异硫氰酸荧光素-溶菌酶的制备及晶体生长预研究.

配液结晶法制备溶菌酶蛋白质晶体的生长机理研究于泳;陈万春;康琦;刘道丹;戴国亮;崔海亮【期刊名称】《化学学报》【年(卷),期】2006(064)012【摘要】采用配液结晶法制取了溶菌酶蛋白质晶体,使用动态光散射测量了溶液中聚集体的颗粒度几率分布;使用Zeiss显微镜测定了溶菌酶(110)晶面的生长速度.实验表明:随着蛋白质和NaCl浓度的增加,溶液中聚集体的颗粒尺寸也相应增加.随着反应时间的增加,溶菌酶分子在溶液中的聚集反应,逐渐达到平衡;在蛋白质和NaCl 浓度较高时,溶菌酶晶体的(110)面生长较快,而在蛋白质和NaCl浓度较低时,该晶面生长较慢.基于二维成核生长机理,从晶体生长动力学理论方程出发,计算了二维成核的形成能a=4.01×10-8J·cm-2.【总页数】7页(P1284-1290)【作者】于泳;陈万春;康琦;刘道丹;戴国亮;崔海亮【作者单位】中国科学院力学研究所微重力实验室,北京,100080;中国科学院力学研究所微重力实验室,北京,100080;中国科学院物理学研究所,北京,100080;中国科学院力学研究所微重力实验室,北京,100080;中国科学院力学研究所微重力实验室,北京,100080;中国科学院物理学研究所,北京,100080;中国科学院力学研究所微重力实验室,北京,100080;中国科学院力学研究所微重力实验室,北京,100080【正文语种】中文【中图分类】O6【相关文献】1.蛋白质溶液的膜结晶:膜结晶法结晶溶菌酶的研究 [J], 魏可贵;张新妙;马润宇2.座滴法制备鸡蛋白溶菌酶晶体与生长因素探究 [J], 张晓婷;MattJ.Kipper;Christopher D.Snow;唐建国;张羽;王瑶;黄林军;刘继宪;王彦欣;张晓琳;李潇3.异硫氰酸荧光素-溶菌酶的制备及晶体生长预研究 [J], 戴国亮;代连花;于泳;谢莹4.羟基磷灰石纳米棒的水热制备及其晶体生长机理研究 [J], 焦华; 赵康; 石蕊; 马利宁; 卞铁荣; 汤玉斐5.原子力显微镜研究蛋白质晶体生长机理及进展 [J], 汪盛;蔡绍皙;王大成因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

文章编号:100028551(2005)012075205综　述利用原生质体融合技术选育微生物菌种谭周进1　杨海君2　林　曙3　吴　铁3(11湖南农业大学生物安全科技学院,湖南长沙　410128;21湖南农业大学植物保护学院,湖南长沙　410128;31湖南农业大学动物科学院,湖南长沙　410128)摘　要:对原生质体融合技术的遗传标记筛选、原生质体的制备与再生、原生质体融合等的方法,以及原生质体融合技术在提高抗生素生产效价、酵母菌工程菌株的构建、多功能菌株的选育以及污水处理工程菌的构建等方面的研究情况进行了综述。

就原生质体融合技术在微生物育种技术上的应用前景进行了分析。

关键词:原生质体融合;菌种选育;生物技术PR OTOP LAST FU SION TECHN OLOG Y AN D MICR OBIA L BREE DINGT AN Zhou 2jin 1　Y ANG Hai 2jun 2　XI AO Qi 2ming 2　LI N Shu 3　W U T ie3(11College o f Bio 2safety Science and Technology ,Hunan Agricultural Univer sity ,Changsha ,Hunan ,410128;2.College o f Plant Protection ,Hunan Agricultural Univer sity ,Changsha ,Hunan ,410128;31College o f Animal Science ,Hunan Agricultural Univer sity ,Changsha ,Hunan ,410128)Abstract :Researches on selecting of genetic marks ,preparation and regeneration of protoplast ,protoplast fusion ,and the application of protoplast fusion technique in microbial breeding were reviewed.The antibiotics strain im provement ,construction of yeast engineer strain ,breeding of multi 2functional strain and construction of engineer strain to coping with waste water were als o included.The application of protoplast fusion technology in microbial breeding was analysed.K ey w ords :protoplast fusion ;strain breeding ;biotechnology收稿日期:2003211209作者简介:谭周进(1969-),男,博士,副教授,主要研究方向为微生物生态学与发酵工程。

2',7'-二氯-5(6)-异硫氰基荧光素的合成和表征潘惠英;葛凤燕;陈立功【期刊名称】《化学工业与工程》【年(卷),期】2006(023)005【摘要】异硫氰酸荧光素(FITC)是一种重要的荧光探针.以4-硝基邻苯二甲酸和4-氯间苯二酚为原料,通过缩合、还原和异硫氰酸化制备了2',7'-二氯-5(6)-异硫氰基荧光素,总收率达34.78%.产物结构经过了红外光谱、核磁共振谱和质谱的确证.产物荧光性能经荧光光度计测定,结果表明其荧光性能优于FITC.【总页数】4页(P403-406)【作者】潘惠英;葛凤燕;陈立功【作者单位】天津大学药物科学与技术学院,天津,300072;天津大学药物科学与技术学院,天津,300072;天津大学药物科学与技术学院,天津,300072【正文语种】中文【中图分类】O626.29【相关文献】1.2-芳甲酰氨基硫羰基-3-异噻唑酮及4-氰基-5-甲硫基-2-芳甲酰氨基硫羰基-3-异噻唑酮的合成与生物活性 [J], 杨小平;李正名;陈寒松;刘洁;李树正2.异马来二氰基二硫烯镍（II）-2-萘亚甲基哌啶盐的合成和晶体结构 [J], 蔡华堂;罗翠萍;谭俊标;钱业龙;李曼娜;谢嘉玲;刘小平;杨乐敏;周家容3.4,5-二对氯苄硫基-1,3-二硫杂环戊烯-2-硫酮配体的合成及其结构表征 [J], 乌东花;丛双志;张文韬4.二(o-氟苄基)锡双(四氢吡咯二硫代氨基甲酸酯)和二(p-氯苄基)锡双(二甲基二硫代氨基甲酸酯)的合成、表征及晶体结构 [J], 尹汉东;王传华;洪敏5.O－芳基－苯基硫代膦酰氯和O－芳基－苯基硫代膦酸异硫氰基酯的研究 [J], 胡式贤;张继才;丁言伟因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

异硫氰酸荧光素在荧光标记领域的应用张雪梅;胡志宇【摘要】异硫氰酸荧光素是近年来在荧光标记技术领域应用最广泛的荧光标记物，借助于荧光显微镜、流式细胞仪、激光扫描共聚焦显微镜等荧光检测技术和仪器，可将其用于蛋白质、核酸、多糖、小分子药物及纳米粒、微球等靶向制剂的荧光标记及活性示踪。

因此，阐述了近5 a 来异硫氰酸荧光素在荧光标记领域的应用进展，并对其研究趋势和应用前景进行展望。

%Fluorescein isothiocyanate(FITC)is most widely used in the field of fluorescence labeling technology in recent years.With the help of Fluorescence microscope,flow cytometry,laser scanning confocal microscopy,it can be used in fluorescence labeling and activity tracer for protein,nucleic acid,polysaccharides,small molecule drugs and targeting agents such as nanoparticles,micro-spheres.So the application progress of the fluorescein isothiocyanate in recent five yearsin the field of fluorescent labeling technology is set forth and its research trends and application prospects are forecasted.【期刊名称】《昆明学院学报》【年(卷),期】2015(000)006【总页数】4页(P56-59)【关键词】异硫氰酸酯荧光素;荧光标记;示踪;检测【作者】张雪梅;胡志宇【作者单位】昆明学院医学院，云南昆明 650214;昆明市中医医院科教科，云南昆明 650031【正文语种】中文【中图分类】R318.51;O657.3异硫氰酸荧光素(Flourescein isothiocyanate，FITC)是一种在细胞生物学、免疫学、药物研究领域广泛应用的荧光素类标记物．FITC是在荧光素的结构上引入异硫氰基(-N=C=S)得到的，异硫氰基通过与被标记物如蛋白质的伯胺基团反应形成硫脲键，成为牢固的荧光染料—蛋白质结合物，从而实现对目标分子的荧光标记．FITC最大发射波长为520～530 nm，最大吸收波长为490～495 nm，在碱性溶液中具有强烈的黄绿色荧光，加酸后沉淀析出，荧光消失．FITC性质稳定、荧光量子产率高、无毒、成本低，对所处微环境的变化很灵敏，适合作探针分子．与抗体、蛋白质类结合可用于定性、定量检测，与糖类结合则可用于糖类在体内的代谢研究，亦可用于标示药物载体、聚合物微粒进行药物靶向性及示踪研究．本文对近5 a来FITC在药物分析领域的应用进行综述，主要侧重于天然药物及中药活性成分，以期为中药研究提供一种参考方法．1.1 用于蛋白质类药物的示踪研究FITC是用于标记生物相关蛋白质分子最广泛的一个荧光探针．通过与不同抗体结合后，广泛用于治疗性抗体如TCR(T细胞抗原受体，T cell receptor)的研究[1]，也可与蛋白质类成分结合后观察其组织和细胞行为，Celine Hoffmann等[2]用FITC标记人血浆纤维连接蛋白(FN)，用FITC/Fn不同控释比为评价指标，观察FN的组织和细胞行为．周新阳等[3]用20 mg天花粉蛋白与0.4 mg FITC反应制备得到FITC-天花粉蛋白标记物，通过观察天花粉蛋白进入黑色素瘤B16细胞的动态过程，发现孵育6 h时FITC-天花粉蛋白对细胞DNA没有明显的损伤作用；而孵育12 h时对黑色素瘤B16细胞产生明显的细胞毒作用和凋亡．张倩等[4]制备了FITC与鹿茸蛋白混合物(PE)的荧光标记复合物FITC-PE，观察到该标记蛋白在消化道中荧光强度及蛋白含量均会削减，但蛋白主要成分保持不变，相对分子质量小于45 kD的蛋白可以透过肠壁吸收入血．双标记流式细胞术检测细胞凋亡是FITC的一项成熟应用．用FITC标记磷脂结合蛋白V(Annexin V)，再与PI(碘化丙啶)匹配使用，可检测细胞凋亡，称为Annexin V-FITC/PI双染色法．国内研究者也利用该法观察到许多天然活性成分对不同细胞的凋亡作用．饶远权等[5]发现人参皂苷Rg3对肺腺癌NCI-H1650细胞增殖具有明显的抑制作用，且呈时间剂量依赖关系．李晓冬等[6]检测到质量浓度为150，200 mg/L的银杏叶提取物可诱导U251胶质瘤细胞凋亡．郭立达等[7]发现姜黄素能显著抑制人结肠癌LoVo细胞的增殖并促进其凋亡．申淑珍等[8]观察丹参酮ⅡA联合三氧化二砷(ATO)对人急性早幼粒细胞白血病细胞株(NB4细胞)凋亡的作用．1.2 多糖类成分的示踪及体内代谢研究多糖由于自身缺少发色基团和荧光基团，因此不能直接用紫外或荧光法进行检测．而利用化学修饰将FITC连接到多糖分子上，则可准确、灵敏的标记多糖，该方法是研究多糖在体内分布、降解和吸收的一种重要方法．胡锦珍等[9]发现FITC荧光标记的壳聚糖(脱乙酰度为90%，相对分子质量为500 kD)给小鼠灌胃后在血清中质量浓度非常低，主要分布于肾脏，多数以原形经粪便排泄，部分分解的壳聚糖经尿液排泄．王月慧等[10]采用FITC标记3种相对分子质量(3，300～400，700 kD)的壳聚糖，体外检测标记物的抑菌活性，发现标记后的壳聚糖依然具有抑菌活性，但因FITC标记时占据了壳聚糖的抑菌活性基团氨基，使抑菌活性减弱．陈忱等[11]通过FITC与枸杞多糖的共价偶联，成功对枸杞多糖进行荧光标记，荧光取代度为1.3%，24 h体外稳定性良好，为研究枸杞多糖的代谢动力学提供了良好的荧光探针．谢华通[12]等采用凝胶色谱法观察FITC标记的麦冬多糖(MDG-1)在大鼠胃肠道内的含量变化，结果表明，MDG-1在胃内不分解，其主要代谢部位在肠道，原因可能是肠道内环境及细菌共同作用的结果．李福川等[13]利用多糖具有的还原性末端，通过对其半缩醛基的还原氨化反应先与酪胺(Tyr)共价偶联，引入仲氨基，再与FITC进行亲核反应，完成对多糖的标记，实现了对海洋多糖911的选择性荧光标记．标记后的多糖抗凝活性无明显影响，也无明显的细胞毒性．康迪等[14]也应用这一方法制备得到纯度达99%的FITC-海胆黄多糖(SEP)荧光标记物，并通过大鼠尾静脉注射后探索其血浆代谢情况．对于具有还原末端多糖及寡糖，这一标记方法通用型较强，且在虫草多糖[15]、小刺猴头菌多糖[16]、树舌灵芝多糖[17]、黄芪多糖[18]等多糖荧光标记物制备的体内代谢研究均有应用．1.3 药物载体的示踪研究由于传统的药物载体不具备可观察性和可追踪性，造成载体检测比较困难，而将荧光纳米探针应用于药物载体可使该问题得到解决．采用FITC对载体颗粒进行修饰，制备复合荧光颗粒，依靠标准仪器检测，可高灵敏、高选择性地监测活细胞中的活性物质，现已在标记、示踪、检测等领域广泛应用．杨丽等[19]用FITC共价结合醋酸淀粉，制备得到一个荧光性质稳定、具有生物可降解性的淀粉荧光纳米微粒．柳琳等[20]制备的FITC标记的亲水性多肽类药物神经毒素自组装核壳型纳米粒(NT-SAN)经鼻黏膜给药后，有助于提高NT的脑内浓度及生物利用度，为研究适宜蛋白质多肽类等大分子药物经鼻黏膜给药的脑靶向新剂型提供了参考．冯丽娜等[21]制备了纳米药物载体PAMAM-Ac-FITC-LCTP，并将该载体与阿霉素连接，经体内外实验观察到其对非小细胞肺癌NCI-H460具有良好的靶向性和缓释作用．刘鉴峰等[22]制备的多肽介导的肿瘤靶向药物载体(G4-FITC-SP5-52)在体外展示出良好的肿瘤靶向性．高仕杰等[23]用FITC标记的TAT-PEG-阳离子脂质体，具备跨膜、长循环及荧光示踪功能，经尾静脉将其注入大鼠体内，可清晰显示标记物在MCF-7细胞内外的情况．FITC标记复合物还可作为荧光分子探针，用于外用药物传递系统研究．Heui Kyoung Cho等[24]用FITC标记聚氧化乙烯-聚ε-己内酯-聚氧化乙烯共聚物(PEO-PCL-PEO)，比较了未标记和标记后的共聚物在临界胶束浓度(CMC)、紫外吸收、荧光性能、结晶等性质的差异，发现低HLB值的荧光标记物能克服角质层的屏障作用，渗入无毛小鼠肌肤深层．FITC荧光标记的原理是利用异硫氰基与氨基形成共价结合，对于结构中无氨基的物质需要先衍生反应后再标记，如无氨基的多糖需要先与酪胺偶联产生氨基后再与FITC反应[13]．由于紫杉醇亦无法直接标记，单玲玲等[25]则使用谷氨酸作为linker，先合成谷氨酸-紫杉醇复合物，再与FITC反应，最终得到紫杉醇-谷氨酸-FITC复合物．因此，针对多数未具备氨基的化合物，选择何种载体或方法成功标记则有待进一步研究和探索．另外FITC在光照下易发生猝灭，影响捕捉荧光图像，有时需要和抗猝灭剂一起使用．在穿透机体时FITC发射的黄绿色荧光会有部分被机体吸收，导致荧光强度降低．同时实验动物如裸鼠表皮及血液自发荧光较强，会对FITC荧光产生比较严重的干扰，使得用FITC标记的物质在活体成像时不明显，需要取裸鼠主要脏器及肿瘤进行脏器显像，才能得到明显的荧光显像效果[26]，这在一定程度上影响了FITC在活体成像领域的应用．FITC作为一种应用广泛的荧光标记试剂，在天然药物开发领域应用空间巨大．国内学者通过FITC标记叶酸衍生物[26]、抗体药物Rituximab[27]后，利用小动物活体荧光成像技术追踪观察其在荷瘤裸鼠主要脏器和肿瘤中的分布和代谢情况，能够准确地监测FITC标记物的动态分布情况，对分析抗肿瘤药物靶向效果具有指导意义．此外，FITC标记药物也被应用到临床血清药物检测领域．王小明等[28]用FITC抗体包被发光板，将FITG-T3类似物与抗FITC抗体间接结合形成固相抗原，用抗人三碘甲腺原氨酸(T3)类似物取代T3作为竞争抗原，探索了一种非均衡竞争化学发光免疫分析法，此方法精密度好、灵敏度高，检测临床标本与使用进口试剂测定结果相关性良好．目前已有睾酮(T)[29]、总甲状腺素(TT4)[30]、孕酮(P)[31]、雌二醇[32]、雌三醇类似物(E3)[33]等药物建立了相似的检测方法．利用FITC寻找快速、价格低廉、适用于临床应用的检测方法，将是其应用发展的趋势之一．异硫氰酸荧光素量子产率高，荧光寿命长，借助生物光子学的技术手段可动态的观测整个过程，并进行定量测量，是一种有效、安全、灵敏度高的检测方法，在药物成分示踪、活性物质的检测、药物代谢过程研究、作用机制探讨、药物制剂开发等方面都将会有更广阔的应用前景．【相关文献】[1]TAKAIA H，KATOA A，NAKAMURAB T，et al．The importance of characterization of FITC-labeled antibodies used in tissue cross-reactivity studies[J]．Acta Histochemica，2011，113：472-476．[2]HOFFMANN C，LEROY-DUDAL J，PATEL S，et al．Fluorescein isothiocyanate-labeled human plasma fibronectin in extracellular matrix remodeling[J]．Analytical 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异硫氰酸荧光纳米复合粒子的研制与应用
张念椿;高燕红;万垂铭;刘应亮
【期刊名称】《分析化学》
【年(卷),期】2010(038)002
【摘要】采用改进的St(o)ber法制备了二氧化硅外壳的纳米复合荧光粒子.利用异硫氰酸荧光素(FITC)与3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTEOS)反应制备前驱体),再用正硅酸乙酯(TEOS)在一定的条件下水解与缩合,制备有机-无机纳米复合荧光颗粒,利用透射电子显微镜(TEM)测试表明,此纳米复合颗粒呈球形、大小均一,直径约为70 nm.制备的纳米复合荧光粒子经过多次水洗后,仍有较强的荧光特性,有效地防止FITC泄露.用激光共聚焦显微镜观测纳米复合荧光粒子标记的牛血清白蛋白(BSA),可以明显看出BSA上的绿色荧光.
【总页数】5页(P202-206)
【作者】张念椿;高燕红;万垂铭;刘应亮
【作者单位】暨南大学纳米化学研究所,广州,510632;暨南大学纳米化学研究所,广州,510632;暨南大学纳米化学研究所,广州,510632;暨南大学纳米化学研究所,广州,510632
【正文语种】中文
【相关文献】
1.嵌合异硫氰酸罗丹明B核壳荧光纳米颗粒制备的新方法研究 [J], 原茵;何晓晓;王柯敏;谭蔚弘;彭娇凤;黄杉生;林霞
2.发光标记物--异硫氰酸曙红荧光的介质效应 [J], 吴娅兰;李隆弟;刘佳铭;朱国辉
3.异硫氰酸荧光染色法在真菌性角膜炎诊断中的应用观察 [J], 成拾明;阮坤炜;韩芳芳;郑武;张巍;张勇
4.羊抗人IgG的异硫氰酸荧光黄标记法 [J], 褚佩英
5.人造芥子油中异硫氰酸烯丙酯与硫氰酸烯丙酯的气相色谱分析 [J], 刘敬兰;陈连文;周鸿娟
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【高中生物】荧光抗体的制备（一）免疫球蛋白的提取（二）荧光素1．荧光色素的基本条件（1）具有化学活性基团，如异硫氰基（-ncs）等，易与免疫球蛋白结合形成共价键。

（2）对免疫球蛋白无毒性，不影响抗体活性。

（3）荧光效应高，与蛋白结合需要量少。

（4）荧光素性能平衡，结合物性能平衡，难储藏。

（5）结合物的颜色必须与背景组织有良好的反衬作用，易于观察判定。

至目前为止，基本合乎上述建议的荧光素只有异硫氰酸荧光素（fitc），丽丝胺罗丹明b200（rb200）。

2．常用的荧光色素（1）异硫氰酸荧光素：又称异硫氰酸荧光徐，纯品为橙黄色粉末。

棕斑结晶型与粉末型两种,结晶型荧光强度小、平衡、强于粉末型。

分子式c21h11o2n5、分子量389，溶水，易溶于ph8-9.5碳酸盐缓冲液中。

最小稀释波长为495nm。

最小升空波长520nm。

异硫氰酸荧光徐性质平衡，于低温下可以留存二年以上，但久置标记抗体能力强，荧光亮度高，故应使用新产品。

异硫氰酸荧光素借助异硫氰基与蛋白中氨基酸（主要是赖氨酸）的氨基结合。

一个igg分子有86个氨基酸残基，一般最多能标记16～20个荧光素分子。

（2）丽丝胺罗丹明：为褐色粉末，不溶水、易溶于酒精和丙酮。

荧光为桔红色。

性质平衡，可以长期留存。

分子式c23h29o7nas2，分子量为580，最小稀释波长570nm，最小升空波长为600nm。

由于丽丝胺罗丹明荧光效能较低，一般不单独使用，多用于与fitc标记抗体的反衬染色或双标记配合使用。

此染料不能直接与蛋白质结合，必须先用五氯化磷（pcl5）处理，使染料的-so3na基变为-so3cl基后，才能在碱性条件下与赖氨酸的氨基结合，形成稳定的硫氨键。

（三）标记方法异硫氰酸荧光素常用的标记法有以下两种：1．烘烤法（1）取一定量的纯igg液，用0.5mol/lph9.5碳酸盐缓冲液稀释至20mg/ml。

（2）按荧光素与蛋白质比1?20～1?100（通常用1?100）称取异硫氰酸荧光素，用ph9.5碳酸盐缓冲液熔化。

异硫氰酸荧光素标记尿激酶的制备与性能研究张雅娟;俞洁;张冬未;梁洪泽;梁明明;赵玲玲【摘要】Fluorescein labeled urokinase (FITC-uPA) is synthesized by the reaction of fluorescein isothiocyanate (FITC) with urokinase (uPA), a kind of protein drug for thrombolysis. The reaction is confirmed by1HNMR and FT-IR. The ratio (F/P) of fluorescein over protein is 0.45. The urokinase is found to possess good fluorescent property after fluorescein is labeled, and the detection limit of fluorescence is as low as 10-6 g·mL-1. There is obvious linear relationship between the fluorescein intensity and concentration of FITC-uPA within the concentration range of 1-100μg·mL-1, which can be used for qualitative/quantitative detection and tracking of micro/trace proteins. FITC-uPA has similar hydrodynamic diameter and thrombolysis efficiency with the unlabeled urokinase. Based on the study, it can be concluded that the fluorescein-label is a simple and effective method for thrombolysis drug labeling without affecting the biological active of urokinase.%用异硫氰酸荧光素(FITC)对溶栓蛋白药物尿激酶(uPA)进行了荧光标记，制备了荧光素标记的尿激酶(FITC-uPA)，经核磁谱及红外谱表征证实了反应能有效进行，其荧光素/蛋白值(F/P)值为0.45.尿激酶经荧光素标记后，具有良好的荧光性质，其荧光检测下限低达10-6 g·mL-1.在1~100g·mL-1范围内，荧光强度与溶液浓度具有很好的线性关系，可用于微/痕量蛋白质的定量/定性检测和跟踪标记.荧光素标记后的尿激酶，其流体力学直径与未标记的尿激酶基本一致，其体外溶栓能力也与未标记的尿激酶相当，说明FITC标记基本不影响尿激酶的生物活性，是一种简单、有效的溶栓药物标记方法.【期刊名称】《宁波大学学报（理工版）》【年(卷),期】2016(029)003【总页数】5页(P78-82)【关键词】异硫氰酸荧光素;荧光标记;尿激酶;溶栓【作者】张雅娟;俞洁;张冬未;梁洪泽;梁明明;赵玲玲【作者单位】宁波大学材料科学与化学工程学院，浙江宁波 315211;宁波大学材料科学与化学工程学院，浙江宁波 315211;宁波大学材料科学与化学工程学院，浙江宁波 315211;宁波大学材料科学与化学工程学院，浙江宁波 315211;马鞍山市人民医院，安徽马鞍山 243000;宁波大学材料科学与化学工程学院，浙江宁波315211【正文语种】中文【中图分类】TQ937尿激酶是我国最常用的溶栓药物，以其有效的溶栓作用和可接受的价格为广大脑卒中患者所接受. 尿激酶是从健康人尿中分离或从人肾组织中培养获得的一种蛋白酶，能催化裂解纤溶酶原成为纤溶酶，纤溶酶能降解纤维蛋白凝块，以及血循环中的纤维蛋白原、凝血因子Ⅴ和凝血因子Ⅷ等，从而发挥溶栓作用. 然而尿激酶的半衰期仅有8～15min，且没有血栓靶向特异性，溶栓的同时也增加了机体出血的风险. 另外，渗透到血管外的药物还可以参与血脑屏障破坏、水肿形成等反应过程，加重神经系统损伤［1］. 目前，研究者们为解决溶栓药物的弊端问题大多采取的策略主要包括药物的PEG化［2-3］、构筑药物释放体系［4-9］和结合纤维蛋白特定抗体［10-12］. 在这些方法策略中，需要定量检测尿激酶等溶栓药物的体外释放行为，以及溶栓药物体系的离体/体内血栓的靶向性、溶栓有效性、血栓渗透性、组织安全性等. 由于尿激酶等溶栓药物是纤溶酶原激活剂，在紫外可见光区没有强的特征吸收峰，不能采用常规的紫外、荧光等方法进行定量/定性检测，也不能进行体内的检测跟踪.文献报道尿激酶等溶栓药物大多数使用高效液相色谱（HPLC）和酶联免疫试剂盒（ELISA）进行定量检测分析［3，13］，但是HPLC需要专用的蛋白质分离色谱柱，其价格都非常昂贵； ELISA价格昂贵，步骤冗长繁琐，对操作人员要求较高，且受人为和环境影响比较大. 因此，发展一种简单的、常规的尿激酶检测方法十分必要.荧光素是一类具有光致荧光特性的染料，由于其较高的摩尔吸收率和量子产率、良好的水溶性等特性，在蛋白-蛋白相互作用、试样分析、DNA标签、基因表达和分析检测等生物分析领域具有广泛的应用［14-18］. 目前，常用于生物标记的荧光素有异硫氰酸荧光素（FITC）、四乙基罗丹明（RB200）、四甲基乙硫氰酸罗丹明（TRITC）、酶作用后产生荧光的物质如4-甲基伞酮-β-D半乳糖苷和镧系螯合物等［18-21］. 其中， FITC呈明亮的黄绿色荧光，是目前应用最广泛的荧光素，其最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～530nm，具有较高的稳定性和蛋白质结合力，常用于胰岛素、牛血清白蛋白（BSA）和抗体等的标记. 笔者使用FITC对尿激酶进行荧光标记，能够很方便地利用凝胶色谱进行分离纯化，其荧光强度与蛋白浓度在一定范围内呈线性关系，可用于蛋白的荧光定量检测.且相对于纯尿激酶而言， FITC标记尿激酶（FITC-uPA）具有相当的酶活性和体外溶栓能力，为研究者们针对溶栓药物的弊端问题进行的各类研究提供了极大的方便.1.1 原料尿激酶（uPA），丽珠医药集团股份有限公司；异硫氰酸荧光素（FITC），Sigma-Aldrich， St. Louis，US；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和甲醇购于国药集团化学试剂有限公司， AR；氯化铵购于宁波市化学试剂公司， AR.1.2 FITC标记尿激酶(FITC-uPA)的合成FITC标记尿激酶合成参考文献［14］FITC血清白蛋白的合成方法. 称取100mg uPA置于25mL单口瓶中，加入10mL PBS（0.01mol·L-1， pH 8.0）配成10mg·mL-1溶液. 将单口瓶放到4℃冰水混合浴中避光搅拌，滴加0.75mL FITC甲醇溶液（1mg· mL-1），反应8h后，加入氯化铵（终浓度50mmol·L-1）终止反应，继续搅拌2h后，混合物通过凝胶渗透色谱柱分离，将所得到的溶液冷冻干燥得到最终产物，保存于-20℃待用.1.3 产物的结构表征及性能测试1.3.1 核磁共振分析（NMR）称取约10 mg待测样品溶于氘代试剂中，采用Bruker AMX 400MHz核磁共振谱仪采集.1.3.2 红外光谱（FT-IR）分析将冷冻干燥样品与溴化钾混合研成粉末，压片，用Bruker Equinox 55 FT-IR红外光谱仪分析.1.3.3 粒径测试采用Brookhaven Zeta plus analyzer （Brookhaven Instruments Corporation，US）进行粒径及粒径分布测试，所有样品在测试前均用PVDF材质的微孔滤膜过滤，孔径0.8 μm.1.3.4 分子荧光光谱分析配置不同浓度的FITC-uPA PBS溶液，用Cary Eclipse荧光光谱仪（Varian，US）采集溶液的荧光发射光谱. 激发波长为495nm，发射波长范围为505～600nm，扫描速率2400nm·min-1，狭缝宽度为5.0 nm，记录520nm处的发射光强度I520，以I520对FITC-uPA样品浓度作图.1.3.5 计算FITC-uPA中FITC与uPA的摩尔比F/P配制1.0mg·mL-1uPA/PBS蛋白溶液，用UV-7504紫外可见分光光度计测其在280nm处的吸光系数E%0.1；配制1.0mg·mL-1FITC-uPA/PBS样品溶液，分别测其在280nm和495nm处的吸光系数A280和A495，依照相关公式计算FITC与uPA的摩尔比/FP［14］：其中，wM为蛋白质uPA的分子量.1.3.6 体外溶栓实验血栓的制备：标本供应者均为年龄在40～60岁的非血液病患者，入院前没有使用任何抗凝、抗血小板或者溶栓药物等. 入院后，肘前静脉抽取4mL左右静脉血，放入无抗凝剂红色真空管中，室温下将标本静止放置3h使其自然形成血栓，血栓成分分离待用. 从血液离体到形成血栓后开始溶栓的时间为5h左右. 每条血栓成长条圆柱状，长约3cm，滤纸将表面水分吸干，小刀尽量均分成4等份，用精确度1mg的分析天平称重每份并记录其值标记为M1，各组血栓间的干湿程度尽量一致.实验步骤：将每份标本处理完后等分成6块血栓，分别放入6只5 mL离心管中，将离心管下端固定在有机玻璃孔板上，分为PBS溶液组、uPA+PBS溶液、FITC-uPA+PBS溶液组. 分别向每只离心管中加入1mL的溶液，确保每只离心管内的尿激酶当量为3mg，放入37℃水浴缸中2h. 取出血栓，再次用滤纸吸干表面的水分，用分析天平称重. 标记为M2. 干预后的失重标记为M3， M3=M1-M2，溶栓率=M3/M1×100%.2.1 FITC标记尿激酶(FITC-uPA)的合成FITC标记尿激酶（FITC-uPA）是利用FITC上的异硫氰酸基与尿激酶的自由氨基反应，将荧光素连接到蛋白质分子上，其反应如图1所示.1HNMR谱上化学位移4.9附近羟基质子峰，以及3.2～3.7处-NH-上质子峰的出现说明反应的发生［16］（图2），如图3所示，红外光谱上1030cm-1处归属于FITC上C=S伸缩振动峰的出现也说明FITC成功连接到尿激酶上［18］. 经计算， FITC-uPA的/FP值为0.45，激光粒度仪测得其流体力学直径为7nm左右，与未经FITC标记的尿激酶粒径基本一致（图4），这也从侧面说明了FITC标记后对尿激酶的空间结构没有太大影响，对于保持尿激酶活性具有积极意义.2.2 FITC-uPA的荧光性质FITC标记赋予了尿激酶良好的荧光性质，激发波长为495nm时，其最大发射波长在520nm左右，与FITC的荧光光谱性质基本一致. 当FITC-uPA的质量浓度低至10-6g·mL-1时，在所设测试条件下，其荧光发射光谱图仍然很平滑，最大荧光强度为16.8（图5），说明FITC-uPA具有良好的荧光性质，可用于尿激酶的微/痕量定性检测和体内/外标记. 在文中测试范围1～100μg·mL-1内， FITC-uPA的荧光强度与其浓度具有较好线性关系（图6），其线性方程为y=24.27x-0.013，相关系数为0.999，可用于微/痕量蛋白质的定量检测.2.3 FITC-uPA的蛋白活性用荧光素对尿激酶进行标记的目的是便于跟踪检测蛋白质在体内外的位置及含量，其前提是要最大可能地保持蛋白质的活性，即在不丧失尿激酶作为溶栓药物性能的基础上对其进行修饰.用体外溶栓实验对FITC-uPA的蛋白药物活性进行了评估，以PBS溶液和未标记的当量尿激酶作为参照. 结果表明，在本文实验条件下，未经荧光素标记的尿激酶溶栓率为80.4%（图7），而FITC-uPA的溶栓率为76.8%，是尿激酶的95.5%. 尿激酶经FITC标记后，保持了较高的活性，蛋白活性的极小部分损失可能是由于荧光素修饰后引起的微小蛋白空间结构变化所引起的，有待于进一步的研究［3，22］. 然而从体外溶栓实验结果来看， FITC-uPA仍具有与尿激酶相当的溶栓效果，有较好的溶栓能力. 因此荧光素标记作为一种简单可行的蛋白质标记方法，对尿激酶的活性基本无影响，可用于下一步的溶栓药物体系离体/体内血栓的靶向性、溶栓有效性、血栓渗透性、组织安全性等研究.用异硫氰酸荧光素对溶栓蛋白药物尿激酶进行了荧光标记，制备了荧光素标记的尿激酶FITC-uPA，经核磁、红外表征证实了反应的有效进行，其荧光素/蛋白值（/FP）值为0.45. 尿激酶经荧光素标记后，具有良好荧光性质，其荧光检测下限低达10-6g·mL-1，荧光强度与溶液质量浓度在1～100 μg·mL-1范围内具有很好的线性关系，可用于微/痕量蛋白质的定量/定性检测和跟踪标记. 荧光素标记对尿激酶的分子结构和蛋白活性没有明显影响，FITC-uPA的粒径约为7nm，与未标记的尿激酶基本一致，体外溶栓实验表明FITC-uPA的溶栓能力与纯尿激酶相当，很好地保持了尿激酶的蛋白活性. 异硫氰酸荧光素标记是一种简单、有效、可行的尿激酶标记方法，为尿激酶的常规测试提供了极大的便利.【相关文献】［1］Marler J R. 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大肠杆菌O157∶H7异硫氰酸荧光素标记抗体的制备及评价方珍;鞠文;秦亚楠;孟日增;潘风光【摘要】目的:制备高效价、高纯度、特异性好、荧光强度高及稳定的抗大肠杆菌O157∶H7异硫氰酸荧光素(FITC)标记抗体,初步探讨其在大肠杆菌荧光免疫检测试验中的应用.方法:复苏培养E.coli O157∶H7标准菌株,甲醛灭活制备疫苗免疫家兔.4次免疫后,颈动脉采血分离血清,经辛酸-饱和硫酸铵法粗提后应用蛋白亲和层析柱HiTrap Protein G HP进行IgG纯化,借助SDS-PAGE电泳、BCA试剂盒法、间接ELISA法分别对蛋白纯度、蛋白含量及抗体效价进行测定.应用不同FITC与蛋白量比值以及不同标记反应条件对多克隆抗体进行标记.比较荧光抗体F485/535,结合差异性显著分析对FITC与蛋白量比值及反应条件进行合理选择,应用标记抗体与E.coli O157∶H7和金黄色葡萄球菌混合菌液反应验证标记效果.结果:HiTrap Protein G进行E.coli O157∶H7多克隆抗体纯化的最佳纯化方法为35％、100％二梯度洗脱,制备抗体效价为1∶25 600,与沙门氏菌、阴沟肠杆菌等8种肠杆菌无交叉反应,最佳FITC与蛋白量比值为1∶10,最佳标记反应条件为20℃、2h.由最佳条件制得的荧光抗体与E.coli O157∶H7反应明显,强荧光连续照射15 min后仍显示高亮度荧光反应,且不与金黄色葡萄球菌反应.结论:本实验首次制备出纯度高、荧光强度高、持续时间长的E.coli O157∶H7 FITC标记多克隆抗体,为E.coliO157∶H7荧光免疫检测方法的建立完成了关键步骤.【期刊名称】《吉林大学学报（医学版）》【年(卷),期】2013(039)001【总页数】6页(P165-169,封3)【关键词】大肠杆菌O157∶H7;多克隆抗体;荧光免疫;异硫氰酸荧光素【作者】方珍;鞠文;秦亚楠;孟日增;潘风光【作者单位】吉林大学军需科技学院食品质量与安全教研室,吉林长春130062;吉林大学公共卫生学院卫生检验教研室,吉林长春130021;吉林大学军需科技学院食品质量与安全教研室,吉林长春130062;吉林大学公共卫生学院卫生检验教研室,吉林长春130021;吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心,吉林长春130062;吉林大学军需科技学院食品质量与安全教研室,吉林长春130062【正文语种】中文【中图分类】R155;R378.21O157∶H7是大肠杆菌中重要血清型，其感染剂量极低，一次摄入10个活菌就可致病[1]。