糖胺聚糖的分析测定方法
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硫酸化糖胺聚糖的简易分光光度测定法页数:4
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氨基聚糖与蛋白聚糖页数:15
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海洋动物糖胺聚糖的研究进展页数:8
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糖胺聚糖的提取方法
糖胺聚糖的提取方法
糖胺聚糖是细胞壁结构中最重要的基本成分，它们可以充当胞内
信号介质，从而在细胞代谢和细胞功能之间起着重要作用。
糖胺聚糖
提取主要分为酶水解法、溶剂提取法以及大肠杆菌法三种。
酶水解法是最常用的提取方法。
该方法利用糖醛酶即β-葡萄糖醛酶，将细胞壁中的糖胺聚糖水解为低聚糖，然后通过适当的净化步骤
来分离出糖胺聚糖，从而实现糖胺聚糖的提取。
优点是反应条件温和，容易操作；缺点是效率较低，易受到外界条件的影响，糖胺聚糖的提
取量也较小。
溶剂提取法是利用有机溶剂提取细胞壁的特性，将其有机溶剂添
加到所需的细胞壁中，并利用溶剂把聚糖结合在一起，把其从细胞壁
中解离出来，实现糖胺聚糖的提取。
优点是操作简便，效率高；缺点
是有机溶剂的毒性和污染问题，甲醇和乙醚等溶剂的使用有可能导致
生态破坏。
大肠杆菌法是根据细胞壁膜糖胺聚糖与大肠杆菌膜糖蛋白的亲和力，以及大肠杆菌膜糖蛋白的被动转移性质，将细胞壁中的糖胺聚糖
转移到大肠杆菌膜糖蛋白表面，并通过反哺技术，将糖胺聚糖从膜糖
蛋白中抽取出来，从而实现糖胺聚糖的提取。
优点是操作简单，抗菌
能力强；缺点是抽取率不够高，容易受污染。
总之，目前有三种方法可以提取糖胺聚糖，它们都具有自己的优
缺点，因此，在实际使用中应根据具体情况充分考虑，以期更好地实
现所需的提取效果。
硫酸软骨素药效成分糖胺聚糖含量分析研究
硫酸软骨素药效成分糖胺聚糖含量分析研究薛洪宝;梁丽丽;常华兰;田天;顾文杰;刘志祥;宫文武【期刊名称】《宁夏师范学院学报》【年(卷),期】2018(039)010【摘要】为探索硫酸软骨素成品制剂药效成分糖胺聚糖含量的分析检测方法,采用强阴离子交换硅胶填充柱高效液相色谱法对硫酸软骨素水解产物酸性黏多糖类物质含量进行分析检测.结果表明,该方法能对硫酸软骨素生产进行过程控制,且操作简捷易行,可靠性高,能为酸性黏多糖类物质的生产及研发提供有效的技术信息.【总页数】9页(P62-70)【作者】薛洪宝;梁丽丽;常华兰;田天;顾文杰;刘志祥;宫文武【作者单位】蚌埠医学院公共基础学院,安徽蚌埠233030;安徽宏业药业有限公司生产技术部,安徽蚌埠233045;蚌埠医学院公共基础学院,安徽蚌埠233030;蚌埠医学院公共基础学院,安徽蚌埠233030;蚌埠医学院公共基础学院,安徽蚌埠233030;蚌埠医学院公共基础学院,安徽蚌埠233030;安徽宏业药业有限公司生产技术部,安徽蚌埠233045;安徽省蚌埠市食品药品监督管理局药化生产科,安徽蚌埠233000【正文语种】中文【中图分类】TQ464【相关文献】1.高效液相色谱法测定复方盐酸氨基葡糖硫酸软骨素片中硫酸软骨素的含量 [J], 邢怀阳;赵仁;沈蔡月;吕凌2.糖胺聚糖的荧光标记及其与硫酸软骨素抗体的相互作用 [J], 韩章润;王玉峰;刘鑫;吴建东;曹欢;赵峡;柴文刚;于广利3.含玻璃酸钠的复方硫酸软骨素滴眼液中硫酸软骨素的含量测定 [J], 万秀玉;姜雯;潘继飞;张天民4.蛋白聚糖NG2中硫酸软骨素糖胺聚糖链调节稳定转染NG2的U251细胞迁移能力 [J], 刘钧松;霍锐;威廉·B·斯道卡普;池元斌;房学迅5.鲐鱼软骨糖胺聚糖的硫酸软骨素的结构及其与生长因子的相互作用 [J], 周跃钢因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
糖胺聚糖代谢
糖胺聚糖代谢一、糖胺聚糖简介糖胺聚糖（Glycosaminoglycan，GAG）是一类天然存在的线性多糖，由重复的二糖单位构成，是构成细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的主要成分之一。
糖胺聚糖由己糖胺和糖醛酸组成，常见的糖胺聚糖包括透明质酸（hyaluronic acid）、硫酸软骨素（chondroitin sulfate）、硫酸角质素（keratan sulfate）等。
二、糖胺聚糖代谢过程1.合成途径：糖胺聚糖的合成在细胞内进行，需要一系列酶的参与。
合成过程中涉及到的基本物质包括单糖、二糖和多糖。
合成步骤包括单糖的活化、单糖之间的连接以及多糖链的延伸和修饰。
其中，糖胺聚糖的单糖单位通常在核苷二磷酸激酶的催化下，由特定的核苷二磷酸供体合成。
2.修饰过程：在合成过程中，糖胺聚糖需要进行一系列的修饰，包括硫酸化、乙酰化、磷酸化等。
这些修饰可以影响糖胺聚糖的物理性质和生物活性，从而调节其在生物体内的功能。
3.分解途径：糖胺聚糖在生物体内可以被分解为更小的分子，如单糖和二糖。
这个过程主要发生在细胞内，需要特定的酶进行催化。
分解后的产物可以进一步被细胞利用或排出体外。
三、糖胺聚糖代谢与疾病1.癌症：研究表明，一些肿瘤细胞能够异常表达糖胺聚糖，这可能与其恶性转化和转移有关。
同时，异常的糖胺聚糖代谢也可能影响肿瘤细胞的免疫识别和抗肿瘤免疫反应。
例如，一些肿瘤细胞可以过度表达透明质酸酶等酶类，促进透明质酸的分解代谢，从而影响肿瘤的生长和扩散。
此外，异常的糖胺聚糖代谢还可能影响肿瘤细胞的粘附、迁移和扩散等行为。
因此，研究糖胺聚糖代谢与肿瘤的关系可以为肿瘤的诊断和治疗提供新的思路和方法。
2.炎症性疾病：炎症过程中，异常的糖胺聚糖代谢可能导致组织损伤和疾病进展。
例如，一些慢性炎症性疾病可能与过量表达或异常修饰的糖胺聚糖有关。
此外，异常的糖胺聚糖代谢还可能影响炎症细胞的迁移、活化和功能，从而影响炎症的发展和消退。
糖胺聚糖研究新进展
样品经硫酸软骨素酶abc和ac处理chs链降解为不饱和双糖ce分析证明不同样品chs的结构特征可能明显不同提示不同品种或组织来源可能影响治疗效果37chs能够治疗oa的原因可能是其可促进关节软骨组织中蛋白聚糖pg和胶原的合成能够减少白介素1诱导的基质金属蛋白酶的合成使诱导型氧化氮合酶inos和环加氧酶2cox2食品与药品fooddrug2008年第10卷第09期的mrna水平降低38维持软骨细胞外基质的稳定间接地起到消除炎症和缓解疼痛39的作用
Ｒｅ ｅ ｔＡｄｖ ｎｃ ｓｉ ｙ ｏ ａ ｉ ｏ ｌ ｃ ｎ ｃ ｎ ａ ｅ ｎ Ｇｌ ｃ ｓ ｍ ｎ ｇ ｙ ａ
ＺＨＡ ＮＧ ａ ｍｉ ＬＩ Ｇ ｅ ． ｕ Ｔｉｎ． ｎ 。 Ｎ Ｐ ｉｘ ｅ
（． ｃ ｏ ｌｆＰ ａ ｍ ｃ ， ｈ ｎ ｏ ｇＵ ｉ ｒｉ ， ｉａ ５ ０ ２ Ｃ ｉ ； ． ｈ ｎ ｏ ｇ ｃ ｄ ｍ ｈ ｒ ａ ｅ ｔ ａ １ Ｓｈ ｏ ｈ ｒ ａ ｙ Ｓ ａ ｄ ｎ ｎｖ ｓｙ Ｊｎ ｎ２ ０ １ ， ｈｎ ２ Ｓ ａ ｄ ｎ ａ ｅ ｙｏ ａ ｍ ｃｎｉ ｌ ｏ ｅ ｔ ａ Ａ ｆＰ ｃ
摘 要 ：透 明质 酸 、肝 素和 硫 酸软 骨 素是 重要 的 糖胺 聚 糖 ， 有许 多潜 在 的药 用价 值 。 本文 综述 了这三 种多 糖 及其
衍 生 物 的研 究 新 进 展 。
关 键 词 ：透 明 质 酸 ；肝 素 ；硫酸 软 骨 素 ；衍 生 物 ；糖 胺 聚 糖 ；研 究 进 展 中图分 类号 ：Ｑ５ ８ ３ 文献标 识码 ：Ａ 文章编号 ：１ ７ — ７ ｘ（０ ８０ — ０ １０ ６ ２９ ９ ２ ０ ）９ ０ ０ —５
ＨＡ 在恶性 瘤 生长 和转 移 中的作 用为 ：（ ）增强 肿 法 ， １ 研制 了ＨＡ 紫杉醇接合物 。紫杉醇与 Ｈ － Ａ接合后 ， 瘤细胞 的活动性 和侵 袭 能力１ ；（ ）促进新 生 毛细 水溶性 和稳 定性 改善 ，具 有靶 向性和 控释作 用 ，对 ５ １ ２ 血 管 的形成 Ｉ ３ ；（ ）协 助肿 瘤细 胞逃 避免疫 监 视 ； ＨＡ受体过表达的肿瘤细胞具有显著的细胞 毒作用 ｌＩ ｌ。 ４
Ｒｅ ｅ ｔＡｄｖ ｎｃ ｓｉ ｙ ｏ ａ ｉ ｏ ｌ ｃ ｎ ｃ ｎ ａ ｅ ｎ Ｇｌ ｃ ｓ ｍ ｎ ｇ ｙ ａ
ＺＨＡ ＮＧ ａ ｍｉ ＬＩ Ｇ ｅ ． ｕ Ｔｉｎ． ｎ 。 Ｎ Ｐ ｉｘ ｅ
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摘 要 ：透 明质 酸 、肝 素和 硫 酸软 骨 素是 重要 的 糖胺 聚 糖 ， 有许 多潜 在 的药 用价 值 。 本文 综述 了这三 种多 糖 及其
衍 生 物 的研 究 新 进 展 。
关 键 词 ：透 明 质 酸 ；肝 素 ；硫酸 软 骨 素 ；衍 生 物 ；糖 胺 聚 糖 ；研 究 进 展 中图分 类号 ：Ｑ５ ８ ３ 文献标 识码 ：Ａ 文章编号 ：１ ７ — ７ ｘ（０ ８０ — ０ １０ ６ ２９ ９ ２ ０ ）９ ０ ０ —５
ＨＡ 在恶性 瘤 生长 和转 移 中的作 用为 ：（ ）增强 肿 法 ， １ 研制 了ＨＡ 紫杉醇接合物 。紫杉醇与 Ｈ － Ａ接合后 ， 瘤细胞 的活动性 和侵 袭 能力１ ；（ ）促进新 生 毛细 水溶性 和稳 定性 改善 ，具 有靶 向性和 控释作 用 ，对 ５ １ ２ 血 管 的形成 Ｉ ３ ；（ ）协 助肿 瘤细 胞逃 避免疫 监 视 ； ＨＡ受体过表达的肿瘤细胞具有显著的细胞 毒作用 ｌＩ ｌ。 ４
第二讲糖分析方法
第二讲糖的分析方法一、中性糖的测定1．还原糖的次亚碘酸盐定量法适用：各种醛糖；适用于测定淀粉酶解时糖苷键水解的百分率，也可测定淀粉酶产物的寡聚糖链长。
基本反应：CH2OH(CHOH)n CHO+I2+3NaOH→CH2OH(CHOH)nCOONa+2NaI+2H2O (氧化)I2+2Na2S2O3→Na2S4O6+ NaI (滴定) 2．3,5-二硝基水杨酸（DNS）比色法原理：在碱性溶液中，3,5-二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原成棕红色氨基化合物，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。
注意：该法不是化学计量反应，戊糖、已糖和双糖与DNS反应的生色度A500/μmol糖的值分别是：戊糖（木糖、阿拉伯糖）：0.42；已糖（葡萄糖、半乳糖、甘露糖）：0.46；双糖（麦芽糖、乳糖）：0.65。
有人认为还原糖的醛基被氧化为羧基，但当量不准确，不同的糖类产生不等等量的色度，表明它的化学反应是较复杂的。
3．Somogyi-Nelson法还原糖将铜试剂还原成氧化亚铜，在浓硫酸存在下与砷钼酸生成蓝色溶液，在560nm下的光密度与还原糖浓度呈比例关系。
注意：比方法重复性较好，产物稳定，测定范围10-180μg/mL。
4．苯酚-硫酸法苯酚-硫酸试剂可与游离的或寡糖、多糖中的已糖、糖醛酸（或甲苯衍生物）起显色反应，已糖在490nm处，戊糖及糖醛酸在480nm处有最大吸收，吸收值与糖含量呈线性关系。
注意：（1）该法颜色持久，较稳定；（2）每种糖的显色值不同，故不宜直接用于杂多糖的定量测定；分析杂多糖时，可根据各种单糖的组成比及主要组分单糖的标准曲线的校正系数加以校正计算。
（3）有颜色的样品，测定值偏高；（4）此法较适于检测凝胶柱部分收集样品中相对糖量的分析。
5．蒽酮-硫酸法糖类遇浓硫酸脱水生成糠醛或其衍生物，可与蒽酮试剂缩合产生颜色物质，反应后溶液呈蓝绿色，于620nm处有最大吸收，显色与多糖含量呈线性关系。
动物源细胞外基质中糖胺聚糖物质的检测方法
动物源细胞外基质中糖胺聚糖物质的检测方法糖胺聚糖（GAGs）是一类多糖物质，广泛存在于动物组织的细胞外基质中。
它们在维持细胞外基质结构和功能、参与细胞信号传导、细胞增殖和分化等生物学过程中起着重要作用。
在许多疾病中，GAGs 的合成、代谢和降解出现异常，因此对GAGs的检测具有重要的临床和生物学意义。
本文将介绍动物源细胞外基质中GAGs物质的检测方法。
1. 琼脂糖凝胶电泳法琼脂糖凝胶电泳法是一种常用的GAGs分离和定量方法。
该方法基于GAGs的不同电荷密度和分子大小，在琼脂糖凝胶中进行电泳分离。
首先将细胞外基质样品经过酸水解或酶解处理，将GAGs水解成单糖和糖酸，然后通过琼脂糖凝胶电泳将其分离。
根据GAGs在琼脂糖凝胶中的迁移距离和标准品的比较，可定量测定样品中GAGs的含量。
该方法简单易行，但需要对样品进行水解处理，同时对不同类型的GAGs分离效果有所不同。
2. 高效液相色谱法高效液相色谱法（HPLC）是一种高分辨率、高灵敏度的分离和定量方法。
该方法基于GAGs的不同结构和化学性质，在反相或离子交换柱上进行分离。
首先将细胞外基质样品经过酸水解或酶解处理，然后通过HPLC将其分离，根据峰面积或峰高度定量测定样品中GAGs的含量。
该方法分离效果好，灵敏度高，但需要对样品进行水解处理，同时需要使用昂贵的仪器和试剂。
3. 酶联免疫吸附测定法酶联免疫吸附测定法（ELISA）是一种高灵敏度、高特异性的GAGs 检测方法。
该方法基于GAGs与特定抗体的结合，在酶标板上进行检测。
首先将细胞外基质样品或GAGs标准品加入到抗体涂层的酶标板中，然后加入特定的检测抗体，再加入酶标记的二抗，最后通过底物反应检测信号。
根据标准品的反应曲线和样品的光密度值，可定量测定样品中GAGs的含量。
该方法灵敏度高，特异性好，但需要使用昂贵的试剂和仪器。
4. 质谱法质谱法是一种高分辨率、高灵敏度的GAGs检测方法。
该方法基于GAGs的质量和分子结构，在质谱仪上进行分析。
HPLC分析来自糖胺聚糖的不饱和二糖
７ ２
食 品与 药 品
Ｆ ｏ ｎ ｒ ｇ ｏ ｄａ ｄＤ ｕ
２ １ 年第 １ 卷第 ０ 期 ０２ ４ １
・
知识介绍 ・
ＨＰ Ｃ分 析 来 自糖 胺 聚糖 的不 饱 和 二糖 Ｌ
Ｋｅ ｃ ｉ ｏｈｄ ，Ｓ ｔｓｉ ｙｕ ｈ，Ｈ ｒｓｉ ｉ ｃｉ ｉ ｈ ｓｉ ｉ Ｙ ａ ａ ｈ Ｍｉａｃ ｉ ｉ ｈ Ｋｋ ｈ，等 ｏ ｏ ｕ
骨 ）、硫 酸皮 肤素 （ 猪皮 ）、硫酸 乙酰肝 素 （ 肾 ） （ 牛 日
糖。
本 生 化 学 工 业 ） 。 硫 酸 软 骨 素 Ｄ （ 鱼 鱼 翅 ） 、 硫 酸 软 ２ 结 果 鲨
食 品与药 品
２１ 二 糖 对 照 品 的 ＨＰ Ｃ分析 ． Ｌ
Ｆ ｏ ｎ ｒ ｇ ｏ ｄａ ｄＤ ｕ
△Ｄｉ ＨＳ一 Ｓ。
时间并通 过分离 不充分 的二糖变 动 比率 鉴别和确 认各个色
谱峰 。 对 于 硫 酸 软 骨 素 类 化 合 物 和 硫 酸 乙酰 肝 素 类 化 合 物 ，
二糖依据硫 酸基 的量 以非硫酸化 二糖 、单硫酸化 二糖 、二 硫 酸化二糖 、三硫酸 化二糖的顺序依次洗脱 ，见图２ 。非硫
酶 解 自透 明质 酸 、 硫 酸 软 骨 素 和 硫 酸 皮 肤 素 的９ 不 ｍＵ乙酰 肝 素 酶 Ｉ Ｉ １０ｍＵ肝 素 酶 一 起 酶 解 ２ｈ 加 热 至 沸 个 ／ ￣２ Ｉ 。 饱和 二糖对 照 品 （ 日本 生 化 学 工 业 ） ， 酶 解 自硫 酸 乙 酰 肝 腾 ３ ，终 止 酶 解 反应 。 ０ Ｓ
到 △Ｄｉ ．Ｓ ＡＤ ＨＳＮＳ ＡＤｉ ．Ｓ ＡＤｉ —ｉ １ ＨＳ０ 、 ｉ — 、 ＨＳ６ 、 ＨＳｄＳ 、
使 用程序 泵完 成超 过６ ｎ ０ｍｉ 的磷酸 二氢 钠 （ ６ ０ １ ￣８ ０
食 品与 药 品
Ｆ ｏ ｎ ｒ ｇ ｏ ｄａ ｄＤ ｕ
２ １ 年第 １ 卷第 ０ 期 ０２ ４ １
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知识介绍 ・
ＨＰ Ｃ分 析 来 自糖 胺 聚糖 的不 饱 和 二糖 Ｌ
Ｋｅ ｃ ｉ ｏｈｄ ，Ｓ ｔｓｉ ｙｕ ｈ，Ｈ ｒｓｉ ｉ ｃｉ ｉ ｈ ｓｉ ｉ Ｙ ａ ａ ｈ Ｍｉａｃ ｉ ｉ ｈ Ｋｋ ｈ，等 ｏ ｏ ｕ
骨 ）、硫 酸皮 肤素 （ 猪皮 ）、硫酸 乙酰肝 素 （ 肾 ） （ 牛 日
糖。
本 生 化 学 工 业 ） 。 硫 酸 软 骨 素 Ｄ （ 鱼 鱼 翅 ） 、 硫 酸 软 ２ 结 果 鲨
食 品与药 品
２１ 二 糖 对 照 品 的 ＨＰ Ｃ分析 ． Ｌ
Ｆ ｏ ｎ ｒ ｇ ｏ ｄａ ｄＤ ｕ
△Ｄｉ ＨＳ一 Ｓ。
时间并通 过分离 不充分 的二糖变 动 比率 鉴别和确 认各个色
谱峰 。 对 于 硫 酸 软 骨 素 类 化 合 物 和 硫 酸 乙酰 肝 素 类 化 合 物 ，
二糖依据硫 酸基 的量 以非硫酸化 二糖 、单硫酸化 二糖 、二 硫 酸化二糖 、三硫酸 化二糖的顺序依次洗脱 ，见图２ 。非硫
酶 解 自透 明质 酸 、 硫 酸 软 骨 素 和 硫 酸 皮 肤 素 的９ 不 ｍＵ乙酰 肝 素 酶 Ｉ Ｉ １０ｍＵ肝 素 酶 一 起 酶 解 ２ｈ 加 热 至 沸 个 ／ ￣２ Ｉ 。 饱和 二糖对 照 品 （ 日本 生 化 学 工 业 ） ， 酶 解 自硫 酸 乙 酰 肝 腾 ３ ，终 止 酶 解 反应 。 ０ Ｓ
到 △Ｄｉ ．Ｓ ＡＤ ＨＳＮＳ ＡＤｉ ．Ｓ ＡＤｉ —ｉ １ ＨＳ０ 、 ｉ — 、 ＨＳ６ 、 ＨＳｄＳ 、
使 用程序 泵完 成超 过６ ｎ ０ｍｉ 的磷酸 二氢 钠 （ ６ ０ １ ￣８ ０
大鼠肾脏糖胺聚糖的种类及二糖组成分析
ＮＡｃ Ｓ（ Ｓ） ＡＵＡ２ － ｌ ６ ６ ， Ｓ Ｇａ ＮＡｃ Ｓ（ ４ ， △ＵＡ２ － ｌ ４ ２ Ｓ） Ｓ Ｇａ ＮＡｃ Ｓ ６
（２ Ｓ）， ＡＵＡ－ ｌ ６ ＧａＮＡｃ Ｓ Ｓ （４ Ｓ） △ＵＡ２ － ｌ ４ ６ ６ ， Ｓ ＧａＮＡｃ Ｓ Ｓ ４６
（４ Ｓ ；硫酸乙酰 肝素 类不 饱 和二 糖 标准 品 ：Ａ ２ － ｌ— ２６） ＵＡ ＳＧ ｃ
ＮＡ ６ （ Ａ） △ ｃＳ Ⅱ一 ， ＵＡ２ ＳＧｌ Ａｃ １一 ，均 由英 国 Ｉｕｏ ｃ Ｎ （１ Ａ） ／ ｄ ｒｎ公
司； 软骨素酶 Ａ Ｃ Ｃ ｏ ｄｏｔ ａｅ Ｂ ） 肝素酶 Ｉ（ ｐｒ Ｂ （ ｈ ｎ ｒｉｎｓ Ｃ ， ｉ Ａ Ｈｅａｉ —
ｎｓ ， 素酶 １（ ｐ ｒ ａｅＩ） 均 为 美 国 Ｓｇ 公 司 ； ａｅ Ｉ） 肝 １ Ｈｅ ａｉ ｓ １ ， Ｉ ｎ ｌ ｉ ｍａ
ＮＡｃ Ｓ ６ （Ｉ— Ａ），△ＵＡ２ ＧｌＮ６ ｃ Ｓ（Ｉ— ， ＡＵＡ２ － ｃ ６ Ｈ） Ｓ ＧｌＮＳ Ｓ
中， 糖胺聚糖的含量和 结构 与正常组织 也存 在较 大差异＿ 。 ８ ｊ
。 肾脏是动物的重要器官 ， 其糖胺 聚糖 的结构 和含量在 肾脏病 变 过 程 中 发 生 显 著 变 化 ［ ” 。因 此 ，对 肾 脏 糖 胺 聚 糖 的 含 ９ ｊ ’ 量、种类 及其结构进行 系统研究具有 十分重要的意义。 本文 以 Ｗｉ ａ 大 鼠肾脏为研究 对象 ， ｓｒ ｔ 采用酶解法和色谱 法从 中提取纯化糖 胺 聚糖［３ １ ，综 合运 用电泳 和高 效液 相色 １ 谱紫外检测法对其含量 、 种类及二糖组 成进行分 析 ， 动物 为 组织 中微量糖胺聚糖的种类和细微结构研究提供参考 。
引 言
糖胺聚糖 （ ｌ ｏａ ｎｇｙａｓ ＡＧ ） ｇｙ ｓｍｉｏ ｌｃｎ ，Ｇ ｓ 是一 类 由不 同 的 ｃ 重 复二糖结构单元组成的带 有羧基 和硫 酸酯基 的线性聚 阴离 子 长链分子 ， 广泛存在 于细胞表 面和细胞外基 质 中。 为生 作 物体 内重要的生 物大 分 子，糖 胺 聚糖 通过 与生 物体 内各 种 酶 、生长 因子及细胞黏 附因子等结合 ， 与细胞增 殖 、 化 参 分 和免疫调节等重要 的生 物学过程［３。 １３ － 研究表明，在不同物种的相 同组织 中 ，以及 同一组织 不 同发育阶段 ， 糖胺 聚糖结 构都 不相 同 ］ 。 ，尤其 在病 变组织
（２ Ｓ）， ＡＵＡ－ ｌ ６ ＧａＮＡｃ Ｓ Ｓ （４ Ｓ） △ＵＡ２ － ｌ ４ ６ ６ ， Ｓ ＧａＮＡｃ Ｓ Ｓ ４６
（４ Ｓ ；硫酸乙酰 肝素 类不 饱 和二 糖 标准 品 ：Ａ ２ － ｌ— ２６） ＵＡ ＳＧ ｃ
ＮＡ ６ （ Ａ） △ ｃＳ Ⅱ一 ， ＵＡ２ ＳＧｌ Ａｃ １一 ，均 由英 国 Ｉｕｏ ｃ Ｎ （１ Ａ） ／ ｄ ｒｎ公
司； 软骨素酶 Ａ Ｃ Ｃ ｏ ｄｏｔ ａｅ Ｂ ） 肝素酶 Ｉ（ ｐｒ Ｂ （ ｈ ｎ ｒｉｎｓ Ｃ ， ｉ Ａ Ｈｅａｉ —
ｎｓ ， 素酶 １（ ｐ ｒ ａｅＩ） 均 为 美 国 Ｓｇ 公 司 ； ａｅ Ｉ） 肝 １ Ｈｅ ａｉ ｓ １ ， Ｉ ｎ ｌ ｉ ｍａ
ＮＡｃ Ｓ ６ （Ｉ— Ａ），△ＵＡ２ ＧｌＮ６ ｃ Ｓ（Ｉ— ， ＡＵＡ２ － ｃ ６ Ｈ） Ｓ ＧｌＮＳ Ｓ
中， 糖胺聚糖的含量和 结构 与正常组织 也存 在较 大差异＿ 。 ８ ｊ
。 肾脏是动物的重要器官 ， 其糖胺 聚糖 的结构 和含量在 肾脏病 变 过 程 中 发 生 显 著 变 化 ［ ” 。因 此 ，对 肾 脏 糖 胺 聚 糖 的 含 ９ ｊ ’ 量、种类 及其结构进行 系统研究具有 十分重要的意义。 本文 以 Ｗｉ ａ 大 鼠肾脏为研究 对象 ， ｓｒ ｔ 采用酶解法和色谱 法从 中提取纯化糖 胺 聚糖［３ １ ，综 合运 用电泳 和高 效液 相色 １ 谱紫外检测法对其含量 、 种类及二糖组 成进行分 析 ， 动物 为 组织 中微量糖胺聚糖的种类和细微结构研究提供参考 。
引 言
糖胺聚糖 （ ｌ ｏａ ｎｇｙａｓ ＡＧ ） ｇｙ ｓｍｉｏ ｌｃｎ ，Ｇ ｓ 是一 类 由不 同 的 ｃ 重 复二糖结构单元组成的带 有羧基 和硫 酸酯基 的线性聚 阴离 子 长链分子 ， 广泛存在 于细胞表 面和细胞外基 质 中。 为生 作 物体 内重要的生 物大 分 子，糖 胺 聚糖 通过 与生 物体 内各 种 酶 、生长 因子及细胞黏 附因子等结合 ， 与细胞增 殖 、 化 参 分 和免疫调节等重要 的生 物学过程［３。 １３ － 研究表明，在不同物种的相 同组织 中 ，以及 同一组织 不 同发育阶段 ， 糖胺 聚糖结 构都 不相 同 ］ 。 ，尤其 在病 变组织
动物源细胞外基质中糖胺聚糖物质的检测方法
动物源细胞外基质中糖胺聚糖物质的检测方法动物源细胞外基质（ECM）是组成组织和器官的关键成分之一，它包含多种生物大分子，如蛋白质、多糖和糖蛋白。
其中，糖胺聚糖是一类重要的多糖物质，它们在细胞外基质中发挥着重要的生物学功能。
本文将介绍几种常见的检测糖胺聚糖物质的方法。
一、显微镜观察显微镜观察是最常用的糖胺聚糖物质检测方法之一、通过染色或荧光标记等方式，可以直接观察细胞外基质中的糖胺聚糖分子。
目前，常用的染色方法有甲苯胺蓝（toluidine blue）染色和伊红（Safranin O）染色等。
这些染料可与糖胺聚糖分子结合，形成特定的颜色，从而能够在显微镜下直接观察到。
二、糖胺聚糖定量分析检测1.二氧化硫比色法(SO2-4比色法)二氧化硫比色法是一种常用的糖胺聚糖定量分析方法。
该方法是基于糖胺聚糖的特性，与孟骥反应，生成带有特征吸收峰的染料。
该染料的吸光度与糖胺聚糖的含量成正比，可以通过分光光度计测定吸光度，并用标准曲线法计算待测样品中糖胺聚糖的浓度。
2.硫酸铜比色法硫酸铜比色法是一种常用的糖胺聚糖含量测定方法。
该方法是通过硫酸铜与糖胺聚糖发生反应，生成浅蓝色络合物，并通过测定紫外光谱吸收峰的变化来定量糖胺聚糖的含量。
该方法简单易行，对样品的要求较低，适用于不同类型的糖胺聚糖物质。
三、免疫检测免疫检测是一种常用的糖胺聚糖检测方法，基于糖胺聚糖与特异性抗体的结合反应。
通过使用特异性的抗体，可以将糖胺聚糖物质从样品中分离出来，并形成可观察的免疫复合物。
常用的免疫检测方法有免疫组化染色和酶联免疫吸附测定法（ELISA）等。
免疫组化染色方法：在这种方法中，使用特异性的抗体和二抗，将糖胺聚糖与荧光标记或酶标记的二抗结合，然后通过显微镜观察并分析成像结果。
这种方法可以提供对糖胺聚糖分子在细胞外基质中的定位和表达水平的信息。
ELISA方法：这是一种高效的糖胺聚糖定量方法。
通过将样品中的糖胺聚糖与特异性的抗体结合，形成抗原-抗体复合物，然后使用酶标记的二抗来检测这些复合物。
动物源细胞外基质中糖胺聚糖物质的检测方法
动物源细胞外基质中糖胺聚糖物质的检测方法动物源细胞外基质（ECM）是一种重要的生物材料，它由多种复杂的分子组成，其中糖胺聚糖（GAGs）是其中一种重要的成分。
GAGs 在ECM中扮演着重要的生物学功能，包括细胞黏附、细胞信号传导、细胞生长和分化等。
因此，检测ECM中的GAGs物质是非常重要的。
本文将介绍一种检测ECM中GAGs的方法。
一、实验原理本实验采用二甲基亚砜（DMSO）-显色剂法检测GAGs。
GAGs与DMSO在高温下反应，生成葡萄糖醛酸和2-氨基-2-脱氧葡萄糖，然后用显色剂检测2-氨基-2-脱氧葡萄糖，从而间接检测GAGs的含量。
二、实验步骤1、制备样品将ECM样品放入离心管中，加入PBS缓冲液，振荡混匀后离心，去除上清液，再加入1 ml DMSO，放入高温水浴中加热30 min。
2、检测GAGs加入1 ml显色剂，混匀后室温下静置10 min，然后在波长为520 nm的光谱仪上检测吸光度。
3、计算GAGs含量根据标准曲线计算出样品中GAGs的含量。
三、实验结果使用本方法检测了不同来源的ECM样品中GAGs的含量。
结果表明，不同来源的ECM中GAGs含量存在差异，其中骨骼肌ECM中GAGs含量最高，肝脏ECM中GAGs含量最低。
四、实验优缺点本方法简单、快速、灵敏，适用于大规模样品的检测。
但是，样品的前处理过程可能影响到GAGs的含量，因此需要注意样品的处理过程。
五、实验应用本方法可用于检测不同来源的ECM中GAGs的含量，为研究ECM 的生物学功能提供了一种可靠的手段。
同时，该方法还可用于检测肿瘤组织中的GAGs含量，为肿瘤的诊断和治疗提供参考。
六、实验总结本文介绍了一种检测ECM中GAGs的方法，该方法简单、快速、灵敏，适用于大规模样品的检测。
该方法可用于研究ECM的生物学功能和肿瘤的诊断和治疗。
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纸层析 ( PC) 、薄层层析 ( TLC) 都是以已知结构的单糖 作为标准物 ,根据保留时间等特征数值来判断单糖的种类 。 气相 ( GC) 分析时先将单糖衍生化处理成易挥发的组分 ,常 采用的衍生化方法有硅烷基化和乙酰化 。高效液相色谱法 ( HPLC) 则克服了 GC 需衍生化的缺陷 ,它可直接进样测定 。 同样离子色谱法不需要衍生化处理 ,而且检测灵敏度甚至 比 HPLC 更高 。质谱 ( MS) 和核磁共振 (NMR) 常用于单糖 和多糖精细结构的研究 ,气相 —质谱已应用于甲基化产物 的鉴别 。
48
水产科学
第 24 卷
比浊法应用于糖类和酯类水解产物中无机硫酸根的测定之 后 ,现在该法已被普遍应用于糖胺聚糖硫酸根的定量分析 。 3. 1. 3 主链及侧链联接方式
高碘酸氧化 : 高碘酸可以选择性地氧化断裂糖分子中 的连二羟基或连三羟基 ,生成相应的多糖醛 、甲酸 ,反应定 量地进行 。每开裂一个 C —C 键消耗一分子高碘酸 ,通过测 定高碘酸的消耗量和甲酸的生成量 ,可以判断糖苷键的位 置 、连接方式 、支链状况和聚合度等结构信息 。高碘酸氧化 反应必须在控制的条件下进行 ,以避免副反应的产生 (超氧 化反应) 。一般使多糖与最小量的高碘酸反应 ,溶液 p H 值 控制在 3～5 ,且应避光 、低温 。
β(1 →3) 、β(1 →4) β(1 →3) 、β(1 →4) α(1 →3) 、β(1 →4) α/β(1 →4) β(1 →3) 、β(1 →4)
硫酸基的位置 糖胺的 4 或 6 碳 糖胺的 6 碳 糖胺的 4 碳 糖胺的 1 或 3 或 6 碳 ;醛酸的 2 碳 无
2 糖胺聚糖分析测定方法
总糖含量的测定采用 Dubios 法[7 ] 。 以分子中某一基团的含量来定量糖胺聚糖的方法有 : 测定己糖醛酸的 Carbazole 法[8 ] 、测定己糖胺的 Elson - Mor2 gan 法[9 ] 。两种方法都要用强腐蚀性酸 ,且反应需在高温下 进行 。
第5期
刘义等 :糖胺聚糖分析测定方法
己糖醛酸的测定方法有 Dische 法[25 ] 及其改进法[26 ] 和 Nelly 法[27 ] 。Dische 法即咔唑 —硫酸法已在己糖醛酸的测 定中被广泛运用 。但是由于上述方法都受到中性己糖和戊 糖的干扰 ,现在多采用间羟联苯法[28 ] 。
3 精细结构分析
3. 1 一级结构分析 3. 1. 1 主链基团测定
Kennedy[29 ]总结前人的研究成果认为大多数糖胺聚糖 是由一个氨基己糖和一个己糖醛酸组成的二糖单元依据有 规则的排列形成的直链多糖 ,但其二糖单元也呈不均一性 。
将糖胺聚糖水解为寡糖和单糖 ,是分析多糖链组成成 分的主要手段 。水解方法包括完全酸水解 、部分酸水解 、乙 酰解 、甲醇解以及酶解等 。1) 完全酸水解 ;将多糖与强酸 (浓 硫酸 、浓盐酸) 等试剂作用 ,在一定温度下 (80～100 ℃) 进行 完全酸水解 (4～10 h) 。水解的难易程度与组成多糖的单糖 性质 、单糖环的形状和糖苷键的构型有关 。一般呋喃型较 吡喃型易水解 ,含有糖醛酸或氨基糖的多不易水解 。2) 部分 酸水解 :利用中性酸 (硫酸 、盐酸) 100 ℃水解合适时间 。3) 乙 酰解 ;将多糖与乙酐 、冰醋酸 、浓硫酸等混合反应 ,可得到乙 酰化单糖 。4) 甲醇解 :将多糖与盐酸 - 甲醇混合反应 ,可得 到甲基化单糖 。5) 酶解 :该技术已被广泛地应用于糖胺聚糖 组成成分 的 分 析 , 最 常 用 的 酶 有 软 骨 素 酶 AC、软 骨 素 酶 ABC 等 。对硫酸多糖进行酶解时 ,其硫酸基可能阻碍反应 的进行 ,因此在酶解之前必须有一个脱硫的步骤 。 3. 1. 2 取代基测定
2. 1 糖胺聚糖完整分子定性 、定量分析 2. 1. 1 分子量 、纯度分析
纸层析 、电泳技术已被广泛应用于糖胺聚糖组分纯度 的分析 ,常用的电泳有 :琼脂糖凝胶电泳 、醋酸纤维素膜电 泳 、SDS - PA GE 等[3 ] 。另外毛细管电泳[4 ] 、毛细管区带电 泳[5 ]已被用于糖胺聚糖整体分子 、寡聚体成分 、二糖单元的 分离与分析 。凝胶排阻色谱法和 HPLC 已经成为实验室分 析糖胺聚糖纯度 、分子量最为常规的方法 。 另外分析型超
糖胺聚糖中心蛋白的分析[15 ] :糖胺聚糖经过糖胺聚糖 类酶降解后经 SDS - PA GE 后能够很好地分离 ,利用特异性 的抗体可识别中心蛋白的种类和联接顺序 。 2. 2 单糖组分测定 2. 2. 1 己糖组分测定
以前定性单糖都是应用经典的化学 、物理方法 ,现在已 经建立了多种快速简便定性 、定量分析单糖的方法 。
己糖构型测定[16 ] :糖类质中手性原子较多 ,其旋光性 与其空间构型也有关 ,一般我们可以由旋光度值直接判断 单糖为α型还是β型 ,通常β型单糖旋光度值较α型负很 多 。比较α糖酶和β糖酶对多糖降解效果 ,也可得出糖胺聚 糖中某一单糖主要以何种构型存在[2 ,17 ] 。糖胺聚糖红外光 谱图中 ,890cm - 1 吸收蜂来判别α糖苷键的存在 ,840cm - 1
吸收蜂来判别β糖苷键的存在 。酶法[18 ]测定 D - / L - 构型 极其有效 ,近来已被研究者使用 。 2. 2. 2 己糖胺测定
糖胺聚糖水解后释放出的氨基己糖 ,常用 Elson - Mor2 gan 法[19 ]及其改进方法[20 ] 分析游离氨基己糖 ; N —乙酰氨 基己糖则常用 Morgan —Elson 法[21 ] 及其改进方法[22 ] 分析 。 在原大分子中 N —乙酰氨基己糖可用次氯酸钠 - 直链淀粉 - 碘 化 钾 法 测 定[16 ] 。其 它 测 定 方 法 还 有 离 子 交 换 色 谱 法[23 ] 、高效液相色谱法[24 ]等 。 2. 2. 3 己糖醛酸测定
糖胺聚糖的取代基通常包括羧基 、硫酸基和乙酰氨基 等。
在乙酰基的测定方法中 ,气相色谱法较灵敏 。测定时 乙酰基用酸解离成乙酸后 ,将水解液直接注入色谱柱进行 测定[30 ] 。[ 1 H ] 核 磁 共 振 可 用 于 完 整 分 子 中 乙 酰 基 的 测 定[24 ] 。
硫酸根测定 :Dodgson 和 Lloyd 曾分别利用对二氨基联 苯和氯冉酸钡测定硫酸根 ,但受联氨影响较大 。后来 ,Dodg2 son 等[31 ]用重量法测定无机硫酸根 ,但实验所需样品量较 大 ,不能进行微量测定 。1961 年 Dodgson[32 ] 将 BaCl2 - 明胶
Smit h 降解 :Smit h 降解是将高碘酸氧化产物还原后进 行酸水解或部分水解 。由于糖基之间以不同的位置缩合 , 用高碘酸氧化后则生成不同的产物 ,由降解产物来获取多 糖的结构信息 。
甲基化反应 : 将多糖中各种单糖残基中的游离羟基全 部甲基化 ,进而将甲基化多糖水解 ,水解后得到的化合物 , 其羟基所在的位置即为原来单糖残基的连接点 。根据不同 甲基化单糖的比例 ,可以推测这种连接键型在多糖重复结 构中 的 比 例 。多 糖 的 甲 基 化 方 法 较 多 , 有 Purdie 法 、 Hamort h 法 、Menzics 法 、Hakomori 法等 ;目前 ,最常用的甲基 化方法是改良的 Hakomori 法[33 ] 。甲基化反应的关键在于 甲基化完全 ,通常采用红外光谱法来检测 3500cm - 1处有无 吸收来判断 。多糖甲基化完全后 ,水解成甲基化单糖 ,经乙 酰化后用 GC 或 GC - MS 分析 ,也可用 HPLC 直接分析 。
中图分类号 : Q538
文献标识码 : C
糖胺聚糖 ( Glycosaminoglycan , GA G) 又名粘多糖 ( Mu2 copolysacchride) 、酸 性 粘 多 糖 ( Acid/ Acidic Mucopolysac2 charide) 、硫酸粘多糖 ( Sulphuric Mucopolysaccharide) 、硫酸酯 多糖 ( Sulphate Polysaccharide) 、结 缔 组 织 多 糖 ( Connective Tissue Polysaccharide) 等[1 ] ,它在许多生物学 、生理学和病理 学过程中起着重要作用 ,已引起世界医药界的广泛关注 ,人 们已经在利用外源性糖胺聚糖的生物活性研制有效药物防 治某些疾病方面取得了很大进展 。糖胺聚糖的功能与其结 构密切相关 ,关于多糖结构和功能关系的研究已经成为生 命科学最前沿的领域之一 ,许多先进的仪器分析方法和生 物技术已被应用到多糖的结构分析中 。目前对于糖胺聚糖 一级结构的研究已经取得了很大的进展 ,但是对于其高级 结构及其与功能活性的关系的研究还很少 ,本文综述了糖 胺聚糖的结构层次及结构分析方法 。
表 1 糖胺聚糖的结构层次
糖胺聚糖
二糖单元组分
连接键
硫酸软骨素 D - 葡萄糖醛酸 、N - 乙酰半乳糖胺 硫酸角质素 半乳糖 、N - 乙酰葡萄糖胺 硫酸皮肤素 艾杜糖醛酸 、N - 乙酰半乳糖胺 肝 素 艾杜糖醛酸或葡萄糖醛酸 、硫酸葡萄糖胺或 N - 乙酰葡萄糖胺 透 明 质 酸 D - 葡萄糖醛酸 、N - 乙酰葡萄糖胺
CTAB 和 CPC 等[14 ]季铵盐不仅能够用来实现糖胺聚糖 的分离提取 ,而且还被用于糖胺聚糖的定量分析 。
色谱法和电泳法也可用于糖胺聚糖的定量检测 ,但该 法不适合常规分析 。 2. 1. 3 其他
糖胺聚糖聚合物联接稳定性的测定[6 ] :在物理条件下 , 糖胺聚糖和透明质酸之间的相互作用是可逆的 ,而由糖胺 聚糖 、透明质酸和结合蛋白形成的具有三级结构的复合物 恰恰是不可逆的 。因此 ,将过量的透明质酸和糖胺聚糖混 合后过柱 ,那些与透明质酸结合不紧密的糖胺聚糖就滞留 在柱中 ,反之与透明质酸结合紧密的糖胺聚糖就优先被洗 脱出来 ,然后根据洗脱结果计算糖胺聚糖聚合物联接稳定 性的大小 。
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组织化学方法是测定糖胺聚糖最原始的方法 。Karls2 son[10 ]曾利用糖胺聚糖和阿尔辛蓝结合与分解的性能检测 糖胺聚糖含量 。后来 ,有利用阿尔辛蓝 (Alcian blue) [11 ] 、1 ,9 - 二甲基亚甲蓝 (1 ,9 - dimet hylmet hylene blue) [1 ] [12 ]和天青 A (azure A) [13 ]等染色剂直接比色法定性 、定量分析糖胺聚 糖 。阿尔辛蓝比色法灵敏度不及后两者 ,且在高盐溶液中 结果不够准确 ,但是可以应用于提取分离的初步筛选过程 中 。经过改进后的二甲基亚甲蓝比色法不仅灵敏度高 ,而 且稳定性和测量范围都得到了提高 。天青 A 比色法灵敏度 很高 ,但是反应条件要求高 。
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水产科学
第 24 卷
比浊法应用于糖类和酯类水解产物中无机硫酸根的测定之 后 ,现在该法已被普遍应用于糖胺聚糖硫酸根的定量分析 。 3. 1. 3 主链及侧链联接方式
高碘酸氧化 : 高碘酸可以选择性地氧化断裂糖分子中 的连二羟基或连三羟基 ,生成相应的多糖醛 、甲酸 ,反应定 量地进行 。每开裂一个 C —C 键消耗一分子高碘酸 ,通过测 定高碘酸的消耗量和甲酸的生成量 ,可以判断糖苷键的位 置 、连接方式 、支链状况和聚合度等结构信息 。高碘酸氧化 反应必须在控制的条件下进行 ,以避免副反应的产生 (超氧 化反应) 。一般使多糖与最小量的高碘酸反应 ,溶液 p H 值 控制在 3～5 ,且应避光 、低温 。
β(1 →3) 、β(1 →4) β(1 →3) 、β(1 →4) α(1 →3) 、β(1 →4) α/β(1 →4) β(1 →3) 、β(1 →4)
硫酸基的位置 糖胺的 4 或 6 碳 糖胺的 6 碳 糖胺的 4 碳 糖胺的 1 或 3 或 6 碳 ;醛酸的 2 碳 无
2 糖胺聚糖分析测定方法
总糖含量的测定采用 Dubios 法[7 ] 。 以分子中某一基团的含量来定量糖胺聚糖的方法有 : 测定己糖醛酸的 Carbazole 法[8 ] 、测定己糖胺的 Elson - Mor2 gan 法[9 ] 。两种方法都要用强腐蚀性酸 ,且反应需在高温下 进行 。
第5期
刘义等 :糖胺聚糖分析测定方法
己糖醛酸的测定方法有 Dische 法[25 ] 及其改进法[26 ] 和 Nelly 法[27 ] 。Dische 法即咔唑 —硫酸法已在己糖醛酸的测 定中被广泛运用 。但是由于上述方法都受到中性己糖和戊 糖的干扰 ,现在多采用间羟联苯法[28 ] 。
3 精细结构分析
3. 1 一级结构分析 3. 1. 1 主链基团测定
Kennedy[29 ]总结前人的研究成果认为大多数糖胺聚糖 是由一个氨基己糖和一个己糖醛酸组成的二糖单元依据有 规则的排列形成的直链多糖 ,但其二糖单元也呈不均一性 。
将糖胺聚糖水解为寡糖和单糖 ,是分析多糖链组成成 分的主要手段 。水解方法包括完全酸水解 、部分酸水解 、乙 酰解 、甲醇解以及酶解等 。1) 完全酸水解 ;将多糖与强酸 (浓 硫酸 、浓盐酸) 等试剂作用 ,在一定温度下 (80～100 ℃) 进行 完全酸水解 (4～10 h) 。水解的难易程度与组成多糖的单糖 性质 、单糖环的形状和糖苷键的构型有关 。一般呋喃型较 吡喃型易水解 ,含有糖醛酸或氨基糖的多不易水解 。2) 部分 酸水解 :利用中性酸 (硫酸 、盐酸) 100 ℃水解合适时间 。3) 乙 酰解 ;将多糖与乙酐 、冰醋酸 、浓硫酸等混合反应 ,可得到乙 酰化单糖 。4) 甲醇解 :将多糖与盐酸 - 甲醇混合反应 ,可得 到甲基化单糖 。5) 酶解 :该技术已被广泛地应用于糖胺聚糖 组成成分 的 分 析 , 最 常 用 的 酶 有 软 骨 素 酶 AC、软 骨 素 酶 ABC 等 。对硫酸多糖进行酶解时 ,其硫酸基可能阻碍反应 的进行 ,因此在酶解之前必须有一个脱硫的步骤 。 3. 1. 2 取代基测定
2. 1 糖胺聚糖完整分子定性 、定量分析 2. 1. 1 分子量 、纯度分析
纸层析 、电泳技术已被广泛应用于糖胺聚糖组分纯度 的分析 ,常用的电泳有 :琼脂糖凝胶电泳 、醋酸纤维素膜电 泳 、SDS - PA GE 等[3 ] 。另外毛细管电泳[4 ] 、毛细管区带电 泳[5 ]已被用于糖胺聚糖整体分子 、寡聚体成分 、二糖单元的 分离与分析 。凝胶排阻色谱法和 HPLC 已经成为实验室分 析糖胺聚糖纯度 、分子量最为常规的方法 。 另外分析型超
糖胺聚糖中心蛋白的分析[15 ] :糖胺聚糖经过糖胺聚糖 类酶降解后经 SDS - PA GE 后能够很好地分离 ,利用特异性 的抗体可识别中心蛋白的种类和联接顺序 。 2. 2 单糖组分测定 2. 2. 1 己糖组分测定
以前定性单糖都是应用经典的化学 、物理方法 ,现在已 经建立了多种快速简便定性 、定量分析单糖的方法 。
己糖构型测定[16 ] :糖类质中手性原子较多 ,其旋光性 与其空间构型也有关 ,一般我们可以由旋光度值直接判断 单糖为α型还是β型 ,通常β型单糖旋光度值较α型负很 多 。比较α糖酶和β糖酶对多糖降解效果 ,也可得出糖胺聚 糖中某一单糖主要以何种构型存在[2 ,17 ] 。糖胺聚糖红外光 谱图中 ,890cm - 1 吸收蜂来判别α糖苷键的存在 ,840cm - 1
吸收蜂来判别β糖苷键的存在 。酶法[18 ]测定 D - / L - 构型 极其有效 ,近来已被研究者使用 。 2. 2. 2 己糖胺测定
糖胺聚糖水解后释放出的氨基己糖 ,常用 Elson - Mor2 gan 法[19 ]及其改进方法[20 ] 分析游离氨基己糖 ; N —乙酰氨 基己糖则常用 Morgan —Elson 法[21 ] 及其改进方法[22 ] 分析 。 在原大分子中 N —乙酰氨基己糖可用次氯酸钠 - 直链淀粉 - 碘 化 钾 法 测 定[16 ] 。其 它 测 定 方 法 还 有 离 子 交 换 色 谱 法[23 ] 、高效液相色谱法[24 ]等 。 2. 2. 3 己糖醛酸测定
糖胺聚糖的取代基通常包括羧基 、硫酸基和乙酰氨基 等。
在乙酰基的测定方法中 ,气相色谱法较灵敏 。测定时 乙酰基用酸解离成乙酸后 ,将水解液直接注入色谱柱进行 测定[30 ] 。[ 1 H ] 核 磁 共 振 可 用 于 完 整 分 子 中 乙 酰 基 的 测 定[24 ] 。
硫酸根测定 :Dodgson 和 Lloyd 曾分别利用对二氨基联 苯和氯冉酸钡测定硫酸根 ,但受联氨影响较大 。后来 ,Dodg2 son 等[31 ]用重量法测定无机硫酸根 ,但实验所需样品量较 大 ,不能进行微量测定 。1961 年 Dodgson[32 ] 将 BaCl2 - 明胶
Smit h 降解 :Smit h 降解是将高碘酸氧化产物还原后进 行酸水解或部分水解 。由于糖基之间以不同的位置缩合 , 用高碘酸氧化后则生成不同的产物 ,由降解产物来获取多 糖的结构信息 。
甲基化反应 : 将多糖中各种单糖残基中的游离羟基全 部甲基化 ,进而将甲基化多糖水解 ,水解后得到的化合物 , 其羟基所在的位置即为原来单糖残基的连接点 。根据不同 甲基化单糖的比例 ,可以推测这种连接键型在多糖重复结 构中 的 比 例 。多 糖 的 甲 基 化 方 法 较 多 , 有 Purdie 法 、 Hamort h 法 、Menzics 法 、Hakomori 法等 ;目前 ,最常用的甲基 化方法是改良的 Hakomori 法[33 ] 。甲基化反应的关键在于 甲基化完全 ,通常采用红外光谱法来检测 3500cm - 1处有无 吸收来判断 。多糖甲基化完全后 ,水解成甲基化单糖 ,经乙 酰化后用 GC 或 GC - MS 分析 ,也可用 HPLC 直接分析 。
中图分类号 : Q538
文献标识码 : C
糖胺聚糖 ( Glycosaminoglycan , GA G) 又名粘多糖 ( Mu2 copolysacchride) 、酸 性 粘 多 糖 ( Acid/ Acidic Mucopolysac2 charide) 、硫酸粘多糖 ( Sulphuric Mucopolysaccharide) 、硫酸酯 多糖 ( Sulphate Polysaccharide) 、结 缔 组 织 多 糖 ( Connective Tissue Polysaccharide) 等[1 ] ,它在许多生物学 、生理学和病理 学过程中起着重要作用 ,已引起世界医药界的广泛关注 ,人 们已经在利用外源性糖胺聚糖的生物活性研制有效药物防 治某些疾病方面取得了很大进展 。糖胺聚糖的功能与其结 构密切相关 ,关于多糖结构和功能关系的研究已经成为生 命科学最前沿的领域之一 ,许多先进的仪器分析方法和生 物技术已被应用到多糖的结构分析中 。目前对于糖胺聚糖 一级结构的研究已经取得了很大的进展 ,但是对于其高级 结构及其与功能活性的关系的研究还很少 ,本文综述了糖 胺聚糖的结构层次及结构分析方法 。
表 1 糖胺聚糖的结构层次
糖胺聚糖
二糖单元组分
连接键
硫酸软骨素 D - 葡萄糖醛酸 、N - 乙酰半乳糖胺 硫酸角质素 半乳糖 、N - 乙酰葡萄糖胺 硫酸皮肤素 艾杜糖醛酸 、N - 乙酰半乳糖胺 肝 素 艾杜糖醛酸或葡萄糖醛酸 、硫酸葡萄糖胺或 N - 乙酰葡萄糖胺 透 明 质 酸 D - 葡萄糖醛酸 、N - 乙酰葡萄糖胺
CTAB 和 CPC 等[14 ]季铵盐不仅能够用来实现糖胺聚糖 的分离提取 ,而且还被用于糖胺聚糖的定量分析 。
色谱法和电泳法也可用于糖胺聚糖的定量检测 ,但该 法不适合常规分析 。 2. 1. 3 其他
糖胺聚糖聚合物联接稳定性的测定[6 ] :在物理条件下 , 糖胺聚糖和透明质酸之间的相互作用是可逆的 ,而由糖胺 聚糖 、透明质酸和结合蛋白形成的具有三级结构的复合物 恰恰是不可逆的 。因此 ,将过量的透明质酸和糖胺聚糖混 合后过柱 ,那些与透明质酸结合不紧密的糖胺聚糖就滞留 在柱中 ,反之与透明质酸结合紧密的糖胺聚糖就优先被洗 脱出来 ,然后根据洗脱结果计算糖胺聚糖聚合物联接稳定 性的大小 。
47
组织化学方法是测定糖胺聚糖最原始的方法 。Karls2 son[10 ]曾利用糖胺聚糖和阿尔辛蓝结合与分解的性能检测 糖胺聚糖含量 。后来 ,有利用阿尔辛蓝 (Alcian blue) [11 ] 、1 ,9 - 二甲基亚甲蓝 (1 ,9 - dimet hylmet hylene blue) [1 ] [12 ]和天青 A (azure A) [13 ]等染色剂直接比色法定性 、定量分析糖胺聚 糖 。阿尔辛蓝比色法灵敏度不及后两者 ,且在高盐溶液中 结果不够准确 ,但是可以应用于提取分离的初步筛选过程 中 。经过改进后的二甲基亚甲蓝比色法不仅灵敏度高 ,而 且稳定性和测量范围都得到了提高 。天青 A 比色法灵敏度 很高 ,但是反应条件要求高 。