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微生物实验微生物实验细菌形态观察细菌分布消毒灭菌细菌形态观察一、实验目的1.掌握光学显微镜（油镜）的使用及日常维护2.掌握细菌的三种形态3.掌握临床常见细菌的形态及染色4.掌握细菌的特殊结构5.了解支原体、衣原体、立克次氏体、螺旋体及真菌的结构特点二、实验原理1. 普通光学显微镜（油镜）的使用1. 在标本欲检部位滴一滴香柏油，然后转换油镜头2. 从侧面观察并慢慢转动粗调节器，使油镜头浸没在油滴内，当油镜头几乎接触玻片时停止转动，以免碰撞玻片，用双眼观察目镜，同时调节细调节器，直至细菌清晰3. 根据需要调节显微镜亮度2. 普通光学显微镜的维护1.移动显微镜时，用右手持镜壁，左手托镜座，平端于胸前2.油镜用毕后，要立即用擦镜纸擦去香柏油；再用滴有二甲苯的擦镜纸擦油镜头；最后，用干净擦镜纸将镜头上的二甲苯擦去，以免损伤油镜头3.镜头擦净后，降低接物镜并将其转成八字形，罩好镜罩放入柜内4.做好使用记录3．微生物知识1．细菌按形态分类：球菌：球形（包括双球菌、四联球菌、八叠球菌、葡萄球菌、链球菌等）杆菌：杆状（包括单杆菌、双杆菌、链杆菌、分枝杆菌、双歧杆菌等）螺旋菌：螺旋状（包括螺旋菌、弧菌等）2．细菌的基本结构细胞壁、细胞膜、细胞质、核质、核蛋白体3．细菌的特殊结构荚膜：如肺炎双球菌鞭毛：又分单毛菌、双毛菌、丛毛菌、周毛菌。
如：变形杆菌为周毛菌菌毛芽胞：如破伤风梭菌、炭疽芽胞杆菌、肉毒梭菌4．微生物是一切肉眼看不见或看不清的微小生物的总称，包括原核类、真核类和非细胞类。
原核类：细菌、放线菌、蓝藻、衣原体、支原体、立克次氏体真核类：真菌、原生动物、显微藻类非细胞类：病毒、亚病毒5．真菌单细胞：圆形、芽生孢子。
如：酵母菌多细胞：菌丝及孢子、孢子出芽。
如：霉菌6．白假私酵母菌（白念）生物学性状：G+单细胞真菌、芽生孢子、类酵母型菌落厚膜孢子、假菌丝有助于鉴定致病性：皮肤粘膜——鹅口疮、内脏感染、CNS感染微生物学检查：直接涂片、染色后镜检——菌体、芽生孢子、假菌丝7．新型隐球菌生物学性状：圆形酵母型菌、外周有厚荚膜（比菌体大1-3倍）致病性：吸入后侵犯皮肤、粘膜等——慢性炎症和脓肿；侵袭CNS——亚急性或慢性脑膜炎微生物学检查：脑脊液离心后取沉淀、痰和脓标本直接检查；墨汁负染见出芽菌体外围有宽厚荚膜为阳性三、实验材料记号笔：1支；大镊子：1支；火柴：1盒；蜡笔：1支；试管架：1个；酒精灯：1个；接种环：1支；Olympus显微镜：1台；显微镜使用记录本：1个四、实验内容1. 观察细菌三种形态1）球菌链球菌、葡萄球菌、肺炎双球菌（子弹形）、脑膜炎双球菌（蚕豆形）、四联菌2）杆菌破伤风杆菌、白喉杆菌（异染颗粒）、绿脓杆菌、伤寒杆菌、变形杆菌3）螺形菌弧菌——霍乱弧菌；螺菌；螺杆菌——幽门螺杆菌；弯曲菌2. 观察细菌的特殊结构芽胞、鞭毛、荚膜、异染颗粒、钩端螺旋体、幽门螺杆菌3. 绘图葡萄球菌(staphyloccocus)；肺炎双球菌(pneumo coccus)；脑膜炎球菌(meningococcus)；破伤风杆菌（Clostridium Tantenus）；霍乱弧菌（vibrio cholera)；芽胞(spore)；鞭毛（flagellum)；荚膜(capsule)；钩端螺旋体(leptospira)五、实验结果绘8幅细菌镜下图，已交。
光学显微镜的使用及革兰氏染色显微镜是研究微生物所必不可少的工具。
由于显微镜的发明，帮助人类揭开了微生物世界的奥秘。
随着科学技术的不断发展，光学显微镜已从利用可见光的范围扩大到利用紫外光源及非光源的电子显微镜，从而大大地提高了显微镜的放大率和分辨率。
当今微生物学实验室中最常用的是普通光学显微镜，无论是观察微生物的个体形态还是测量微生物细胞大小都必须使用它。
因此我们应了解显微镜的构造和原理，以达到正确使用和保养的目的。
除暗视野显微镜和相差显微镜可用于观察活的细菌细胞外，其他普通光学显微镜大都用来观察经染色后的细菌细胞，只有经过染色的细胞才能看清其形态和构造。
因此各种染色法也是微生物工作者应掌握的基本技术。
1普通光学显微镜的使用【目的】1．了解普通光学显微镜的构造和原理。
2．正确掌握使用显微镜的方法。
【概述】微生物是肉眼看不见的微小生物，必须借助光学显微镜和电子显微镜，才能观察到。
因此，显微镜是研究微生物最基本和最重要的工具之一。
所以，掌握显微镜的使用与维护是进行微生物实验研究的基本技能。
【普通光学显微镜的基本结构】普通光学显微镜由两大部分组成，即机械部分和光学部分。
机械部分包括镜座、镜臂、载物台及台上的标本推进器、镜筒、物镜转换盘、升降调节器等，其主要作用是支撑、固定镜头、调节物象焦距、搁置和移动标本。
光学系统包括反光镜（或电光源）、光圈、聚光器、物镜、目镜等，作用是收集光源并聚集于标本上，然后通过透镜放大成像，使人眼可以分辨在裸眼时不能看见的细节。
物镜一般有4×、10×、40×、100×（或90×）等几种。
100×的是油镜，是微生物实验最常用的物镜。
因为目镜多为10×，所以使用油镜观察标本时，放大倍数为1000×，可以将1μm左右的细菌放大至1mm左右。
1．机械装置(1)镜座和镜臂：它们是显微镜的基本骨架，起稳固和支持显微镜的作用。
微生物学实验报告题目：显微镜的使用及细胞的革兰氏染色姓名：学号：年级班级：组别：同组者：时间：【实验器材】1．菌种大肠杆菌16h牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物，金黄色葡萄球菌16h牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物，枯草芽孢/胞杆菌16h牛肉膏蛋白胨斜面培养物。
2．溶液和试剂革兰氏染液，草酸铵结晶紫染液，卢戈式（Lugol）碘液，95%乙醇，番红复染液，香柏油，二甲醇等。
3．仪器和其他用品普通光学显微镜，擦镜纸，酒精灯，载玻片，双层瓶，接种环，试管架，镊子，滴管。
【目的要求】1．显微镜的构造及使用。
2．学习油镜的使用、涂片、染色技术。
3．初步认识细菌形态。
4．掌握革兰氏染色法。
【实验原理】现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜。
它们由机械装置和光学系统两大部分组成。
在普通光学显微镜通常配置的集中物镜中油镜的放大倍数最大，对微生物学研究最为重要，与其他物镜相比，油镜的使用方法比较特殊，需要在载玻片和镜头之间滴加香柏油。
简单染色法是利用单一染料使细菌着色以显示其形态的染色方法。
常用于染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。
碱性染料电离时，其分子染色部分带正电荷，能和带负电荷的物质结合。
由于细菌生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料使其着色。
当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。
中性染料是前两者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。
革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram创立的。
作为细菌学上最常用最重要的鉴别染色法，革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G－）两大类。
G－菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。
实验一显微镜的使用及细菌的革兰氏染色一、实验目的和内容（一）实验目的1. 复习显微镜低倍镜和高倍镜的使用技术，了解油浸系物镜的基本原理，掌握油镜的使用方法。
2. 初步掌握细菌涂片方法及革兰氏染色的步骤（二）实验内容1．学习油浸系物镜的使用方法。
2．制作细菌染色装片。
3．进行革兰氏染色法操作。
4．用油镜观察大肠杆菌和苏云金杆菌染色装片。
二、实验原理（一）油镜的基本原理普通光学显微镜包括低倍物镜、高倍物镜和油镜3种物镜。
油镜是一种高倍放大的物镜，一般都刻有放大倍数，如95×、100×等。
油镜头上常刻有OI（Oil，Immersion）或HI（Homogeneous immersion）字样，有的还刻有一圈红线或黑线标记，而且油镜的镜身较高倍镜和低倍镜为长。
在低倍物镜、高倍物镜和油镜3种物镜中，油镜的放大倍数和数值孔径（numberal aperture）最大，而工作距离最短（图3-1）。
图1-1 显微镜物镜参数图显微镜的分辨率是指显微镜能分辨出物体两点间最小距离（D）的能力。
D值愈小表明分辨率愈高。
D值与光线的波长（λ）成正比，与物镜的数值孔径（NA）成反比.从上式可看出，缩短光波长和增大数值孔径都可提高分辨率。
数值孔径指光线投射到物镜上的最大角度（称镜口角，α）的一半正弦与介质折射率（n）的乘积。
影响数值孔径大小的因数，一是镜口角，二是介质的折射率。
当镜与装片之间的介质为空气时，由于空气（n＝1.0）与玻璃（n＝1.52）的折射率不同，光线会发生折射，不仅使进入物镜的光线减少，降低了视野的照明度，而且会减少镜口角。
当以香柏油（n＝1.515）为介质时，由于它的折射率与玻璃相近，光线经过载玻片后可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射，不仅增加了视野的照明废，更重要的是通过增加数值孔径提高分辨率，因而可以使物像明亮清晰。
（二）革兰氏染色革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christain Gram创立的，是细菌学中最重要的鉴别染色法，其原理是利用细菌的细胞壁组成成分和结构的不同。
光学显微镜的使用及革兰氏染色法的实验收获
光学显微镜是一种常用的显微镜，用于观察微小物体的光学仪器。
使用光学显微镜时，首先需要将待观察的样品放置在载物片上。
然后，将载物片放置在显微镜的样品台上。
调节显微镜的照明系统，使样品得到适当的光源和光强。
接下来，调节目镜与物镜的对焦，使样品清晰可见。
通过调节物镜的倍率可以放大样品，并利用目镜观察样品细节。
革兰氏染色法是一种常用的细菌染色方法，用于区分细菌的形态特征。
革兰氏染色法包括以下步骤：
1. 取一片已涂制细菌液的载玻片。
2. 用火焰或消毒器加热使菌液固定在玻片上。
3. 滴加革兰氏染色液（由紫色的碘锕溶液和甲基紫溶液组成）在细菌上。
4. 具有吸附作用的碘锕溶液将染色液中的紫色结晶固定在细菌细胞质内。
5. 用洗涤溶液洗去多余的染色液。
6. 滴加酒精洗涤玻片，使染色细菌板根清晰可见。
7. 用洗涤溶液冲洗掉酒精，并使玻片表面干燥。
8. 傾倒碳素閃光粉從上方入光孔並從邊角掃入细菌上空显紫色。
9. 最后，用显微镜观察细菌的形态及染色情况，常见为革兰氏阳性细菌呈紫色，革兰氏阴性细菌呈红色。
革兰氏染色法的实验收获是区分细菌的形态特征。
通过革兰氏染色后，可以观察到不同类型的细菌细胞壁的反应，从而可以区分细菌属于革兰氏阳性细菌还是革兰氏阴性细菌。
这对于细菌鉴定和分类具有重要意义。
微生物学实验报告实验一普通光学显微镜的使用及细菌染色与形态观察第一部分：显微镜的使用一、目的要求1．熟悉普通光学显微镜的构造、油镜的使用原理和显微镜的维护方法。
2．学会正确使用油镜观察细菌的基本形态和特殊构造。
3．了解各种显微镜的主要特征。
二、实验原理（一）光学显微镜的构造微生物实验室中最常用的是普通光学显微镜，它的构造可分为机械部分和光学部分。
1、机械部分普通复式光学显微镜的机械部分通常包括以下几个部分：目镜、镜筒、基座回转器、物镜、载物台、光圈、聚光器、光源、镜臂、细调节器、粗调节器等。
2、光学部分：目镜、物镜、聚光器、光圈、光源。
（二）放大倍数标本首先经物镜放大，在目镜的焦距平面上形成一个实像，再经过目镜放大成最终的虚像。
总的放大倍数是物镜放大倍数与目镜放大倍数的乘积。
物镜的放大倍数愈大，其工作距离（物镜镜头到标本片之间的距离）愈短，这时光圈就要打开得愈大。
显微镜的性能受物镜的分辨距离或分辨力所限制。
分辨距离即透镜所能分辨的两个物点之间的最小距离，分辨距离愈小，透镜的分辨力愈高，物像也就愈清晰。
因此常以分辨距离来衡量显微镜的分辨力。
R=0.61λ/N.A式中：R-----分辨距离；λ------作用光的波长；N.A------数值口径。
一些介质的折射率介质折射率空气水玻璃香柏油1 13 55 1.56三、实验内容（一）材料：显微镜，香柏油，擦镜纸。
（二）方法：细菌很小，须使用油镜方可观察到。
油镜是显微镜上最重要的部件之一，观察时与玻片非常接近，稍不小心即可压碎玻片，更严重的是损坏镜头，故必须极其仔细地学习油镜的使用方法：1、为使低倍镜取得最适之光源，可将低倍镜头调节到离载物台约1cm的高度，将聚光器提高，光圈完全打开，然后调节电压旋钮至视野最合适。
2、滴一滴香柏油，固定于载物台上，用推动器调节到载物台正中。
在双目侧视下，下旋粗调节器，使油镜头浸入油中几乎与标本片相接触。
然后眼睛从目镜观察（如光线不足，可适当增大电源电压），徐徐上旋粗调节器至看到模糊物像之后，再用细调节器调节以使物像清晰。
【实验题目】普通光学显微镜的使用，单染色及革兰氏染色【实验目的】1. 学习并掌握显微镜的结构功能和使用。
2.学习微生物涂片、染色的基本技术。
3.学习掌握革兰氏染色法。
4.初步认识细菌的显微形态。
【实验器材】1、菌种：金黄色葡萄球菌（G+）、大肠杆菌（G-）、枯草芽孢杆菌以及自选菌种两种2、溶液和试剂：a) 草酸铵结晶紫染液、番红复染液等各种染料以及碘液、95%乙醇、无菌水等b) 香柏油、二甲苯3、仪器及其它用品：普通光学显微镜、擦镜纸、绸布、酒精灯、载玻片、接种针、培养皿等【实验原理】A、普通显微镜的基本原理1、基本原理现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来昂达成像，故又称为复式显微镜。
它们包括机械部分和光学部分两部分。
机械部分包括镜座、镜臂、镜筒、载物台、物镜转换器、粗调节螺旋、细调节螺旋、标本夹等。
光学部分包括接目镜、接物镜、反光镜、光圈（虹采）、聚光镜（集光器）等。
显微镜的放大效能（分辨率）是由所用光波长短和物镜数值口径决定，缩短使用的光波波长或增加数值口径可以提高分辨率，可见光的光波幅度比较窄，紫外光波长短可以提高分辨率，但不能用肉眼直接观察。
所以利用减小光波长来提高光学显微镜分辨率是有限的，提高数值口径是提高分辨率的理想措施。
要增加数值口径，可以提高介质折射率，当空气为介质时折射率为1，而香柏油的折射率为，和载片玻璃的折射率（）相近，这样光线可以不发生折射而直接通过载片、香柏油进入物镜，从而提高分辨率。
显微镜总的放大倍数是目镜和物镜放大倍数的乘积，而物镜的放大倍数越高，分辨率越高。
2、油镜微生物学使用的显微镜的物镜通常有低倍镜（10×）、高倍镜（40×）和油镜（100×），油镜是三者中放大倍数最大的，油镜的焦距和工作距离最短，油镜与其他物镜不同的是载玻片与物镜之间隔的不是一层空气（干燥系），而是一层油脂，称为“油浸系”。
由于香柏油与玻璃的折光率相似（香柏油为，玻璃为）。
镜检时，滴加香柏油的作用是使光源尽可能多的进入物镜中，避免光线通过折光率低的空气（折光率为）而散失，因而能提高物镜的分辨率，使物像明亮清晰（见下图）图2 介质为空气（A）与介质为香柏油（B）时光线通过的比较B、简单染色的原理细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。
细菌的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色。
利用单一染料对菌体进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构的方法叫做简单染色。
此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。
常用碱性染料进行简单染色，这是因为在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。
经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。
常用作简单染色的染料有美蓝、结晶紫、碱性复红等。
当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。
染色前必须固定细菌，其目的有二：一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上；二是增加其对染料的亲和力。
常用的有加热和化学固定两种方法。
固定时尽量维持细胞原有的形态。
C、革兰氏染色的基本原理革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。
革兰氏染色法不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G- 表示。
细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。
革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。
革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料初染液；媒染剂；脱色剂和复染液。
碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫。
媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘是常用的媒染剂。
脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95％的酒精。
复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G 和G-两大类群，常用的复染液是番红。
经此法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；细胞中初染剂被脱色剂洗脱而染上复染剂的颜色（红色）的细菌为革兰氏阴性菌。
G+ G- 1）G＋菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。
呈紫色。
2）Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，沙黄复染后呈红色。
【实验内容及步骤】A 显微镜的使用方法1、安放右手握住镜臂，左手托住镜座，使镜体保持直立。
桌面要清洁、平稳，要打开实验台上的灯光。
2、低倍镜观察先将低倍物镜的位置固定好，然后放置标本片，转动调光旋钮（可变电压调节旋钮），调好光线，将物镜提高，向下调至看到标本，再用细调对准焦距进行观察。
3、高倍镜观察显微镜的设计一般是共焦点的。
低倍镜对准焦点后，转换到高倍镜基本上也对准焦点，只要稍微转动微调即可。
4、油浸镜观察油浸镜的工作距离很小，所以要防止载皮片和物镜上的透镜损坏。
使用时，一般是经低倍、高倍到油浸镜。
当高倍物镜对准标本后，再加油浸镜观察。
载玻片标本也可以不经过低倍和高倍物镜，直接用油浸镜观察。
显微镜有自动止降装置的，载玻片上加油以后，将油浸镜下移到油滴中，到停止下降为止，然后用微调向上调准焦点。
没有自动止降装置的，对准焦点的方法是从显微镜的侧面观察，将油浸镜下移到与载玻片稍微接触为止，然后用微调向上提升调准焦点。
使用油浸镜时，镜台要保持水平，防止油流动。
油浸镜所用的油要洁净，聚光镜要提高到最高点，并放大聚光镜下的虹彩光圈，否则会降低数值口径而影响分辨率。
无论是油浸镜或高倍镜观察，都宜用可调节的显微镜灯作光源。
B 简单染色1、流程图：、2、具体步骤：1)洗片、干燥取一块载玻片，用水浸湿，用手使用去污粉洗净玻片，竖立在一边自然干燥。
干燥后在玻片的一面用记号笔做好标记。
方便以后水洗染料，避免洗去细菌。
2)涂片取一块载玻片，在上边用胶头滴管加半滴无菌水，用接种环无菌操作将沾有菌的接种环置于载玻片上的无菌水种涂抹，待看到微弱的浑浊即可；（注意取菌不要太多，但是大肠杆菌较小，为短杆状，可适当多取）；3)干燥与固定涂菌面朝上，通过火焰以干燥并固定菌物，固定过程应使载玻片通过火焰2-3次，注意温度的控制，过热的温度会将细菌杀死，温度以手背感觉微微发烫为标准；4)染色将载玻片平放于载波片支架上，滴加结晶紫染液覆盖涂菌部位即可，染色1-2min5)水洗倾去染液，将载玻片的涂菌面朝下，自来水冲洗，水流不宜太急、太大，至洗出水无色为止；6)干燥用吸水纸吸去多余水分后自然干燥；7)镜检将制备好的样片置于显微镜下进行观察，先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油，用油镜观察细菌的形态。
c ） 革兰氏染色1、流程图：2、 重要步骤：1)洗片、干燥取一块载玻片，用水浸湿，用手使用去污粉洗净玻片，竖立在一边自然干燥。
干燥后在玻片的一面用记号笔做好标记。
方便以后水洗染料，避免洗去细菌。
2) 涂片在标记的载玻片一侧分别滴加半滴无菌水。
分别取6种活跃生长期菌种（金黄色葡萄球菌，大肠杆菌（1），大肠杆菌（2），枯草芽孢杆菌，自选菌（1），自选菌（2））按常规方法涂片（不宜过厚）。
3)加热、固定用酒精灯按照简单染色中所述干燥和固定的方法对6种菌进行干燥和固定。
4) 初染滴加草酸铵结晶紫染液使之覆盖涂菌部位，染色后水洗；5) 媒染先用碘液冲去残留水迹，再用碘液覆盖1min 后水洗；6) 脱色先用乙醇冲去水迹，然后用95%乙醇覆盖脱去色素，脱色约30s ，立即用水冲洗；7) 复染先用番红洗去水迹，然后滴加番红复染2min 后水洗；8) 镜检将制备好的样片置于显微镜下进行观察，先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油，用油镜观察细菌。
分别以大肠杆菌与金黄色葡萄球菌所染颜色作为对照，来判断枯草杆菌以及另一种自选菌的染色结果。
【结果分析】1、 实验图示加热、固定 洗片、干燥 涂片初染 水洗 媒染 水洗 脱色 水洗 复染干燥镜检金色球葡萄球菌大肠杆菌（1）大肠杆菌（2）枯草杆菌自选菌（1）自选菌（2）革兰氏染色结果金黄色葡萄球菌大肠杆菌（1）大肠杆菌（2）枯草芽孢杆菌自选菌（1）自选菌（2）2、实验结果革兰氏染色结果3、实验结果分析本次实验通过对简单染色及革兰氏染色的学习使我们对革兰氏染色的原理及操作步骤有了初步的认识。
而且实验结果让我们对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的外部形态以及革兰氏阳性与阴性有了一个初步的了解。
并且可以通过自己对未知菌进行革兰氏染色来判断其细胞壁的性质及结构。
实验结果表明，金黄色葡萄球菌为一般聚集成团，大肠杆菌为椭圆状短杆菌而枯草芽孢杆菌为双杆菌，同时他们分别为革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。
自选菌革兰氏染色呈紫色，可初步断定其为阳性菌，其细胞形态和金黄色葡萄球菌极为相似，可能为金黄色葡萄球菌。
【思考与讨论】1、革兰氏染色是否成功。
有哪些问题需要注意A、滴在载物板上的水滴滴加时应用点滴法，避免水滴过大占用空间，难以干燥并且可能造成不同编号之间造成交叉污染。
B、加热干燥时，应用手背试温，避免因为温度过高烧干细菌，导致细菌细胞形态发生显着变化，影响观察。
C、在进行染色是应当严格控制时间，酒精脱色时间不宜过长，否则易造成假阴性。
D、在冲洗结晶紫，碘液，95%乙醇、番红的时候，应采用缓慢的水流冲洗载玻片背部，是水流分支冲洗正面即可，不可用水流直接冲洗载玻片正面。
E、冲洗染料的程度为：沿载玻片边缘流下的水滴呈无色即可。
F、在加入碘液媒染、酒精脱色时，应当先用相应试剂冲洗载玻片正面，防止玻片上的水将试剂稀释，再用试剂覆盖细菌，开始计时。
2、现有一株未知杆菌，个体明显大于大肠杆菌，如何鉴定它是革兰氏阳性还是阴性，如何确定你的染色结果的正确性可以进行革兰氏染色的对照实验。
