内毒素检测法是什么

细菌内毒素检测要求检测原理细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁的组成部分，具有很高的免疫原性。

在细菌生长过程中，内毒素产量达到一定水平后，可引起人类和动物发热、休克、DIC（弥散性血管内凝血）等多种病症。

因此，对细菌内毒素进行准确检测至关重要。

细菌内毒素检测的基本原理是：基于内毒素与抗内毒素抗体特异性结合的特性，通过检测样品中内毒素引发的凝集反应，从而确定内毒素的存在。

目前，常用的细菌内毒素检测方法为鲎试验法，其灵敏度高、操作简便、结果判断客观。

样品采集采集细菌内毒素样品时，需遵循无菌操作原则，确保采集过程不受污染。

样品主要包括：水样、食品、药品等。

采集前需充分了解样品来源，以便对样品进行合理处理。

此外，采集到的样品应尽快送至实验室进行处理，以防内毒素分解或样品变质。

样品处理样品处理是细菌内毒素检测的重要环节。

首先，应去除样品中的无关物质，如：杂质、蛋白质等。

这一步骤可采用离心、过滤等方法。

其次，需将样品中的内毒素提取出来，常用的提取方法有：热处理法、酸碱处理法等。

最后，样品处理过程中需严格控制温度、湿度、时间等条件，以确保样品中内毒素的稳定性。

试剂和器材进行细菌内毒素检测实验时，需要使用以下试剂和器材：试剂：鲎血：用于制备鲎试验试剂细菌内毒素标准品：用于制作标准曲线氯化钙溶液：用于中和鲎血试剂磷酸盐缓冲液（PBS）：用于稀释样品和鲎血试剂器材：无菌试管：用于样品处理和实验操作移液器：用于准确移取样品和鲎血试剂涡旋振荡器：用于混匀样品和鲎血试剂水浴锅：用于控制实验温度酶标仪：用于读取实验结果实验步骤（1）取适量细菌内毒素标准品，用PBS溶解，制作标准曲线。

（2）取100μL样品溶液和100μL鲎血试剂加入无菌试管中，轻轻混匀。

（3）将混合液加入酶标仪中，记录凝集反应发生的时间。

（4）根据标准曲线计算细菌内毒素的含量。

结果解读根据实验结果，可参照以下公式计算细菌内毒素的含量：内毒素含量= (样本凝集时间/标准品凝集时间) × 标准品内毒素含量其中，样本凝集时间为实验步骤（3）中记录的时间；标准品凝集时间为标准品溶液中内毒素引起凝集反应的时间；标准品内毒素含量为已知值，通常为0.5EU/mL。

药典三部版通则细菌内毒素检查法标准化工作室编码[XX968T-XX89628-XJ668-XT689N]1143 细菌内毒素检查法本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。

细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。

供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。

当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。

本试验操作过程应防止内毒素的污染。

细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示，1EU与1个内毒素国际单位（IU）相当。

细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度、标定细菌内毒素工作标准品的效价，干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。

细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。

细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法），且对内毒素试验无干扰作用。

试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。

耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30分钟以上）去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。

若使用塑料器皿，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器具。

供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。

必要时，可调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的pH值在6.0～8.0的范围内为宜，可使用适宜的酸、碱溶液或缓冲溶液调节pH值。

酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。

内毒素测定方法2005年版中国药典《细菌内毒素检查法》来源--中华人民共和国药典2005年版附录? E本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。

细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。

供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。

当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。

细菌内毒素的量用内毒素单位(EU)表示。

细菌内毒素国家标准品系自大肠杆菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。

细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及设置的各种阳性对照。

凝胶法细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水。

定量测定用的细菌内毒素检查用水，其内毒素的含量应小于0.005EU/ml。

试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。

常用的方法是在250?干烤至少30分钟，也可用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。

若使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。

试验操作过程应防止微生物的污染。

供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。

一般要求供试品溶液的PH值在6.0-8.0的范围内。

对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液(或其稀释液)的PH值，可使用酸、碱溶液或鲎试剂生产厂家推荐的适宜的缓冲剂调节PH值。

酸或碱溶液须用检查用水在已去除内毒素的容器中进行配制。

缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。

内毒素限值的建立药品、生物制品的细菌内毒素限值(L)一般按以下公式确定: L=K/M式中L为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg或EU/U(活性单位)表示;K为人每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/(kg•h)表示，注射剂K=5E U/(kg•h)，放射性药品注射剂K=2.5 EU/(kg•h)，鞘内用注射剂K=0.2EU/(kg•h)。

中国药典2021年版《细菌内毒素检查法》――凝胶法凝胶法凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理去检测或半定量内毒素的方法。

鲎试剂灵敏度复核试验在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用eu/ml表示。

当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。

根据鲎试剂灵敏度的标注值（λ），将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水熔化，在旋涡混合器上搅匀15分钟，然后做成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每吸收一步均应当在旋涡混合器上搅匀30秒钟。

抢分装有0.1ml鲎试剂溶液的10mm×75mm试管或复水溶性后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18两支，其中16管分别重新加入0.1ml相同浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行搞4管；另外2管重新加入0.1ml细菌内毒素检查用水做为阴性对照。

将试管中溶液轻轻搅匀后，半封闭管口，横向放进37℃±1℃恒温器中，保温60分钟±2分钟。

将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。

保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。

当最小浓度2λ管均为阳性，最高浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效率。

按下式排序反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测量值(λc).λc=1g-1(∑x/4)式中x为反应终点浓度的对数值（1g）。

反应终点浓度就是指系列递增的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。

当λc在0.5λ-2λ(包括0.5λ和2λ)时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。

阻碍试验按表中1制取溶液a、b、c和d，采用的供试品溶液应属未检验出来内毒素且不少于最小有效率吸收倍数（mvd）的溶液，按鲎试剂灵敏度为丛藓科扭口藓核试验项下操作方式。

动态浊度法定量检测内毒素的原理
动态浊度法定量检测内毒素的原理
内毒素是一种存在于细菌细胞壁中的有毒物质，其对人体和动物的健
康有着严重的危害。

因此，对内毒素的检测显得尤为重要。

动态浊度
法是一种常用的内毒素检测方法，其原理是利用内毒素对细胞的毒性
作用，使得细胞在生长过程中受到抑制，从而导致细胞生长速度的减缓，最终导致细胞密度的降低。

通过测量细胞密度的变化，可以间接
地推断出内毒素的含量。

动态浊度法的具体操作步骤如下：
1.准备培养基：将所需的培养基配制好，并进行无菌处理。

2.接种细胞：将待检测的细菌接种到培养基中，并进行预培养。

3.制备内毒素：将待检测的细菌培养至对数生长期，然后收集细菌细胞，通过破碎细胞壁的方式制备内毒素。

4.加入内毒素：将制备好的内毒素加入到培养基中，使得细胞受到内毒素的毒性作用。

5.测量细胞密度：通过测量培养基中细胞密度的变化，可以间接地推断出内毒素的含量。

动态浊度法的优点在于操作简单、快速、灵敏度高，且可以同时检测
多个样品。

但是，该方法也存在一些缺点，如对于不同种类的内毒素
可能存在检测灵敏度不同的问题，同时，该方法也无法区分不同种类
的内毒素。

总之，动态浊度法是一种常用的内毒素检测方法，其原理是通过测量
细胞密度的变化来间接推断出内毒素的含量。

该方法操作简单、快速、灵敏度高，但也存在一些缺点。

在实际应用中，需要根据具体情况选
择合适的检测方法。

内毒素是一种由细菌、真菌等微生物产生的毒素，当这些微生物在人体内繁殖过多或死亡时，内毒素可能会进入人体血液循环系统，引发炎症反应，严重时甚至会导致多器官功能障碍综合征（MODS）等严重后果。

因此，内毒素检测是一项重要的临床检测项目。

目前内毒素检测的标准主要包括内毒素含量、内毒素结合蛋白、内毒素活性等指标。

一般情况下，临床常用的内毒素检测方法有内毒素试验（LPS试验）、内毒素结合蛋白试验（Endotoxin Binding Protein，EBP试验）等。

在中国，内毒素检测的正常值因不同的检测方法而异。

以内毒素试验为例，其正常值参考范围为0-0.1 EU/mL（EU为内毒素单位），但需要注意的是，正常值范围可能会因不同的检测方法、检测设备、样本类型等因素而有所差异，因此具体的正常值参考范围需根据实际情况和各地实验室的检测标准确定。

此外，需要注意的是，内毒素检测仅能作为辅助诊断手段，不能作为单一的诊断标准，临床诊断应综合考虑患者的症状、体征、病史等多方面因素。

（85）细菌内毒素检查法✹本章内容已与《欧洲药典》和/或《日本药局方》相应的内容统一，不一致的部分用符号（✹✹）标记。

✹细菌内毒素检查法（BET）系利用鲎试剂（美洲鲎或中国益）检测或量化革兰阴性菌产生的细菌内毒素。

可采用三种技术进行细菌内毒素检查：基于凝胶形成的凝胶法；基于内源性底物裂解后浊度变化的比浊法；基于合成胁显色基质复合物裂解后发生颜色变化的显色法。

可采用上述任意一种方法进行检测。

当对测定结果有怀疑或争议时，除另有规定外，以凝胶法测定结果为准。

本法操作过程中应防止内毒素的污染。

器具应按照经过验证的程序将所有玻璃器皿和其他热稳定材料置于干热烤箱中去除热原。

✹①✹通常使用的最低温度和最短时间为250℃加热30分钟。

如果使用多孔板和微量加样器吸头等塑料器具时，只有证明其不含有可检出的内毒素并对试验无干扰方可使用。

（注：本章中的“管”包括微孔板中的孔等所有反应容器。

）试剂和试液试剂是由鲎（美洲鲎或中国鲎）的阿米巴细胞（白细胞）溶解产物制得的冻干品。

这种试剂必须是按照权威机构认定的规程生产的产品。

（注：除内毒素外，鲎试剂也与P葡聚糖反应。

通过消除G因子或抑制G因子反应系统，能够制得不与葡聚糖反应的鲎试剂，此种鲎试剂可用于葡聚糖存在情况下的内毒素检查。

）内毒素检查（BET）用水在检测限内不与鲎试剂产生凝集反应的注射用水或用其他方法制备的水。

鲎测试液将鲎试剂溶解于内毒素检查用水或鲎试剂生产企业推荐的缓冲液中，轻轻混匀。

复溶的鲎试剂须按照生产企业的规定冷藏或冷冻保存。

溶液的制备内毒素标准品贮备液使用经现行WHO国际内毒素标准品标定过的美国药典内毒素标准品配制内毒素标准品贮备液。

按照包装说明书和标签上的规定制备、贮存贮备液。

内毒素的单位用EU表示。

[注：1个美国药典内毒素单位（EU）等于1个国际内毒素单位（IU）]内毒素标准品溶液将内毒素标准品贮备液充分混匀后，用内毒素检查用水进行连续稀释。

为避免因内毒素的吸附而导致失活，配制后的稀释液应尽快使用。