脂肪干细胞的体外培养PPT讲稿

干细胞论坛脂肪干细胞培养吸脂术时用无菌针管从臀上方吸取深层脂肪组织20 mL. 在1 h内将其移至离心管内，加入等量PBS缓冲液，充分振荡后低速离心800 r/min×10 min. 反复冲洗3次后加入等量15 g/L I型胶原酶. 37℃水浴中充分振荡30 min，再加入等量胎牛血清（FBS）中止. 低速离心10 min后弃去上清. 将下层细胞用PBS悬浮后加入16 mmol/L NH4Cl 37℃水浴中10 min以裂解红细胞. 低速离心10 min后再用PBS冲洗3次. 最后将细胞用含100 mL/L FBS+10 g/L青霉素的DMEM悬浮后移入培养瓶中，37℃，50 mL/L CO2培养箱中孵育，48 h后首次换液，弃去悬浮细胞. 随后每3 d换液，1 wk后传代. 将第3代细胞用于流式细胞仪检测. 浓集细胞到109/L后进行流式细胞仪检测. 细胞传至第3代时将其以2×107/L 的细胞数分别转入各定向培养基中进行培养. 诱导培养2 wk后，对成脂诱导组进行油红Ｏ脂肪颗粒染色，另外：现在脂肪干细胞缺乏特异的表面标志鉴定，各类文献提到脂肪干细胞表达阳性的标志物有：cd13，cd29，cd59，cd49e，cd73，cd90，HLA-ABC等。

但表达阳性不代表具有特异性，所以要从标志物上鉴定脂肪干细胞还是很困难的，应该说不具有很强的说服能力。

按文献所说的步骤来提取脂肪干细胞，形态类似干细胞，并且具有多向分化的能力，这就足以说明提取的细胞是干细胞。

你要是想证明你养的就是干细胞，最好的办法我认为还是做个多向诱导分化。

干细胞传代吸出来以后，常速离心，用pbs洗两遍后，accutase管内消化5-10min，加入基础培养基离心洗去消化液，分瓶传代。

人脂肪干细胞的分离、体外培养及鉴定[摘要]目的: 进行人脂肪干细胞的分离、体外培养及鉴定, 为组织工程的进一步研究提供实验依据。

方法: 将剪碎的人脂肪组织加入Ⅰ型胶原酶消化, 离心。

自从２００１年Ｚｕｋ等［１］人从抽脂脂肪中发现脂肪干细胞（ａｄｉｐｏｓｅｄｅｒｉｖｅｄｓｔｅｍ／ｓｔｒｏｍａｌｃｅｌｌｓ，ＡＳＣｓ）以来，关于ＡＳＣｓ的研究迅速增多，现已成为整形美容外科研究热点之一。

ＡＳＣｓ是一群成纤维细胞样的基质干细胞，能分化为不同的细胞系［２］，包括脂肪细胞［３］、骨细胞［４］、软骨细胞［５］、骨骼肌细胞［６］、心肌细胞［７］、内皮细胞［８］、神经细胞［９］等等。

ＡＳＣｓ不仅在整形外科应用于自体脂肪移植、创面愈合等，而且在心肌缺血、神经系统疾病、组织工程等领域中也有着广泛的用途。

Ｋｏｔａｒｏ等［１０－１４］从２００３年就开始采用细胞辅助脂肪移植术（ｃｅｌｌ－ａｓｓｉｓｔｅｄｌｉｐｏｔｒａｎｓｆｅｒ，ＣＡＬ），将ＡＳＣｓ应用到自体脂肪移植隆胸和软组织填充中，取得了不错的临床效果。

随着研究的不断深入，ＡＳＣｓ将是很有临床应用前景的干细胞。

1材料和方法１．１实验材料１．１．１主要试剂：ＤＭＥＭ－ＨＧ培养基（Ｈｙｃｌｏｎｅ），胎牛血清（Ｇｉｂｃｏ），胰酶消化液（碧云天），Ⅰ型胶原酶（Ｓｉｇｍａ），青－链霉素（Ｈｙｃｌｏｎｅ），苏木精（上海蓝季科技公司），曙红Ｙ（Ｓｉｇｍａ，ｗｏｌｓｅｎ分装），牛胰岛素（Ｓｉｇｍａ），吲哚美辛（Ｓｉｇｍａ），地塞米松（Ｓｉｇｍａ），β－甘油磷酸钠（Ｓｉｇｍａ），左旋抗坏血酸（科昊生物），３－异丁基－１－甲基黄嘌呤（Ｓｉｇｍａ），茜素红（天津科密欧），Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（碧云天）。

１．１．２主要仪器：细胞培养孵箱（Ｔｈｅｒｍｏ），超净工作台（江苏苏净集团有限公司ＳＷ－ＣＪ－１ＦＢ），台式低速离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司ＴＤＺ５－ＷＳ），空气恒温摇床（上海福玛实·基础研究··论著·人脂肪干细胞的体外培养鉴定及分化特性赵建辉１，李龙２，杨阳１，易成刚１，刁建升１，夏炜１，刘蓓１，郭树忠１（１．第四军医大学西京医院全军整形外科研究所陕西西安７１００３２；２．第四军医大学口腔医院口腔颌面外科）[摘要]目的：在体外从脂肪块中分离出脂肪干细胞（ａｄｉｐｏｓｅｄｅｒｉｖｅｄｓｔｅｍ／ｓｔｒｏｍａｌｃｅｌｌｓ，ＡＳＣｓ），对其进行形态观察、干细胞鉴定、增殖和分化能力检测。

人脂肪间充质干细胞体外分离培养方法间充质干细胞属于成体干细胞，广泛存在于骨髓、脂肪和脐带等组织，下面是小编搜集整理的一篇探究干细胞体外分离培养方法的，供大家阅读查看。

大面积皮肤缺损、重度烧伤的传统修复方法-自体或异体皮肤移植，因存在免疫排斥和供区不足等缺陷而限制了广泛临床应用。

近年来，干细胞相关机制及应用的研究为皮肤创伤的治疗带来了新突破。

研究显示，间充质干细胞能维持皮肤稳态和促进皮肤创面修复，其机制包括促进细胞分化、免疫调节和分泌生长因子来促进创面再上皮化和血管形成[1-2].人脂肪间充质干细胞(humanadipose-derivedmesenchymalstemcells,hAD-SCs)是由Zuk等[3]首次从抽脂术脂肪中分离出的一类具有多向分化能力的细胞群，因其具有来源丰富、容易获取和扩增快等优点，是组织工程的理想种子细胞。

本实验旨在提供一种有效的hADSCs体外分离培养方法，为以后临床细胞移植提供实验基础。

1材料与方法1.1材料成人腹部大网膜脂肪组织7例取自江苏大学附属医院产科剖宫产手术患者，年龄17~33岁，平均为26岁，健康状况良好，无系统性疾病。

低/高糖DMEM、Ⅰ型胶原酶(Gibco公司),胎牛血清(Hyclone公司),鼠抗人单克隆抗体CD29-FITC、CD44-FITC、CD45-FITC、CD73-FITC、CD90-PE、CD105-PE、CD166-PE、HLA-DR-PE及其相应同型对照(eBio-sciences公司),地塞米松、抗坏血酸磷酸盐、β-甘油磷酸钠、吲哚美辛、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、胰岛素(Sigma公司).1.2方法1.2.1hADSCs细胞分离培养产科无菌条件下取出腹部大网膜脂肪组织约10ml,PBS清洗，剪碎，0.1%Ⅰ型胶原酶37℃消化45min,10%胎牛血清终止消化，离心，沉淀重悬，200目细胞筛过滤，再离心。

加入完全培养液(含10%胎牛血清、1×双抗的低糖DMEM)重悬，以5×104/ml接种于6孔板，置于37℃,5%CO2培养箱中培养，48h后首次换液，之后每周换液2次，待细胞生长至80%融合时，0.25%胰酶-0.02%EDTA消化传代。

人体脂肪干细胞培养及成骨诱导分化人体脂肪干细胞培养及成骨诱导分化引言干细胞是一类具有自我更新和多能性的细胞，可以不断分化生成各种不同类型的细胞。

人体脂肪组织中存在一种特殊类型的干细胞，即人体脂肪干细胞（human adipose-derived stem cells，hADSCs）。

与其他干细胞相比，hADSCs具有较高的抽取和培养效率，而且可以从自身脂肪组织中获得，不需要侵入性手术。

因此，hADSCs成为研究人体再生医学和组织工程领域的热门课题之一。

本文将介绍人体脂肪干细胞的培养方法以及成骨诱导分化的研究进展。

人体脂肪干细胞培养1. 来源和提取人体脂肪组织富含脂肪干细胞，因此从脂肪组织中提取hADSCs是最常用的方式之一。

提取过程通常通过脂肪抽吸或手术操作完成。

在脂肪抽吸中，通过低压吸引脂肪组织，并用特殊工具将其收集。

手术操作则需要进行小切口，直接收集脂肪组织。

提取得到的脂肪组织需要经过一系列处理，如洗涤、消化、离心等，以获得单个细胞悬浮液。

2. 培养条件提取得到的hADSCs需要在适宜的培养条件下进行扩增。

通常，使用营养丰富的培养基，如DMEM/F12，加入适量的胎牛血清和抗生素，以提供必需的生长因子和营养物质。

细胞培养的环境需要保持在37℃，5% CO2的恒温恒湿条件下。

培养过程中，需要定期更换培养基以保持细胞的生长和代谢活性。

3. 鉴定和鉴定为了确认提取得到的细胞为hADSCs，需要进行鉴定和鉴定。

常用的方法包括油红O染色、免疫细胞化学染色和流式细胞术分析。

油红O染色可用于检测细胞中脂滴的积累情况，免疫细胞化学染色可检测特定表面标记物的表达水平，流式细胞术则可对细胞表型进行全面的分析。

人体脂肪干细胞成骨诱导分化人体脂肪干细胞具有向多个细胞系分化的潜力，其中包括成骨细胞。

为了将hADSCs诱导分化为成骨细胞，需要在体外提供特定的诱导因子。

1. 前处理在进行成骨诱导前，需要对hADSCs进行适当的前处理。

脂肪干细胞分离培养操作方法
大鼠脂肪干细胞的分离
将手术切取的大鼠脂肪组织尽量剪碎后移至离心管，其余步骤与人脂肪干细胞的分离一致。

经手术切除获得的大鼠皮下脂肪组织消化后原代培养24 h，肉眼观察会发现培养瓶底部贴附着一层网状薄膜，轻轻摇晃培养瓶可使这层网状薄膜从瓶壁上脱落，镜下观察发现大部分细胞都附着于这层膜上，通过吸脂术获取的人脂肪组织消化后则无此现象。

增加胶原酶的量和消化时间也无法避免，取材时的毛细血管或脂肪间结缔组织未被完全消化，穿过细胞筛进入了培养瓶并沉淀于瓶底部形成的。

胶原蛋白酶虽然可以特异性水解胶原蛋白的三维螺旋结构，但不会损伤其他蛋白质。

处理方法是37 ℃下用胰蛋白酶消化5 min。

然后利用40 μm 的细胞筛过滤后传代。

根据作者的经验，每毫升手术切除的大鼠脂肪可分离基质血管成分细胞约1.81×106个。

原代培养2.24×10^7个大鼠基质血管成分细胞，40 h后传代时约剩余6.2×10^6个细胞，细胞剩余率27%。