布鲁氏菌实时定量荧光 PCR 检测体系的建立及应用

动物布鲁氏菌病快速诊断方法研究进展吴彤;王慧煜;吴绍亮;崔金磊;杨晓野;吴绍强【摘要】布鲁氏菌病是一种流行范围广、危害严重的人畜共患传染病.近年来,布鲁氏菌病的人畜疫情在国内外均出现回升势头,严重影响了流行地区的养殖产业发展,并引发严重的公共卫生问题.因此,该病的快速准确检测能为预防、治疗提供早期、有效的疫病信息.鉴于布鲁氏菌病危害的严重性,建立快速有效的检测方法是十分必要的,是布鲁氏菌病早期诊断和疾病控制的关键.本文将对多重PCR、实时定量荧光PCR、LAMP等分子生物学检测方法以及ELISA、胶体金试纸条等免疫学检测方法两个方面对布鲁氏菌病快速检测方法的研究进展进行综述.其中LAMP方法和胶体金免疫层析法对布病的检测更加适合在基层的推广和使用,并且免疫层析技术正朝着定量、高灵敏度、多标记检测等方向发展.【期刊名称】《中国人兽共患病学报》【年(卷),期】2016(032)008【总页数】6页(P746-750,759)【关键词】布鲁氏菌病;多重PCR;荧光PCR;环介导等温扩增反应;酶联免疫吸附试验;胶体金试纸条;诊断【作者】吴彤;王慧煜;吴绍亮;崔金磊;杨晓野;吴绍强【作者单位】内蒙古农业大学兽医学院,呼和浩特010000;中国检验检疫科学研究院动物检疫研究所,北京100029;中国检验检疫科学研究院动物检疫研究所,北京100029;山东省临沭县人民医院,临沭 276700;内蒙古农业大学兽医学院,呼和浩特010000;内蒙古农业大学兽医学院,呼和浩特010000;内蒙古农业大学兽医学院,呼和浩特010000【正文语种】中文【中图分类】R378布鲁氏菌病，简称布病，是由布鲁氏菌属细菌引起的重大人兽共患疾病。

该病是OIE法定上报动物疫病，我国将其列为二类动物疫病。

布鲁氏菌病严重影响着家畜的生产力和动物性产品的生物安全，给畜牧业发展造成严重的经济损失, 而且严重危害人类的健康。

进入21世纪，布病疫情日趋加重，呈现从牧区、半牧区向农区甚至城市蔓延的趋势，被WHO称为“再度肆虐”的传染病。

实时荧光定量PCR的研究进展及其应用一、本文概述实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative PCR，简称qPCR）是一种在分子生物学领域广泛应用的分子生物学技术，它能够在PCR 扩增过程中实时监测反应产物的积累，从而精确地定量目标DNA或RNA的初始浓度。

自20世纪90年代诞生以来，qPCR技术以其高灵敏度、高特异性、快速性和定量准确等优点，在基因表达分析、病原体检测、基因型鉴定、基因突变分析、药物研发等多个领域发挥了重要作用。

随着技术的不断发展和完善，实时荧光定量PCR已成为现代生物学研究中不可或缺的工具。

本文旨在全面综述实时荧光定量PCR技术的最新研究进展，包括其原理、方法、技术优化、应用领域的拓展以及面临的挑战等。

文章首先简要介绍qPCR技术的基本原理和常用方法，然后重点论述近年来在技术优化、多重PCR、数字化PCR等方向上的进展。

接着，本文详细探讨实时荧光定量PCR在基因表达分析、病原体检测、基因型鉴定、基因突变分析、药物研发等领域的应用案例和前景。

文章还将讨论实时荧光定量PCR面临的挑战，如引物设计、数据分析等问题，并提出相应的解决方案。

通过本文的综述，读者可以对实时荧光定量PCR技术的最新进展和应用有一个全面的了解，为相关研究提供参考和借鉴。

二、实时荧光定量PCR的基本原理与技术特点实时荧光定量PCR（Real-time Fluorescent Quantitative PCR，简称qPCR）是一种在PCR扩增过程中，通过对荧光信号的实时检测，对特定DNA片段进行定量分析的技术。

其基本原理是利用荧光染料或荧光标记的特异性探针，在PCR反应过程中实时检测PCR产物量的变化，从而得到DNA模板的初始浓度。

实时性：通过荧光信号的实时检测，可以实时了解PCR产物的生成情况，无需PCR结束后进行电泳等后续操作，大大缩短了实验时间。

定量性：通过标准曲线的建立，可以准确地计算出DNA模板的初始浓度，实现了PCR的定量分析。

实时荧光定量PCR技术的原理及应用在PCR扩增反应结束之后，可对扩增产物进行定性和定量的分析。

但是无论定性还是定量分析，分析的都是PCR终产物。

但是在许多情况下，我们所感兴趣的是未经PCR扩增之前的起始模板量。

例如我们想知道某一转基因动植物转基因的拷贝数或者某一特定基因在特定组织中的表达量。

在这种需求下荧光定量PCR技术应运而生。

实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，实现了PCR从定性到定量的飞跃。

1.实时荧光定量PCR技术的基本原理在实时荧光定量PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。

所谓实时荧光定量PCR技术，是指通过对PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。

每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。

一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段, 荧光信号指数扩增阶段和平台期。

在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化。

而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加，PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA 拷贝数。

只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进行定量分析。

在扩增曲线中：荧光阈值(threshold)是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，荧光阈值的缺省设置是3～15个循环的荧光本底信号(baseline)标准差的10倍；Ct值的含义是指在PCR循环过程中,荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数,也就是每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环次数；Rn+表示每点测量的荧光强度,代表反应管含有模板DNA ;Rn-表示荧光基线强度,代表反应管不含有模板DNA,其在理想情况下是一条平线,只具有背景荧光数值;ΔRn表示PCR过程中,探针降解的量,也即PCR产物的量；基线( baseline)是背景曲线的一段,范围为从反应开始不久荧光值开始变得稳定,到所有反应管的荧光都将要但是还未超出背景。

实时荧光定量PCR的原理及应用导读实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光集团，利用荧光信号来实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板浓度进行定量分析。

其特点有：(1)用产生荧光信号的指示剂显示扩增产物的量，进行实时动态连续的荧光监测，避免终点定量的不准确性，并且消除了标本和产物的污染，且无复杂的产物后续处理过程。

(2)荧光信号通过荧光染料嵌入双链DNA，或荧光探针特异结合木得检测物等方法获得，打打提高了检测的灵敏度、特异性和精确性。

Real-time O-PCR可以应用于mRNA表达的研究、DNA拷贝数的检测、单核苷酸多态性的测定、细胞因子的表达分析、肿瘤耐药基因表达的研究以及病毒感染的定量监测。

实时荧光定量PCR技术的基本原理在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光基团，这些荧光物质有其特定的波长。

仪器可以自动检出，利用荧光信号积累，实时监测整个PCR进程，在PCR循环中，测量的信号将作为荧光阈值的坐标。

并且引入一个——Ct值（Threshold cycle）概念，Ct值是指产生可被检测到得荧光信号所需的最小循环数，是在PCR循环过程中荧光信号由本底开始进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。

荧光阈值相当于基线荧光信号的平均信号标准偏差的10倍。

一般认为在荧光阈值以上所测出的荧光信号是一个可信的信号，可以用于定义一个样本的Ct值。

通常用不同浓度的标准样品的Ct值来产生标准曲线，然后计算相对方程式。

方程式的斜度可以用来检查PCR的效率，所有标准曲线的线性回归分析需要存在一个高相关系数（R²＞0.99），这样才能认为实验的过程和数据是可信的，使用这个方程式计算出未知样本的初始模板量。

实时荧光定量PCR仪都有软件，可以从标准曲线中自动地计算出未知样本的初始模板量。

实时荧光定量PCR技术的应用1. 基因工程研究领域①基因表达研究：对β地中海贫血症患者β与γ珠蛋白mRNA 水平进行检测，其结果特异性强、定量准确，为了解β地中海贫血的分子病理机制及其临床诊断提供了可靠的检测数据。

布鲁氏菌病PCR检测的临床意义姚馨月;郑文艳【期刊名称】《内蒙古医学杂志》【年(卷),期】2016(048)002【总页数】4页(P189-192)【关键词】布鲁氏菌;PCR;诊断【作者】姚馨月;郑文艳【作者单位】内蒙古医科大学,内蒙古呼和浩特010059;中国人民解放军第253医院感染科,内蒙古呼和浩特010010【正文语种】中文【中图分类】R378.5布鲁氏菌病(brucellosis,简称布病)是由布鲁氏菌感染引起的人畜共患传染-变态反应性疾病[1]。

世界动物卫生组织(OIE)将其列为重要传染病，属于《中华人民共和国传染病防治法》规定的乙类传染病，并列为《家畜家禽防疫条例实施细则》中二类传染病中之首[2～4]。

布病在我国的整体流行趋势呈现出老疫区死灰复燃，新疫区范围扩大[5]。

布鲁氏菌病潜伏期为1～3周，初期症状类似重感冒，如发热、关节疼痛、疲劳、乏力、多汗、肝脾肿大等症状。

临床症状极不典型，在诊疗过程中易造成误诊，急性期布病如不及时诊断极易发展为慢性期。

慢性布病患者往往都会伴有不同程度的骨关节系统病变[6]。

本病的致命性并发症为中枢神经系统病变及心肌病变[7]。

所以布病的早期诊断，就变的尤为重要。

我国CDC布病诊断标准为：(1)流行病学接触史：密切接触家畜、野生动物、布鲁菌培养物等，或生活在疫区的居民；(2)临床症状和体征排除其他疑似疾病；(3)实验室检查：病原分离、试管凝集实验、补体结合实验、抗人球蛋白阳性。

凡具备第(1)、(2)项和第(3)项中的任何一项检查阳性即可确诊为布病。

布病的实验室检查方式是确诊布病的关键证据。

诊断布病的“金标准”是病原分离，但病原分离要求在P3级生物实验室进行，对实验室操作人员有较高的专业技术要求，耗时长，最终的菌落形态不易辨认，且有明显的操作暴露危险，增大医源性感染的可能。

在基层不易推广。

培养的阳性率极低。

1.1 凝集实验SAT一直是各国用作诊断布病的常规血清学诊断方法，我国更是将其列为了诊断布病的法定检测方法[8]。

三种奶牛常见病菌多重PCR诊断方法的建立高瑞娜;张婷【摘要】根据GenBank公布的布鲁氏菌Bcsp31、牛分枝杆菌pncA、炭疽杆菌capA三种特异基因的保守序列分别设计引物,在引物前添加通用引物(Tag),建立3种奶牛常见病菌的多重实时荧光定量PCR方法;通过构建3种病菌PCR扩增目的基因的质粒用于制备标准品进行敏感性验证;利用大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌用于特异性试验,并对30份样本进行了检测.结果表明,本研究构建的多重实时荧光定量PCR检测时间仅需2h,灵敏度为100个拷贝/uL,与其它细菌无交叉反应,特异性为100％,阳性检出率为88.89％.因此,本试验成功建立了检测3种奶牛常见病菌早期诊断的方法,可以在奶牛养殖中应用.【期刊名称】《畜牧兽医杂志》【年(卷),期】2015(034)004【总页数】5页(P15-18,22)【关键词】奶牛;布鲁氏菌;牛分枝杆菌;炭疽杆菌;多重实时荧光定量PCR【作者】高瑞娜;张婷【作者单位】朔州职业技术学院生物工程系,山西朔州036000;新乡医学院三全学院生命科学技术学院【正文语种】中文【中图分类】S854.43近年来我省牛人畜共患病呈回升趋势，布病老疫区死灰复燃，新疫区不断出现，疽、牛结核病和布病还危害其它动物，一旦出现只能扑杀，这不但给我省北部地区牛羊养殖业带来了巨大的损害，还可以通过各种途径传染给人，人们饮用未经消毒的病牛奶就可被传染结核病和布病并引起流行。

所以这几种人兽共患病的存在严重威胁着人类的健康，而人畜的交叉传播则造成了它们的广泛流行。

因此，对引起这些感染的细菌正确快速的鉴别极为重要。

传统的分离培养及血清学检测方法费时繁琐，导致检测不及时，灵敏度不够。

近年来，检测方法在不断的进步，特别是基于聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）的分子诊断法具有快速、灵敏、特异等显著特点，已成为人畜微生物检测的新标准。

布鲁氏菌PCR鉴定方法的研究与应用石丽瑞1，韩惠瑛2，李秀华1，孟日增3（1.山西省阳泉市农业委员会，山西阳泉045000；2.动物疫病预防控制中心，山西太原030027；3.吉林出入境检验检疫局，吉林长春130062）摘要：目的：分析采用PCR法对于布鲁氏菌的鉴定诊断价值以及实用价值，同时研究如何快速实现定量荧光PCR检测，以及对组装PCR试剂盒的方法进行分析。

方法：对布鲁氏菌进行常规鉴定，提取试验样本DNA，设计引物。

结果：柯氏染色实验后，样本呈红色；在PCR分型方面，野毒株与疫苗株以及标准株共为15种，阴性没有表现出扩增片段。

菌种包括了猪种、羊附睾种、羊种以及牛种，阴性没有表现出扩增片段；牛Ⅲ型以及羊Ⅱ型无特异性表现，牛Ⅰ型菌为野毒株。

结论：PCR可以有效预防实验人员在操作的过程中被菌株感染，安全性良好，具有较高的应用价值。

关键词：PCR鉴定；布鲁氏菌；鉴定；应用布鲁氏菌属于阴性革兰菌中的一种，可以寄生于多种动物细胞以及人体细胞当中；当感染了布鲁氏菌之后，会出现慢急性症状以及急性症状，导致人或者是动物不孕以及出现流产现象。

在19世纪50年代末，就已经出现了关于布鲁氏菌的相关报道，而在20世纪90年代中期，我国出现了布鲁氏菌引发的重大疫情；目前虽疫情得到了一定程度上的控制，但是防控工作依然艰巨，对此应重视研究鉴别分析布鲁氏菌时所采用的方法，以便有效防控疫情［1］。

本文分析了PCR鉴别分析布鲁氏菌的方法，并对应用该鉴别手段的模式进行了研究，报告如下。

1分析材料及方法1.1分析材料本研究所分析的标准菌株包括B63、B230、B16、B28、M7、S4以及S24；疫苗株包括A23；动物菌株包括牛Ⅲ型、羊Ⅱ型、牛Ⅰ型以及羊Ⅲ型。

此外，分析鉴定的试剂为DNA分子量以及DNA聚合酶、抽提试剂、PCR引物以及TS培养基。

1.2分析方法本文的研究内容及方法如下：在GENEBANK当中查找保守序列，并根据保守序列设计出TaqMan探针以及引物合成方法。

多种呼吸道病原体的多重实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用邸红芹;杨永辉;康丽菲;安晓颖;李晓霞;张辉【摘要】目的建立多种呼吸道病原体的多重实时荧光定量聚合酶链反应(multiplex real-time-PCR,MRT-PCR)检测方法.方法根据生物信息学分析结果选定各种呼吸道病原体的靶序列,建立MRT-PCR检测体系.构建质粒标准品,检测建立体系的敏感度、特异度和重复性,并运用MRT-PCR和单荧光定量PCR检测临床样本进行对比分析.结果成功建立了多种呼吸道病原体的MRT-PCR检测体系;该方法特异度较好,最低检测限为10copies/μL,重复性良好,变异系数为0.99％～2.50％,530例临床样本中,MRT-PCR检测的阳性率为59.2％ (314/530),单荧光定量PCR检测的阳性率为61.1％(324/530),阳性检出率差异不大.结论建立快速、敏感、特异、稳定的MRT-PCR检测体系,具有良好的临床应用前景.【期刊名称】《河北医科大学学报》【年(卷),期】2016(037)011【总页数】5页(P1302-1306)【关键词】呼吸道感染;聚合酶链反应;敏感性与特异性【作者】邸红芹;杨永辉;康丽菲;安晓颖;李晓霞;张辉【作者单位】河北省胸科医院检验科,河北石家庄050041;河北省胸科医院检验科,河北石家庄050041;河北省胸科医院检验科,河北石家庄050041;河北省胸科医院检验科,河北石家庄050041;河北省胸科医院检验科,河北石家庄050041;河北省胸科医院检验科,河北石家庄050041【正文语种】中文【中图分类】R517.6·论著·呼吸道感染是全球范围内的常见病和多发病，严重威胁着人类健康和生活质量。

呼吸道病原体来源极为复杂,包括病毒、细菌、支原体、衣原体、军团菌等微生物，且传播迅速，临床表现相似，患者均表现为发热和呼吸道感染症状，单从临床表现很难区分感染病原体，以致某些患者病情加重错过最佳治疗时机[1]。