高效液相色谱法测定人纤维蛋白原中甘氨酸_盐酸精氨酸含量_陈通威

表 2 含药材油脂类产品酸价测定结果
况、反映产品质量状况。
序号 批号
原检验标准
1 11040706 按 GB / T15687 － 2008
2 20110516 － 38 前处理，按 GB /
改进后检验标准 按 GB / T5009． 56 －
2003 前处理，按
测定值( mg / g) 1． 9 1． 6
加入量( g / L)
样品含量( g / L)
测得量( g / L)
回收率( % )
X(%)
RSD( % )
A 0． 241 8 0． 241 8 0． 332 5 0． 332 5 0． 347 6 0． 347 6
B 0． 248 4 0． 248 4 0． 341 6 0． 341 6 0． 357 1 0． 357 1
2． 1
0311 － 85212004 － 8034（ 电子信箱） shuhua08@ sina． com。
注: 检品名称为 H 牌清宁软胶囊。
参考文献：
3 讨论 食 品 的 国 家 标 准 是 针 对 某 一 类 产 品 而 制 定 的 。如 GB /
T5009． 37 － 2003 适用于食用植物油卫生指标的分析，但含磷脂 / 卵磷脂的保健食品引用该标准，会存在样品不溶解的情况。经改 进溶剂，可使引用标准更适用。GB / T5530 － 2005 适用于动、植物 油脂中酸价的测定，但对于配方中含有较多药材的样品，天然产
作者简介： 李骘，男，大学本科，研究方向为应用化学，（ 电子 信箱） 391203893@ qq． com； 封淑华，女，硕士研究生，主任药师，研 究 方 向 为 药 品 和 保 健 食 品 质 量 分 析 ，本 文 通 讯 作 者 ，（ 电 话 ）
3 20110506
T5530 － 2005 检验 GB /T5530 －2005 检验
[ 4 ] GB / T15687 － 2008，中华人民共和国国家标准·动植物油脂试样的
物的色泽和沉淀物使得终点判断困难。经提取出脂肪后测定，可
制备 [S]．
排除药材成分的干扰。
(收稿日期： 2012 － 09 － 27 )
63
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China Pharmaceuticals
生产过程中甘氨酸、盐酸精氨酸含量的监控及成品的检定。
间为 4． 028 min。按盐酸精氨酸峰计算理论板数为 29 697，甘氨酸、
1 仪器与试药
盐酸精氨酸与内标物质峰的分离度符合要求。从色谱图 1B 可知，甘
P2000 型高效液相色谱仪） ，OV － 2001 型柱温箱（ 美国 TSP 氨酸、盐酸精氨酸与内标物质峰及其他杂质峰的分离度符合要求。
B( % )
200104） 、盐酸精氨酸对照品（ 批号为 624 － 200104） 、天门冬氨酸
0
100． 0
0
20． 00
100． 0
0
对 照 品 （ 批 号 为 624 － 200104） 均 来 自 中 国 药 品 生 物 制 品 检 定
7． 00
87． 0
13． 0
25． 00
所； 乙腈，三乙胺，正己烷，异硫氰酸苯酯，磺基水杨酸，盐酸，醋
中图分类号： R927． 2； R977． 6
文献标识码： A
文章编号： 1006 － 4931 (2013 )18 － 0063 － 02
人纤维蛋白原主要是作为凝血因子Ⅰ而直接参与凝血过程 ， [1] 为 0． 1 mol / L 醋 酸 钠 （ pH = 6． 5） － 乙 腈 （ 93 ∶ 7） ，B 为 乙 腈 － 水
公司） ； UV1000 型紫外检测仪（ 美国 TSP 公司） ； LDZS － Z 型台式
表 1 流动相梯度洗脱表
离 心 机 （ 北 京 医 用 离 心 机 厂 ） 。甘 氨 酸 对 照 品 （ 批 号 为 624 － 时间 ( min ) A( % )
B( % ) 时间 ( min ) A( % )
平均回收率 100． 19% ，RSD 为 1． 06% ; 溶液稳定性试验中，供试品溶液放置 0，2，4，8 h 后分别进样，甘氨酸 RSD 为 1． 51% ，盐酸精氨
酸 RSD 为 1． 94% 。结论 该方法检测结果准确，可用于人纤维蛋白原中甘氨酸、盐酸精氨酸含量的测定。
关键词： 人纤维蛋白原; 甘氨酸; 盐酸精氨酸; 高效液相色谱法; 含量测定
[ 1 ] GB / T5009． 37 － 2003，中华人民共和国国家标准·食用植物油卫生 标准的分析方法 [S]．
[ 2 ] GB / T5530 － 2005，中华人民共和国国家标准·动植物油脂酸值和酸 度的测定 [ S]．
[ 3 ] GB / T5009． 56 － 2003，中华人民共和国国家标准·糕点卫生标准的 分析方法 [ S]．
10． 00
85． 0
15． 0
酸钠，乙腈为色谱级，其余试剂为分析纯。1 mol / L 三乙胺乙腈溶 2．2 溶液制备
液，0． 1 mol / L 异硫氰酸苯酯乙腈溶液，1． 5% 磺基水杨酸溶液，
分别称取甘氨酸、盐酸精氨酸对照品适量，精密称定，置同一量
0． 1 mol / L 盐 酸 溶 液 ； 样 品 ( 批 号 为 20100101，20100102， 瓶中，加 0． 1 mol / L 盐酸溶液制成每 1 mL 约含甘氨酸、盐酸精氨基
是由健康人血浆经低温乙醇法分离提取后，再经病毒去除和灭活 （ 4 ∶ 1） ，梯度洗脱 ( 表 1 ) ； 进样量： 20 μL； 柱温： 38 ℃ ； 检测波长：
处理，最后冻干制成。冻干过程是一个复杂的相变过程，在冻结、 254 nm； 流速： 1． 0 mL / min。理论板数按盐酸精氨酸峰计算应不低
冻融、干燥和储存过程中存在着多种影响因素 [2 ]。而冻干保护剂 于 3 000。在此色谱条件下甘氨酸、盐酸精氨酸峰与其它色谱峰之间
是影响制品冻干效果的主要因素 [3 ]。甘氨酸、盐酸精氨酸是一种 分离度良好。从色谱图 1A 可知，甘氨酸峰保留时间为 7． 590 min，
理想的蛋白保护剂。本试验中旨在建立一种含量测定方法，用于 盐酸精氨酸峰保留时间为 8． 041 min，内标物天门冬氨酸峰保留时
2013 年 9 月 20 日 第 22 卷第 18 期 Vol． 22，No． 18，September 20，2013
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高效液相色谱法测定人纤维蛋白原中甘氨酸、盐酸精氨酸含量
陈通威，高红琴，崔素梅，张惠兰，王宗刚
量 80% ，110% ，115% 的甘氨酸、盐酸精氨酸，混匀，稀释 1 倍，分
2．4 方法学考察
别精密量取 100 μL，衍生化 后，每份进样 20 μL，计 算样品回收
线 性 关 系 考 察 ： 分 别 精 密 量 取 对 照 品 溶 液 30，50，70，100， 率。结果见表 2。
表 2 甘氨酸与盐酸精氨酸加样回收试验测定结果( n = 6)
图 1 高效液相色谱图
精密度试验： 精密量取对照品溶液 100 μL，按上述方法衍生
10 min，取上清液，用 0． 1 mol / L 盐酸溶液稀释 5 倍，得供试品溶液。 处理，连续进样 5 次。分别测得甘氨酸、盐酸精氨酸峰面积与内标
2．3 测定法
峰面积的比值（ f） 。结果甘氨酸 RSD 为 1． 37% ，盐酸精氨酸 RSD
0 0
2
4
6
8
t / min 0
10
0
2
4
6
8
t / min 10
范围内线性关系良好，甘氨酸测定质量浓度为 0． 4 g / L，在线性范
A
B
围之内； 盐酸精氨酸在 0． 186 3 ～ 0． 807 3 g / L 范围内线性关系良
A． 对照品溶液
B． 供试品溶液
好，盐酸精氨酸测定质量浓度为 0． 6 g / L，在线性范围之内。
1 200
1 200
比值（ f） 为纵坐标回归计算。甘氨酸回归方程为 Y = 3． 413 2 X －
800
800
0． 071 6，r2 = 0． 996 8； 盐 酸 精 氨 酸 回 归 方 程 为 Y = 0． 978 7 X －
400
400
0． 039 9，r2 = 0． 998 2。结果表明，甘氨酸在 0． 186 8 ～ 0． 809 4 g / L
分别精密量取对照品溶液和供试品溶液各 100 μL，置离心 为 0． 88% ，表明仪器精密度良好。
管 中 ，依 次 各 加 0． 1 mol / L 盐 酸 溶 液 200 μL，内 标 溶 液 50 μL，
稳定性试验： 取批号为 20100101 的供试品 1 份，按供试品溶
0． 1 mol / L 异硫氰酸苯酯乙腈溶液 50 μL，1 mol / L 三乙胺乙腈溶 液制备方法制样、衍生，室温下放置，分别在 0，2，4，8 h 时进样，
2013 年 9 月 20 日 第 22 卷第 18 期 Vol． 22，No． 18，September 20，2013
2 000
2 000
130 μL，各加 0． 1 mol / L 盐酸溶液适量，衍生，进样，记录色谱图。
1 600
1 600
以氨基酸的质量浓度 C（ g / L） 为横坐标、峰面积与内标峰面积的
液 50 μL，混 匀 ，室 温 放 置 1 h，加 入 正 己 烷 400 μL，摇 匀 ，静 置 分别测得甘氨酸、盐酸精氨酸峰面积与内标峰面积的比值（ f） 。结
10 min，取下层溶液，滤过，即得衍生化的对照品溶液和供试品溶 果甘氨酸 RSD 为 1． 51% ，盐酸精氨酸 RSD 为 1． 94% ，表明溶液
色谱柱： Kromisil C18 柱（ 250 mm × 4． 6 mm，5 μm） ； 流动相： A 1． 5% 磺基水杨酸溶液 9 mL，混匀，静置 30 min，以 3 000 r / min 离心
檨Leabharlann Baidu檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨
求; 甘氨酸质量浓度在 0． 186 8 ～ 0． 809 4 g / L 范围内与峰面积线性关系良好，盐酸精氨酸质量浓度在 0． 186 3 ～ 0． 807 3 g / L 范围内线
性关系良好; 精密度试验甘氨酸 RSD 为 1． 37% ，盐酸精氨酸 RSD 为 0． 88% ; 甘氨酸平均回收率 99． 65% ，RSD 为 1． 27% ; 盐酸精氨酸
A 0． 204 8 0． 204 8 0． 204 8 0． 204 8 0． 204 8 0． 204 8
B 0． 313 5 0． 313 5 0． 313 5 0． 313 5 0． 313 5 0． 313 5
液。精密量取衍生化的对照品溶液与供试品溶液各 20 μL，注入 稳定性良好。
高 效 液 相 色 谱 仪 ，记 录 色 谱 图 。按 内 标 法 以 峰 面 积 计 算 ，即 得 。精
加样回收试验： 取批号为 20100101 的供试品，精密加入处方
密量取对照品溶液 100 μL，按上述方法衍生处理，进样。
（ 山西康宝生物制品股份有限公司，山西 长治 046011）
摘要： 目的 建立人纤维蛋白原中甘氨酸、盐酸精氨酸的含量测定方法。方法 采用高效液相色谱法，柱外衍生，在色谱柱内层析，以紫外
检测器在 254 nm 波长处检测，用峰面积以内标法计算含量。结果 在该试验条件下，甘氨酸、盐酸精氨酸与内标物质峰的分离度符合要
2003） 中的样品处理方法，先将油脂用石油醚提取，低温挥尽溶
通过上述考察，建议保健食品企业标准制定人员，应针对企
剂，再按 GB / T 5530 － 2003 规定的方法进行滴定，经试验，方法 业产品的自身情况，在引用国家标准时，对前处理予以特别、详细
简便、快速、可行。产品酸价测定结果见表 2。
的规定，使检测方法更适用，从而通过检测手段可以监测产品情
20100203，山西康宝生物制品股份有限公司） 。
酸 0． 6 mg 的溶液，得对照品溶液。称取内标物天门冬氨酸适量，精
2 方法与结果
密 称 定 ，加 0． 1 mol / L 盐 酸 溶 液 制 成 每 1 mL 中 约 含 天 门 冬 氨
2．1 色谱条件 [4 －7 ] 与系统适用性试验
酸 2 mg 的溶液 ，得 内标溶液 。精 密量取 复溶后的 样品 1 mL，加