸缩振动．３．６．２㊀ＡＦＧ和ｄＡＦＧ的核磁共振波谱ＡＦＧ的１ＨＮＭＲ谱图如图５ｄ所示．与文献报道的非洲大蜗牛来源的ＧＡＧ的谱图比较［３］，２．０ｐｐｍ处的峰为ＧｌｃＮＡｃ的甲基信号（Ａ８），在４．９ ５．０ｐｐｍ应为两个糖环端基氢信号，其中４．９ｐｐｍ处为ＧｌｃＮＡｃ的端基氢（Ａ１），５．０ｐｐｍ处为ＩｄｏＡ２Ｓ的端基氢（Ｕ１），其积分比值提示ＩｄｏＡ２Ｓ与ＧｌｃＮＡｃ的摩尔比为１ʒ１．ｄＡＦＧ的１Ｈ和１３ＣＮＭＲ如图５ｅ㊁ｆ，与原型ＡＦＧ相比，在约５．９ｐｐｍ处新出现了一组信号峰，根据文献［３］归属为不饱和糖醛酸的４位Ｈ，说明在产物的非还原端形成了不饱和糖醛酸（图５ｃ），５．４ｐｐｍ处为不饱和糖醛酸的１位Ｈ，４．９ ５．２ｐｐｍ范围内为其他糖环上的１位氢，位于高场的１．９ｐｐｍ左右为ＧｌｃＮＡｃ的甲基氢的信号，而在３．５ ４．０ｐｐｍ之间的为糖环上其他质子信号峰．根据文献资料［１２］，对碳信号进行了初步归属，２５ｐｐｍ为ＧｌｃＮＡｃ甲基碳信号，在９０ １０５ｐｐｍ范围内为各个糖环上的端基碳信号，不饱和糖醛酸（ΔＵ）的Ｃ１峰出现在约９９．４ｐｐｍ，Ｃ４的化学位移约为１０８．６ｐｐｍ，Ｃ５的化学位移约为１４７．１ｐｐｍ，１７６１８０ｐｐｍ处为糖醛酸上的羧基碳和ＧｌｃＮＡｃ的羰基碳信号．其位于非末端的单糖的１Ｈ／１３ＣＮＭＲ信号与原型ＡＦＧ信号特征基本一致，即除了非还原性端的结构变化之外，β⁃消除解聚过程中，ＡＦＧ的其他结构可基本保持稳定．图５㊀ＡＦＧ及ｄＡＦＧ的ＩＲ（ａ，ｂ），１ＨＮＭＲ（ｄ，ｅ）谱图和ｄＡＦＧ的１３ＣＮＭＲ（ｆ）谱图及化学结构（ｃ）Ｆｉｇ．５㊀ＩＲ（ａ，ｂ），１Ｈ／１３ＣＮＭＲｓｐｅｃｔｒａｏｆＡＦＧ（ｄ，ｅ）ａｎｄｄＡＦＧ（ｆ）＆ｃｈｅｍｉｃａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｄＡＦＧ（ｃ）４㊀结语从白玉蜗牛中分离纯化了均一的酸性多糖ＡＦＧ，得率为０．８８％，其Ｍｗ为２３．８４ｋＤａ，通过理化分析及波谱检测可以判断，ＡＦＧ是由等摩尔的氨基葡萄糖ＧｌｃＮＡｃ和２位硫酸酯基取代的艾杜糖醛酸（ＩｄｏＡ２Ｓ）通过α（１ң４）糖苷键交替连接而成，与非洲大蜗牛来源ＧＡＧ结构基本一致．与哺乳动物来源的肝素和硫酸乙酰肝素相比，ＡＦＧ的结构相对规则．糖苷键选择性的β⁃消除解聚法解聚显示，除糖苷键裂解外，其他基本结构稳定，其确切结构可进一步通过纯化寡糖确证，即利用ｂｏｔｔｏｍ⁃ｕｐ策略研究ＡＦＧ的确切结构．在药理学活性研究方面，与肝素对比，ＡＦＧ不存在特异性结合ＡＴ的五糖序列，故在高浓度下不具有抗凝活性［４，５］．Ｈｅ等［１３］报道非洲大蜗牛和黄蛞蝓来源的ＧＡＧ均具有较强的乙酰肝素酶抑制活性（ＩＣ５０，０．２５μｍｏｌ／Ｌ）．乙酰肝素酶是内源性的β⁃Ｄ⁃葡萄糖８６２中南民族大学学报（自然科学版）㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第３９卷醛酸内切酶，在体内能够降解硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的侧链硫酸乙酰肝素，与多种生理病理过程紧密相关，包括组织修复㊁炎症反应㊁肿瘤生长和转移以及血管生成等［１４］．白玉蜗牛来源的ＡＦＧ具有与其相似的化学结构，可进一步采用ＨＴＲＦ法［１３］系统分析ＡＦＧ对乙酰肝素酶抑制作用，并探讨抑制乙酰肝素酶的构效关系．参㊀考㊀文㊀献［１］㊀ＣＡＳＵＢ，ＮＡＧＧＩＡ，ＴＯＲＲＩＧ．Ｒｅ⁃ｖｉｓｉｔｉｎｇｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｈｅｐａｒｉｎ［Ｊ］．ＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅＲｅｓｅａｒｃｈ，２０１５，４０３（７）：６０⁃６８．［２］㊀ＭＵＬＬＯＹＢ，ＨＯＧＷＯＯＤＪ，ＧＲＡＹＥ，ｅｔａｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙｏｆｈｅｐａｒｉｎａｎｄｒｅｌａｔｅｄｄｒｕｇｓ［Ｊ］．ＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓ，２０１６，６８（１）：７６⁃１４１．［３］㊀ＫＩＭＹＳ，ＪＯＹＹ，ＣＨＡＮＧＩＭ，ｅｔａｌ．ＡｎｅｗｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎｆｒｏｍｔｈｅｇｉａｎｔＡｆｒｉｃａｎｓｎａｉｌＡｃｈａｔｉｎａｆｕｌｉｃａ［Ｊ］．ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９６，２７１（２０）：１１７５０⁃１１７５５．［４］㊀ＳＨＩＭＪＹ，ＬＥＥＹＳ，ＪＵＮＧＳＨ，ｅｔａｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆａｎｅｗｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ，ａｃｈａｒａｎｓｕｌｆａｔｅｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅｇｉａｎｔＡｆｒｉｃａｎｓｎａｉｌＡｃｈａｔｉｎａｆｕｌｉｃａ［Ｊ］．ＡｒｃｈｉｖｅｓｏｆＰｈａｒｍａｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ，２００２，２５（６）：８８９⁃８９４．［５］㊀ＬＩＵＪ，ＺＨＯＵＬ，ＨＥＺ，ｅｔａｌ．ＳｔｒｕｃｔｕｒａｌａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｂｉｏｌｏｇｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｙｏｆａｈｉｇｈｌｙｒｅｇｕｌａｒｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎｆｒｏｍＡｃｈａｔｉｎａｆｕｌｉｃａ［Ｊ］．ＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅＰｏｌｙｍｅｒｓ，２０１８，１８１（２）：４３３⁃４４１．［６］㊀ＫＮＯＢＬＯＣＨＪＥ，ＳＨＡＫＬＥＥＰＮ．Ａｂｓｏｌｕｔｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｌｏｗ⁃ｍｏｌｅｃｕｌａｒ⁃ｗｅｉｇｈｔｈｅｐａｒｉｎｓｂｙｓｉｚｅ⁃ｅｘｃｌｕｓｉｏｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｗｉｔｈｍｕｌｔｉａｎｇｌｅｌａｓｅｒｌｉｇｈｔｓｃａｔｔｅｒｉｎｇｄｅｔｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］．ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９７，２４５（２）：２３１⁃２４１．［７］㊀ＦＡＲＭＤＡＬＥＲＷ，ＢＵＴＴＬＥＤＪ，ＢＡＲＲＥＴＴＡＪ．Ｉｍｐｒｏｖｅｄｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎａｎｄｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｓｕｌｐｈａｔｅｄｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎｓｂｙｕｓｅｏｆｄｉｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈｙｌｅｎｅｂｌｕｅ［Ｊ］．ＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ，１９８６，８８３（２）：１７３⁃１７７．［８］㊀邓旭坤，江善青，穆俊，等．山楂多糖的成分测定及其单糖组分分析研究［Ｊ］．中南民族大学学报（自然科学版），２０１７（３）：５２⁃５６．［９］㊀刘禄娟，王伟，张天民．低分子肝素硫酸根离子与羧酸根离子摩尔比的测定［Ｊ］．中国生化药物杂志，１９９８，１９（５）：３３０⁃３３１．［１０］㊀ＧＡＯＮ，ＬＵＦ，ＸＩＡＯＣ，ｅｔａｌ．β⁃Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｖｅｄｅｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎｓｕｌｆａｔｅａｎｄａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｒｅｓｕｌｔｉｎｇｆｒａｇｍｅｎｔｓ［Ｊ］．ＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅＰｏｌｙｍｅｒｓ，２０１５，１２７（４）：４２７⁃４３７．［１１］㊀ＧＲＩＦＦＩＮＣＣ，ＬＩＮＨＡＲＤＴＲＪ，ＧＯＲＰＣＬＶ，ｅｔａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｈｅｐａｒａｎｓｕｌｆａｔｅｆｒｏｍｃｒｕｄｅｐｏｒｃｉｎｅｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｍｕｃｏｓａｌｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎｈｅｐａｒｉｎ［Ｊ］．ＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅＲｅｓｅａｒｃｈ，１９９５，２７６（４）：１８３⁃１９７．［１２］㊀ＫＩＭＹＳ，ＡＬＭＭＹ，ＷＵＳＪ，ｅｔａｌ．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｐｒｅｐａｒｅｄｆｒｏｍａｃｈａｒａｎｓｕｌｆａｔｅ［Ｊ］．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９８，８（９）：８６９⁃８７７．［１３］㊀ＨＥＺ，ＺＨＯＵＬ，ＬＩＮＬ，ｅｔａｌ．ＳｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｈｅｐａｒａｎａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙａｃｔｉｖｉｔｙｏｆａｎｅｗｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎｆｒｏｍｔｈｅｓｌｕｇＬｉｍａｃｕｓｆｌａｖｕｓ［Ｊ］．ＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅＰｏｌｙｍｅｒｓ，２０１９，２２０（５）：１７６–１８４．［１４］㊀ＬＯＺＺＯＲＶ，ＡＮＴＯＮＩＯＪＤＳ．Ｈｅｐａｒａｎｓｕｌｆａｔｅｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ：ｈｅａｖｙｈｉｔｔｅｒｓｉｎｔｈｅａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓａｒｅｎａ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，２００１，１０８（３）：３４９⁃３５５．（责任编辑㊀姚春娜）９６２第３期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀王玭，等：白玉蜗牛糖胺聚糖的分离纯化及结构表征。

动物源细胞外基质中糖胺聚糖物质的检测方法糖胺聚糖（GAGs）是一类重要的多糖物质，广泛存在于动物体内和外部环境中。

在动物细胞外基质中，GAGs是一种重要的结构组分，可以影响细胞的生长、分化、迁移和信号传导等过程。

因此，对GAGs 的检测和分析具有重要的生物学和医学意义。

本文将介绍几种常用的动物源细胞外基质中GAGs的检测方法。

1. 瑞士蓝染色法瑞士蓝染色法是一种常用的GAGs检测方法。

该方法基于GAGs与瑞士蓝染料的亲和性，通过染色反应将GAGs与瑞士蓝染料结合，从而实现GAGs的检测。

该方法简单、快速、经济，适用于大量样品的检测。

但是该方法对GAGs的种类和含量有一定的限制，不能精确地定量。

2. 光学显微镜法光学显微镜法是一种直接观察GAGs的检测方法。

该方法基于GAGs的特殊结构和染色性质，在显微镜下直接观察样品中的GAGs。

该方法简单易行，不需要特殊的设备和试剂，但是对样品的处理和观察有一定的要求，不能精确定量。

3. 酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法是一种高灵敏度、高特异性的GAGs检测方法。

该方法基于特异性抗体与GAGs的结合反应，通过酶标记和底物反应产生荧光或发色反应，从而实现GAGs的定量检测。

该方法可以检测不同种类和含量的GAGs，具有高灵敏度和高特异性，适用于研究GAGs的生物学和医学功能。

4. 毛细管电泳法毛细管电泳法是一种高效分离和定量GAGs的方法。

该方法基于GAGs的电荷和分子大小差异，在毛细管中通过电场分离不同种类和含量的GAGs，并通过检测器定量检测。

该方法具有高效、高分辨率和高灵敏度，可以定量检测不同种类和含量的GAGs，适用于GAGs的定量和分析。

综上所述，瑞士蓝染色法、光学显微镜法、酶联免疫吸附法和毛细管电泳法是常用的动物源细胞外基质中GAGs的检测方法。

不同的方法具有不同的优缺点，选择适合的方法可以提高检测的精度和效率，促进GAGs的研究和应用。