硫酸铵纯化抗体

饱和硫酸铵纯化单克隆抗体流程一、简介单克隆抗体是一种由单一B细胞克隆产生的抗体，具有高度的特异性和亲和力。

在生物制药领域，单克隆抗体已被广泛用于药物研发和治疗。

然而，采用传统的纯化技术得到的单克隆抗体通常含有一定量的杂质，影响其应用效果。

为了获得纯度较高的单克隆抗体，科研工作者通常采用饱和硫酸铵纯化技术进行单克隆抗体的纯化。

二、饱和硫酸铵纯化单克隆抗体流程2.1 杂质蛋白析出将单克隆抗体溶液缓冲至适当的pH值，并加入饱和硫酸铵溶液。

随后，将混合溶液在4摄氏度条件下离心，将上清液收集。

经离心后沉淀物中富集了大部分杂质蛋白，而单克隆抗体主要存在于上清液中。

2.2 上清液浓缩将上清液经过适当方法（如超滤、凝胶过滤等）浓缩，得到单克隆抗体的浓缩液。

2.3 离子交换层析将单克隆抗体的浓缩液上样在离子交换色谱柱上，通过调整缓冲液pH 值和浓度，使得单克隆抗体在色谱柱上进行吸附和洗脱。

利用离子交换层析技术可以有效地去除多余的离子和杂质蛋白。

2.4 尺寸排除层析将经过离子交换层析的单克隆抗体样品再次上样在尺寸排除色谱柱上，此时主要目的是将单克隆抗体进行分离和纯化。

2.5 扩大规模经过以上工艺步骤纯化得到的单克隆抗体样品可以通过适当的方法进行扩大规模，以满足药物研发或临床治疗的需要。

三、流程优势饱和硫酸铵纯化单克隆抗体的流程具有以下优势：3.1 高纯度通过饱和硫酸铵纯化技术可以有效地除去多余的离子和杂质蛋白，提高单克隆抗体的纯度。

3.2 高产率饱和硫酸铵纯化技术操作简单，产率较高，适用于商业化生产。

3.3 可扩展性该纯化技术可以根据需要进行规模化生产，适用于临床治疗和药物研发。

四、总结饱和硫酸铵纯化单克隆抗体是一种常用且有效的纯化技术，可以得到高纯度、高产率的单克隆抗体样品。

在未来的生物制药领域，该技术有望得到更广泛的应用，并为生物药物的研发和生产提供重要支持。

对于饱和硫酸铵纯化单克隆抗体流程，虽然具有诸多优势，但在实际操作中仍面临一些挑战和改进空间。

IgG的分离与提纯-硫酸铵沉淀法以抗原免疫动物来制备的抗血清是一个非常复杂的混合物，包括血清的全部成分。

但是同抗原特异性结合的抗体则主要是血清中的免疫球蛋白组分。

通常用于制备酶标抗体或荧光抗体的免疫球蛋白必须高度纯化并具有特异性，不应含有非抗体的血清蛋白。

因此，为了浓缩和提高抗体的效价，或为制备免疫球蛋白特异性抗体时，通常也需要分离和纯化免疫球蛋白。

γ球蛋白（IgG）是血清免疫球蛋白的主要成分，约占全部免疫球蛋白的75％，因此，抗体的分离纯化主要是分离纯化IgG。

纯化IgG小量几十ml的话，用protein A或protein G就可以，疏水柱等也可以纯化；大量的话，上百ml，可以使用streamline protein A。

之前根据载量估计一下需要的柱子体积。

实验室中常用硫酸铵沉淀后过DEAE 纤维素柱，比较简便可获较纯的抗体。

下面以此方法为例介绍IgG的分离与提纯。

材料与试剂配制1. 动物血清2. 硫酸铵饱和溶液硫酸铵800g~850gH2O 1 000ml加热至绝大部分溶质溶解为止，趁热过滤，置室温过夜，然后以28％NH4OH调pH至7.0（不调pH值也可以）。

注：硫酸铵以质量优者为佳，因次品中含有少量重金属对蛋白质巯基有影响。

如次品必须除去重金属，可在溶液中通入H2S，静置过夜后滤过，加热蒸发H2S即可。

3. 0.01Mol/L pH7.4PB液A液：0.10Mol/L NaH2PO4液NaH2PO4·2H2O 15.60g加H2O至1 000.mlB液：0.10Mol/L Na2HPO4液Na2HPO4·12H2O 35.80g加H2O至1 000ml取A液19ml，B液81ml加水至1 000ml即可。

4. 1％BaCl2溶液5. 纳氏液HgI 115.00gKI 80.00g加H2O至500.00ml溶化后过滤，然后再加20％NaOH500.00ml，混合即可。

辛酸-硫酸铵法纯化单克隆抗体辛酸-硫酸铵法纯化单克隆抗体(一) 原理蛋白质在溶液中的溶解度取决于蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度, 以及蛋白质分子带有的电荷。

如改变这两个因素,蛋白质就容易沉淀折出。

引起蛋白质沉淀的主要方法有(1) 盐析, 即加入大量中性盐破坏蛋白质的胶体稳定性而使其析出, 沉淀不同蛋白质所需盐浓度及pH 值不同;(2) 生物碱以及某些酸类, 在pH 值小于等电点时可以与蛋白质形成不溶的盐使其沉淀;(3) 重金属离子如隶、铅、铜、银等, 在pH 值大于等电点时可以与蛋白质结合成不溶的盐使其沉淀;(4) 有机溶剂如酒精、甲醇、丙酮等, 对水的亲和力很大, 能破坏蛋白质水化膜, 在等电点时使蛋白质沉淀。

辛酸(caprylic acid) 在偏酸条件下能与血清或腹水中除IgG外的其他蛋白质结合并将其沉淀下来,IgG 则溶于上清液中, 再用硫酸镀盐析, 即可达到纯化IgG 的目的。

辛酸-硫酸铵法是目前实验室中较常用的纯化单克隆抗体的方法, 利用该方法纯化单克隆抗体, 回收率和纯度都可达80% 以上。

(二) 试剂和器材1. 试剂(1) 小鼠腹水。

(2) 硫酸铵或饱和硫酸铵溶液。

称(NH4)2S04(AR)400~425 克, 以50 ℃~80 ℃蒸馆水500ml溶解, 搅拌2O min, 趁热过滤。

冷却后以浓氨水(15M NH40H) 调pH 值至7.4 。

配制好的饱和硫酸铵, 瓶底应有结晶析出。

(3)0.06M pH 4.8 醋酸盐缓冲液。

贮存液: A 液,0.06M NaAc: 无水NaAc0.49218g 加蒸馆水至100mlB 液,0.06M HAc: 冰醋酸0.344ml 加蒸馆水至100ml应用液: 取上述 A 液59ml 与B 液41ml 昆合, 用5M NaOH 调pH 值至4.80.(4)0.lM pH 7.4 磷酸盐缓冲液(PBS). 取Na2HP04 · 12H2028.94g,KH2P04 2.61g, 加蒸馆水至100Om1(5) 含137mM NaCl 2.6mM KCl 0.2mM EDTA 的pH 7.4 磷酸盐缓冲液(PBS): 取Na2HP04 12H20 28.94g KH2P04 2.61g NaC1 8.Og 、KCl 0.2g EDTA 0.06g, 加蒸馆水至100Oml2. 器材普通冰箱、低温离心机、电磁搅拌器, 紫外分光光度计、天平; 透析袋、塑料夹、精密pH 试纸; 烧杯、量桶、吸管、滴管、小瓶等。

辛酸-硫酸铵法纯化单克隆抗体??辛酸-硫酸铵法纯化单克隆抗体(一) 原理蛋白质在溶液中的溶解度取决于蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度, 以及蛋白质分子带有的电荷。

如改变这两个因素,蛋白质就容易沉淀折出。

引起蛋白质沉淀的主要方法有(1) 盐析, 即加入大量中性盐破坏蛋白质的胶体稳定性而使其析出, 沉淀不同蛋白质所需盐浓度及pH 值不同;(2) 生物碱以及某些酸类, 在pH 值小于等电点时可以与蛋白质形成不溶的盐使其沉淀;(3) 重金属离子如隶、铅、铜、银等, 在pH 值大于等电点时可以与蛋白质结合成不溶的盐使其沉淀;(4) 有机溶剂如酒精、甲醇、丙酮等, 对水的亲和力很大, 能破坏蛋白质水化膜, 在等电点时使蛋白质沉淀。

辛酸(caprylic acid) 在偏酸条件下能与血清或腹水中除IgG外的其他蛋白质结合并将其沉淀下来,IgG 则溶于上清液中, 再用硫酸镀盐析, 即可达到纯化IgG 的目的。

辛酸-硫酸铵法是目前实验室中较常用的纯化单克隆抗体的方法, 利用该方法纯化单克隆抗体, 回收率和纯度都可达80% 以上。

(二) 试剂和器材1. 试剂(1) 小鼠腹水。

(2) 硫酸铵或饱和硫酸铵溶液。

称(NH4)2S04(AR)400~425 克, 以50 ℃~80 ℃蒸馆水500ml溶解, 搅拌2O min, 趁热过滤。

冷却后以浓氨水(15M NH40H) 调pH 值至7.4 。

配制好的饱和硫酸铵, 瓶底应有结晶析出。

(3)0.06M pH 4.8 醋酸盐缓冲液。

贮存液: A 液,0.06M NaAc: 无水NaAc0.49218g 加蒸馆水至100mlB 液,0.06M HAc: 冰醋酸0.344ml 加蒸馆水至100ml应用液: 取上述 A 液59ml 与 B 液41ml 昆合, 用5M NaOH 调pH 值至 4.80.(4)0.lM pH 7.4 磷酸盐缓冲液(PBS). 取Na2HP04 · 12H20 28.94g,KH2P04 2.61g, 加蒸馆水至100Om1(5) 含137mM NaCl 2.6mM KCl 0.2mM EDTA 的pH 7.4 磷酸盐缓冲液(PBS): 取Na2HP04 12H20 28.94g KH2P04 2.61g NaC1 8.Og 、KCl 0.2g EDTA 0.06g, 加蒸馆水至100Oml2. 器材普通冰箱、低温离心机、电磁搅拌器, 紫外分光光度计、天平; 透析袋、塑料夹、精密pH 试纸; 烧杯、量桶、吸管、滴管、小瓶等。

抗体的纯化( 硫酸铵沉淀法）一，基本原理硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。

用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。

高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。

各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。

这种方法称之为盐析。

盐浓度通常用饱和度来表示。

硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。

二，试剂及仪器1 . 组织培养上清液、血清样品或腹水等2. 硫酸铵（NH 4 ）SO 43. 饱和硫酸铵溶液（SAS ）4. 蒸馏水5. PBS( 含0.2g /L 叠氮钠)6. 透析袋7. 超速离心机8. pH 计9. 磁力搅拌器三，操作步骤以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。

各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸铵的饱和度也不完全相同。

通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为33% —50% 。

（一）配制饱和硫酸铵溶液（SAS ）1.将767g （NH 4 ）2 SO 4 边搅拌边慢慢加到1 升蒸馏水中。

用氨水或硫酸调到硫酸pH7.0 。

此即饱和度为100% 的硫酸铵溶液（4.1 mol/L, 25 °C ）.2.其它不同饱和度铵溶液的配制（二）沉淀1.样品（如腹水）20 000 ′g 离心30 min ，除去细胞碎片；2.保留上清液并测量体积；3.边搅拌边慢慢加入等体积的SAS 到上清液中，终浓度为1 ：1 （4.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6 小时或搅拌过夜（4 °C ），使蛋白质充分沉淀。

（三）透析1.蛋白质溶液10 000 ′g 离心30 min （4 °C ）。

弃上清保留沉淀；2.将沉淀溶于少量（10-20ml ）PBS -0.2g /L 叠氮钠中。

沉淀溶解后放入透析袋对PBS -0.2g /L 叠氮钠透析24-48 小时（4 °C ），每隔3-6 小时换透析缓冲液一次，以彻底除去硫酸氨；3.透析液离心，测定上清液中蛋白质含量。

饱和硫酸铵纯化血清中抗体1实验原理此方法可以将主要的免疫球蛋白从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。

高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。

硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。

2实验试剂与器材2.1实验试剂：硫酸铵、氨水、盐酸、1XPBS溶液（PH7.4）、2% NaHCO3 、1mmol/LEDTA(PH8.0)、1mol/LNaOH、氯化钡、蒸馏水2.2实验器材：磁力搅拌器、低温离心机、4℃冰箱、PH计、离心管、锥形瓶、搅拌棒、量筒、烧杯、漏斗、移液器、电磁炉、铝锅、剪刀、试剂瓶、透析袋夹子2.3样品抗血清3实验步骤3.1配制溶液3.1.1 配制饱和硫酸铵溶液，25℃时饱和溶解度是767g/L，0℃时为676g/L(见附表)。

配制1000ml饱和硫酸铵，将800g左右的硫酸铵加入到1L水中，加热搅拌到大部分固体溶解，趁热过滤并室温冷却，仍会有晶体析出，再用氨水调节PH 至8.5，4℃保存备用（可以根据所需量按比例调整所配溶液量）。

3.1.2 配制1XPBS溶液（PH7.4）取1.44gNa2HPO4（或3.63gNaHPO4.12H2O），0.24gKH2PO4，8gNaCl，0.2gKCl，加入800ml水中，用盐酸调PH至7.4，补蒸馏水至1000ml，高压蒸汽灭菌。

4℃保存。

3.1.3 配制2% NaHCO3，2g NaHCO3加入到100ml蒸馏水中。

3.1.4 配制1mol/LNaOH，4gNaOH慢慢加入80ml蒸馏水中，边加入边搅拌，完全溶解后定容至100ml，室温保存，无需除菌。

注意放热反应，塑料烧杯储存。

3.1.5 配制1mmol/LEDTA(PH8.0)，先配储存液：EDTA(0.5mol/L)：Na2·EDTA·2HO 37.2g +20g NaOH 配成大约80ml2溶液（注：液体+粉末混合体积会增加），再用NaOH溶液调节PH为8.0，定容至100ml，可以在水浴50℃中溶解。

抗体的提取与纯化精制免疫球蛋白的方法很多。

一般采用综合技术，避免蛋白变性。

如分离IgG时，多结合使用盐析法与离子交换法，以求纯化。

提取IgM的方法也很多，如应用凝胶过滤与制备电泳法，或离子交换与凝胶过滤等。

一、盐析法1.取x ml血清加x ml生理盐水，于搅拌下逐滴加入2x ml饱和硫酸铵，硫酸铵的终饱和度为50%。

4℃，3h以上，使其充分沉淀。

2.离心（3000rpm）,20min,充上清，以x ml生理盐水溶解沉淀，再逐滴加饱和硫酸铵x/2ml。

置4℃3h以上（此时硫酸铵的饱和度为33%）。

3.重复上述第二步过程1～2次。

末次离心后所得沉淀物为γ-球蛋白，以 pH7.4 PBS溶解至x ml装入透析袋。

4.对PBS充分透析、换液3次，至萘氏试剂测透析外液无黄色，即无NH4+为止。

5.取透析袋内样品少许作适当倍数稀释后，以751型紫外分光光度计测定蛋白含量。

影响盐析的因素很多，如蛋白质的浓度，盐的浓度，饱和度和pH，温度等都可影响盐析的结果，操作时要充分注意。

（1）蛋白质的浓度盐析时，溶液中蛋白质的浓度对沉淀有双重影响，既可影响蛋白质沉淀极限，又可影响蛋白质的共沉作用。

蛋白质浓度愈高，所需盐的饱和度极限愈低，但杂蛋白的共沉作用也随之增加，从而影响蛋白质的纯化。

故常将血清以生理盐水作对倍稀释后再盐析。

（2）离子强度各种蛋白质的沉淀要求不同的离子强度。

例如当硫酸铵饱和度不同，析出的成分就不同，饱和度为50％时，少量白蛋白及大多数拟球蛋白析出；饱和度为33％时γ球蛋白析出。

（3）盐的性质最有效的盐是多电荷阴离子。

（4）PH值一般说来，蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度越大。

改变PH改变蛋白质的带电性质，也就改变了蛋白质的溶解度。

（5）温度盐析时温度要求并不严格，一般可在室温下操作。

血清蛋白于25℃时较0℃更易析出。

但对温度敏感的蛋白质，则应于低温下盐析。

（6）蛋白质沉淀后宜在4℃放3小时以上或过夜，以形成较大沉淀而易于分离。

抗体的纯化方法很多,最为常用的为以下四种方法，基于工业化生产工艺开发的规模化生产方法要比这些复杂得多，甚至多个纯化策略联合使用，有兴趣的科研工作者可以查阅相关的文献。

1）沉淀法：利用抗体蛋白疏水性不同，提高盐离子浓度蛋白沉淀，常用的沉淀方法有硫酸铵沉淀法、辛酸沉淀法、辛酸-硫酸铵沉淀法、优球蛋白沉淀法和聚乙二醇沉淀法；这类纯化各有各的优缺点，往往对某些亚型抗体有偏爱性。

2）广谱亲和纯化：这类纯化主要是利用金黄色葡萄球菌ProteinA /G蛋白可以特异性与抗体的Fc结合的原理进行的。

3）抗原特异性纯化：将特异性的抗原偶联到琼脂糖凝胶等固相载体上，纯化方法与ProteinA /G纯化方法相同。

4）离子交换法：DEAE-Sephadex A-50（二乙氨基—乙基-葡萄糖凝胶A-50）为弱碱性阳离子交换剂。

用NaOH 将Cl-型转变为OH-型后，可吸附酸性蛋白。

血清中的γ球蛋白属于中性蛋白（等电点为pH6.85～7.5），其余均属酸性蛋白。

pH7.2～7.4的环境中，酸性蛋白均被DEAE- Sephadex A-50吸附，只有γ球蛋白不被吸附。

因此，通过柱层析，γ球蛋白便可在洗脱中先流出，而其他蛋白则被吸附在柱上，从而便可分离获得纯化的IgG。

1. (NH4)2SO4沉淀法纯化抗体1.1 饱和硫酸铵配制：无菌去离子水加入足量硫酸铵之后，加热到65℃以上，在磁力搅拌器上搅拌溶解至底部仍有未溶解的硫酸铵，待冷却后，取上清滤纸过滤。

1.2 样品（血清或腹水），12,000rpm离心30min（4℃），除去细胞碎片，保留上清液并测量体积。

1.3 边搅拌边缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液到上清液中，溶液放在磁力搅拌器上室温搅拌6h或搅拌过夜（4℃），使蛋白质充分沉淀。

1.4 蛋白溶液12,000rpm离心30min（4℃），沉淀用原样品体积的PBS溶液重悬，重悬后12,000rpm离心10min（4℃），上清转移到一个新离心管。