菌液的制备及保存讲课教案

液体菌种制作规程工艺流程：斜面菌种→初级摇瓶种→二级摇瓶种→发酵罐深层发酵种→接种一、摇瓶种的制作1斜面菌种准备：马铃薯200克（去皮切块煮沸过滤取滤液），蔗糖20克，麸皮30克（煮汁过滤取滤液）二氢钾2克，硫酸镁1克，琼脂20克，VB1 10毫克，水1000毫升。

25度培养7天备用。

2、初级摇瓶制作①配方土豆200克葡萄糖20克酵母膏2克蛋白胨3克磷酸二氢钾2克硫酸镁1克V B110毫克水1000毫升。

（配方2：玉米粉4%，蔗糖3%，麸皮2%，酵母膏0.5%，2氢钾0.25%，硫酸镁0.1%，VB1 0.01%，豆油0.05%）。

②制作：土豆去皮切成薄块，煮沸后保持20分钟，四层纱布过滤后取滤液，补足1000毫升水，称取其他成份，与土豆液充分搅匀然后装入三角瓶。

初级摇瓶采用500ml三角瓶，装入200ml,放入玻璃球5粒（0.5cm 直径）用二层纱布包裹制作棉塞，塞紧棉塞后再用二层纱布外层加报纸做罩，扎紧瓶胫，防止摇动时棉塞活动。

③灭菌：把三角瓶放入立式高压锅，加足水紧好盖，开启放气阀，接通电源，有蒸汽冒出时关闭放气阀，待压力表达到0.05MPa时,断掉电源,打开放气阀,放冷空气至压力表回0，再关闭放气阀，接通电源，当压力表显示0.11 MPa，温度达到121℃后开时计时，保持45min。

断电使其自然降至0.02 MPa时放气归0，趁热微开盖，使剩余蒸汽烘干棉塞，然后出锅降温至25℃即可接种。

④接种：首先，封闭接种室，用开启紫外线灯30分钟，再用臭氧灭菌器灭菌60分钟或用烟雾剂每立方5克熏蒸30分钟，进行接种环境灭菌。

把灭菌后的三角瓶放入超净台（或接种箱）,把斜面母种、工具、酒精灯、75%的酒精棉球瓶同时放入，母种用灭过菌的报纸遮盖，打开紫外线灯和无菌风开关，保持15min后，关闭紫外线灯进行接种。

操作人员应着干净的隔离衣，带好卫生帽、口罩，手洗净，用75%酒精擦拭手、母种试管、工具，点燃酒精灯，灼烧工具及试管口20秒，在严格无菌操作程序下，把斜面菌种切割成0.5厘米小块（不带培养基），移入三角瓶中，使其浮在液面，一般接入5-6块，塞好棉塞，接完后重新封好棉塞罩，放到25℃恒温环境净置培养72小时。

液体菌种培训教材(节选四)2010年4月10日三、液体菌种的制作过程及方法（一）试管种的生产：液体菌种对试管的纯度要求很高。

所以要自己会做试管种。

试管种的制作其实很简单，在我们要用种的前三个月，到市场上去看哪个菇符合要求，就买回来（也可以用自己保存的试管种均可）。

在接种箱内进行常规气雾（最好是高锰酸钾和甲醛）消毒，30分钟后，开始分离。

分离时先将用具消毒，然后用手把菇体分开，用镊子夹一小块菇肉（不同的菇取种位置不同），放到试管里。

塞上棉塞就行了。

这样的成功率一般在80%以上。

在菌丝生长阶段，要经常观察菌丝的生长情况。

对菌丝生长不整齐的，有污染的，全部淘汰。

只留下没什么问题的，长满试管后，再取特定部位进行转管（见实操）。

菌丝长到**cm时，从菌丝生长的尖端提取一小块，一般地认为，取****大小就可以了，不过从试验上看，提得**效果越好。

平菇一般提二次就可以了，提到五次，基本上与脱毒菌种效果差不多。

别的品种要多些，最多不超过五次，都可以达到提纯的目的。

（二）三角瓶专用母种生产：专用母种分固体和液体两种。

从生产技术上看，液体专用母种要难一些，是用电磁搅拌器或摇瓶机进行生产。

整个过程要4-7天时间，生产的液体种稍经加工就可以直接使用。

液体菌种专用母种的配方就是用PDA加富配方去掉琼脂。

用三角瓶盛装，在高压锅里121℃保持30分钟就行了。

待三角瓶的温度降到30℃以下时，在超净工作台或接种箱内进行接种。

马上就可以进行搅拌或摇瓶了。

固体种生产时间要长些，保存的时间也长，而且方便运输。

固体专用母种一般污染要严重一些，有的人污染率要达到20-30左右。

固体专用母种我们现在一般不用，污染率太高，而且不好发现，最糟糕的是容易堵枪。

配方是把木屑过20-40目的筛，用去掉琼脂的PDA配方拌料，在121℃高压下灭菌2小时，待温度下降到30度以下时，在超净工作台或接种箱内进行常规接种。

一般20多天可以长好。

具有运输和贮存方便等特点。

一、课程名称：液体菌种技术与应用二、课程背景与目标1. 背景：随着生物技术的快速发展，液体菌种技术在食品、医药、化工等领域发挥着越来越重要的作用。

为了培养具有液体菌种技术理论知识和实践能力的专业人才，特开设本课程。

2. 目标：（1）使学生掌握液体菌种的基本概念、分类、特性及培养方法；（2）使学生了解液体菌种在食品、医药、化工等领域的应用；（3）提高学生的实验操作技能和科学思维能力；（4）培养学生具备液体菌种技术的研发和应用能力。

三、课程内容与安排1. 课程内容：（1）液体菌种的基本概念、分类及特性；（2）液体菌种培养基的配制及灭菌；（3）液体菌种的接种、培养及分离纯化；（4）液体菌种在食品、医药、化工等领域的应用；（5）液体菌种技术的研发与创新。

2. 课程安排：（1）理论教学：共计24课时，每周2课时；（2）实验教学：共计16课时，每周2课时；（3）实践环节：共计8课时，每周1课时。

四、教学方法与手段1. 教学方法：（1）讲授法：教师系统讲解液体菌种技术相关理论知识；（2）实验法：通过实验操作使学生掌握液体菌种技术；（3）讨论法：组织学生针对课程内容进行讨论，提高学生的思考能力和团队协作能力；（4）案例分析法：结合实际案例，引导学生分析液体菌种技术在各领域的应用。

2. 教学手段：（1）多媒体教学：利用PPT、视频等手段展示课程内容；（2）网络教学：通过校园网络平台，提供课程资料、实验指导等；（3）现场教学：组织学生参观实验室、企业等，了解液体菌种技术的实际应用。

五、考核方式1. 考核内容：（1）理论考核：考察学生对液体菌种技术理论知识的掌握程度；（2）实验考核：考察学生实验操作技能和实验报告撰写能力；（3）实践考核：考察学生在实践环节的表现。

2. 考核方式：（1）理论考核：采用闭卷考试，占总成绩的40%；（2）实验考核：占总成绩的30%；（3）实践考核：占总成绩的30%。

六、课程资源与支持1. 教材与参考书籍：推荐液体菌种技术相关教材和参考书籍，方便学生自学；2. 实验室：提供液体菌种实验所需的仪器设备、培养基等；3. 企业合作：与企业合作，为学生提供实习、就业机会。

•菌悬液和菌片的制备♦收藏转发2008-09-0815:39:23分类：个人日记浏览(727)评论(0)•2.1.1.2.1适用范围制备消毒剂杀菌试验用细菌悬液与菌片，以供消毒剂杀菌试验时使用。

2.1.1.2.2试验器材(1)菌种：金黄色葡萄球菌ATCC6538、铜绿假单胞菌ATCC15442、大肠杆菌8099、枯草杆菌黑色变种ATCC9372、龟分枝杆菌脓肿亚种ATCC93326、白色葡萄球菌8032、白色念珠菌ATCC10231、黑曲霉菌ATCC16404。

在上述规定的菌株基础上，根据消毒剂特定用途或试验特殊需要，还可增选其他菌株。

(2)有机干扰物：见附录Ao(3)磷酸盐缓冲液：见附录Ao(4)无菌蒸储水。

(5)稀释液：见附录Ao(6)细菌培养基：胰蛋白月东大豆琼脂培养基(TSA),胰蛋白月东大豆肉汤培养基(TSB)等，见附录Ao(7)革兰染色液：见附录Ao(8)芽抱染色液：见附录Ao(9)恒温水浴箱。

(10)玻璃漏斗。

(11)刻度吸管(1.0ml、5.0ml、10.0ml),毛细吸管。

(12)数字可调移液器(10口，20口，100口，200口，1000口)及配套用一次性塑料吸头。

(13)离心机。

(14)电动混合器（15）浊度计。

2.1.1.2.3细菌悬液制备程序（1）细菌繁殖体悬液的制备1）取冻干菌种管，在无菌操作下打开，以毛细吸管加入适量营养肉汤，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。

取含5.0ml〜10.0ml营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置37c培养18h〜24h。

用接种环取第1代培养的菌悬液，划线接种于营养琼脂培养基平板上，于37c培养18h〜24h。

挑取上述第2代培养物中典型菌落，接种于营养琼脂斜面，于37C培养18h〜24h,即为第3代培养物。

2）取菌种第3代〜14代的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物（18h〜24h）,用5.0ml吸管吸取3.0ml〜5.0ml稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。

1目的菌种保藏使微生物的代谢活动处于最低的状态，但又不至于死亡，从而达到保藏的目的。

规范菌种原始菌液的制备及长期保存。

2内容2.1定义原始菌液--由冻干菌或冷冻菌直接传代的孢子或生长菌的原始悬浮液。

工作菌液--由原始菌液直接稀释，或根据一般试验需要而等量稀释的特定浓度的孢子或细菌的悬浮液。

22总则微生物室收到实验菌种后应进行活化及纯化，并进行传代（芽孢杆菌除外）。

每一新菌种在适宜的琼脂平板上划线分离，检查是否纯种，观察菌落形态并用革兰氏染色或芽孢染色法进行镜检，如果是芽孢悬浮液，用常规方法测定其存活孢子数。

经检查如果满意，贴上合适的标签，并将贮备菌存放在实验室专用的冰箱里（2〜8C）或冷冻室内，以避免与实验室正在使用的其它菌种相混淆，作好菌种传代的记录以便能追踪传代史。

生孢梭菌的孢子悬浮菌应每年制备一次。

原始菌种的传代次数最多传至第五代。

O Q 代产览2.3 培养基2.4冻干菌制备原始菌液2.4.1由甘油冷冻菌制备原始菌液241.1 把冻干菌加入100ml液体培养基后所得的菌作为第一代。

2.4.1.2 从冷冻箱内取出冷冻菌，使其在室温下慢慢融化；2.4.1.3 把冷冻菌无菌转移至100ml该菌所适用的液体培养基中；2.4.1.4 根据菌种的类型，将接种后的培养基在适当温度下培养24h或更长一些时间；2.4.1.5 把甘油冷冻菌加入100ml液体培养基后所得的菌作为第二代。

2.4.2由集菌平板制备原始菌液2.4.2.1 在超净工作台内，把经过24h （或更长时间）培养的菌液摇匀，各取1ml,无菌转移至5只培养基平板上，轻轻转动平板，使菌液均匀分布于平板表面。

不同培养基适24231 生长菌-24h以内即可显见增长;用于不同菌种。

2.4.2.2 另用一只平板，划线分离菌液，培养之，以检查菌液是否纯种。

242.3 在适当的温度下培养以上平板，不同菌种所需培养周期不一。

24232 孢子-需要3〜7天或更长时间才能得到50%孢子，这样可确保提到浓的悬浮液。

(此文档为word格式，下载后您可任意编辑修改！) 课序：《食用菌生产技术》一
课序：《食用菌生产技术》二
课序：《食用菌生产技术》三
课序:《食用菌生产技术》四
课序：《食用菌生产技术》五
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课序：《食用菌生产技术》十五
课序：《食用菌生产技术》十六
31。

液体菌种的制作及使用方法随着食用菌生产的发展,食用菌制种方法在传统固体制作的基础上在不断的改进和提高,其中液体菌种的制作便是其中之一。

液体发酵技术是现代生物技术之一，起源于美国。

它是指在生化反应器中，模仿自然界将食药用菌在生育过程中所必需的糖类、有机和无机含有氮素的化合物、无机盐等一些微量元素以及其它营养物质溶解在水中作为培养基，灭菌后接入菌种，通入无菌空气并加以搅拌，提供食用菌菌体呼吸代谢所需要的氧气，并控制适宜的外界条件，进行菌丝大量培养繁殖的过程。

工业化大规模的发酵培养即为发酵生产，亦称深层培养或沉没培养。

液体菌种的制作及使用方法液体菌种由于具有生产规模化、控制自动化、生长无菌化、发菌高速化的生产应用优势,为食用菌产业化的发展提供了良好的种源条件,是食用菌产业化发展的必然方向,已被业内人士所看好。

液体菌种是用液体培养基培养而成的菌种。

近年来，国内外正积极研究液体菌种的培养与利用。

与固体菌种相比，它具有菌种生产周期短、菌龄整齐一致、接种方便、接于固体菌料发酵快、适宜于工厂化生产等优点，因而受到了广大栽培者的欢迎。

目前我国已能进行深层发酵的食用菌有：香菇、平菇、凤尾菇、美味侧耳、鲍鱼菇、金针菇、黑木耳、猴头、草菇、蜜环菌、茯苓、滑菇和冬虫夏草等。

一、液体菌种的培养方法常见的有采用摇床来生产的摇瓶培养法和采用发酵罐来生产的深层培养法。

若少量生产，可以用摇瓶培养法。

深层培养需要一整套工业发酵设备，如锅炉、空气压缩机、空气净化系统、发酵罐等，故投资大，只适用于工厂化的大规模生产。

而摇瓶培养投资少，设备技术简单，适合一般菌种厂生产使用。

本节主要介绍摇瓶培养的技术方法。

1、食用菌液体发酵的培养基根据培养基中组成的不同，可分为天然培养基和合成培养基。

天然培养基的组成均为天然有机物。

合成培养基则是采用—些已知化学成分的营养物质作培养基。

在生产上，还根据工艺将培养基分为孢子培养基、种子培养基及发酵培养基。

但无论如何划分，每一种培养基的组成中都离不开碳、氮、无机盐、微量元素、维生素和生长素等。

生物实验课-------观察真菌的结构和形态一、目的:1、认识单细胞酵母菌形态结构和牙体，掌握其生殖方式，了解酵母菌在生活的应用及原理。

2、观察多细胞霉菌的结构，认识霉菌的生殖方式。

二、教学过程（一）、导入：1、微生物的特征。

2、微生物的主要类群。

3、细菌细胞的结构特点：（细胞壁、细胞膜、细胞质、没有细胞核、有鞭毛和荚膜）4、细菌细胞生殖方式：分裂生殖。

（二）新授课题：用显微镜观察真菌真菌种类多，已认识的7万种。

生物学家根据形态及结构大致分为单细胞和多细胞两类。

具有代表性的单细胞---酵母菌；多细胞---霉菌、蘑菇等。

本节课我们用实验探究这三种微生物形态、结构和生殖。

活动一用显微镜观察单细胞微生物----酵母菌1、目的：认识酵母菌形态结构及芽体2、器材（略）3、实验方法步骤（1）配制菌液。

（面肥溶于蔗糖溶液置于温暖处发酵培养）（2）制作酵母菌临时装片：吸→滴→涂→盖（3）观察：A用低倍显微镜找到酵母菌（提问：观察到什么？许多透明的球体、大的球体上长出牙体）B、转换10倍物镜观察（提问：观察到什么？）视野变小、变大的菌体和牙体（4）、染色滴碘液→吸水4、观察现象（提问：观察到什么？细胞壁、细胞膜、细胞质、细胞核）5、实验结论：（1）酵母菌形态：呈球体状，母体上长出牙体。

（2）、染色后观察：酵母菌的结构：细胞壁、细胞膜、细胞质、细胞核（3）长出芽体意义：繁殖新个体（4）酵母菌繁殖方式：出芽生殖（5）没有染色观察到叶绿体没有?(没有，不能光合作用)（6）酵母菌细胞与植物细胞相同与不同的结构（酵母菌不属于植物界）6、讨论：（1）、蒸熟馒头松软有气孔？酵母菌将面粉的葡糖糖氧化分解成二氧化碳和水（P52）（2）、醪糟有酒味？缺氧时酵母菌分解葡糖糖产生酒精和二氧化碳。

活动二：观察多细胞霉菌目的1、制作霉菌孢子和菌丝临时装片2、用显微镜观察孢子和菌丝，认识霉菌生殖方式器材（略）方法步骤：1、培养霉菌：（1、面包滴少量水：湿度；2空气中暴露30分钟：空气中有霉菌孢子；3、置于温暖环境培养：温度；4、置于黑暗环境：霉菌生长在阴暗环境中）2、制作霉菌临时装片（1）剪一小段透明胶条，用镊子夹住胶条在菌丝上轻轻涂一下，将沾有霉菌的胶条放在载玻片上，在显微镜下观察（观察到什么？有球形囊状结构、散落的包子、丝状的菌丝等结构）（2）用镊子夹取菌丝，放置在载玻片中央，其上滴一滴甘油，盖上盖玻片，观察菌丝形态（菌丝有横生、有竖生，底部有根状结构，但不是真正的根，是假根）3、观察青霉和曲霉永久装片（观察它们结构和形态）4、讨论：（A）霉菌菌落结构：（1）菌丝（呈线状或绒毛状）-----吸收营养物质（2）、孢子囊（呈球体囊状结构）---保护作用；里面长有孢子-----繁殖功能（B）霉菌细胞的结构：细胞壁、细胞膜、细胞质、细胞核. （C）霉菌生殖方式：孢子生殖（D）霉菌分类：青霉菌、曲霉菌、根霉菌活动三认识香菇（一）、观察香菇1、土壤下根状物：（不是根）----菌丝--------吸取营养2、地上实体部分：①菌柄----支持作用；②菌盖：ɑ菌环----链接孢子囊；B菌褶--长有孢子---繁殖3、大型真菌：蘑菇、平菇、木耳等4、与人类关系：①可食用。

菌液实验方案菌液实验是一种常用于微生物学和生化学等领域的实验方法，它通常用于研究不同种类的细菌、酵母和真菌等微生物在不同生长条件下的生长状况、代谢能力和生理特性等，从而帮助科学家们更好地理解和掌握微生物的生命活动。

菌种的选取在进行菌液实验之前，首先要准备好适当的菌种。

通常情况下，我们可以从标准菌种库中选取并购买到我们需要的菌种，也可以自己进行分离和培养。

为了获得准确的实验结果，选取菌种时应该注意以下几点：•细菌种类：在选择菌种时，应根据实验目的和研究对象的特点来选取适当的细菌种类。

例如，在研究某一类药物对某一种致病细菌的抑制作用时，我们应该选择与这种细菌相关的菌种进行实验。

•菌种的纯度：在进行菌液实验时，必须确保选用的菌种是纯净的，即只包含与研究对象有关的菌群，不受其他细菌或微生物的影响。

因此，在选取菌种时要注意检查其纯化程度和生长状态。

•菌株来源：菌液实验中需要使用细菌等微生物，并且这些微生物在不同来源下会表现出不同的特性。

因此，在进行实验前要了解选取的菌株的来源和特点，以便得到准确的实验结果。

菌液的制备液体培养基的制备菌液实验中，液体培养基是细菌或其他微生物生长及代谢所必需的基础。

在制备培养基时应注意以下几点：•培养基的配方：在制备培养基时，应根据所选取的菌种及研究对象的不同特性，合理选择培养基的配方。

通常包括碳源、氮源、矿物质盐和其他辅助因子等成分。

•培养基的pH值：不同的微生物对酸碱度有不同的适应能力，因此制备培养基时应根据不同的菌种和研究需求，调节培养基的pH值。

•培养基的消毒：在制备培养基的过程中，必须注意对培养基进行消毒处理，以避免细菌和其他微生物的污染。

菌液的制备步骤制备菌液的基本步骤如下：1.在清洁的实验台上，用燃烧灯将培养瓶口进行消毒处理。

2.向培养瓶中加入一定量的液体培养基，并将其压密后盖上气密盖，以避免细菌的氧化作用。

3.将培养瓶置于摇床或旋转器上，调节温度和湿度，以适应所选菌种的生长条件。

常用试验用菌种的生物学特征。

枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63 501]形态与染色：菌体细短棒状，单个或成链状，两端半圆形，染色均匀，芽孢椭圆形或圆柱形，位于菌体中央，革兰氏染色阳性，能运动。

培养特性：a 肉汤琼脂平板：菌落表面粗糙，圆形，灰黄色，边缘锯齿状，分离时应挑选粗糙形菌落。

b普通肉汤培养基：呈少量浑浊并产生沉淀，在液体表面形成皱状厚膜粘附于试管壁上。

C最适宜培养温度30~37℃，生长温度范围：15~35℃，兼性厌氧或需氧。

抵抗力：菌体湿热55℃1小时被杀死，芽孢100℃3小时或120℃40分钟被杀死。

短小芽孢杆菌[CMCC（B）63 202]形态与染色：杆状，革兰氏染色阳性，无荚膜，芽孢偏生，椭圆形有动力。

培养特性：平板分离时应挑选光滑菌落，其它与枯草芽孢杆菌相似。

藤黄微球菌[CMCC（B）28 001或A TCC 9341a]形态与染色：球形排列成立体状呈八叠。

革兰氏染色为阳性。

培养特性：a肉汤琼脂平板菌落为黄色，圆形，光滑，凸出，表面润湿光亮，平板分离时应挑选光滑菌落。

b普通肉汤呈黄色沉淀，很少浑浊。

c需要氧菌，最适生长温度为25℃。

金黄葡萄球菌[CMCC（B）26 003]形态与染色：圆球形排列成典型的葡萄串状，肉汤琼脂平板培养多呈短链状或双球状，无鞭毛，不能动，不产生芽孢，革兰氏染色阳性。

培养特性：a在28~38℃生长较好，pH生长范围为4.5~9.8，pH7.4左右生长最好。

b平板分离时应挑选光滑菌落。

大肠埃西菌[CMCC（B）44 103]形态与染色：短形杆菌，两端钝圆，无芽孢，革兰氏染色为阴性。

培养特性：需氧菌，也兼性厌氧。

检定菌的基本要求1.显示临床特点，对抗生素主要组分敏感，对杂质，降压物质及毒性物质无作用或作用很低。

2.灵敏、稳定，抑菌圈边缘清晰，测定误差小。

3.易于培养、保存，又无致病性。

4.与其它国家药典的试验用菌最好一致，便于单位统一。

标准品的保存与稀释标准品的保存：标准品应置5℃以下保存，安瓿开启后应将标准品转移到小瓶中，将此小瓶封口放在盛有硅胶或氯化钙的干燥瓶内，置5℃以下冰箱中保存。