㊀㊀2022年第63卷第2期299收稿日期:2021-11-17基金项目:国家基金面上项目(31772098)作者简介:陈文强(1995 ),男,浙江台州人,硕士,研究方向为植物学,E-mail:159****9677@㊂通信作者:蔡健(1965 ),男,安徽阜阳人,教授,博士,研究方向为植物遗传育种,E-mail:fycaijian@㊂文献著录格式:陈文强,汪小福,陈笑芸,等.铁皮石斛鉴定方法与技术的研究进展[J].浙江农业科学,2022,63(2):299-304.DOI:10.16178/j.issn.0528-9017.20212061铁皮石斛鉴定方法与技术的研究进展陈文强1,汪小福2,陈笑芸2,彭城2,徐俊锋2,蔡健1∗(1.阜阳师范大学生物与食品工程学院,安徽阜阳㊀236037;2.浙江省农业科学院农产品质量安全危害因子与风险防控国家重点实验室,浙江杭州㊀310021)㊀㊀摘㊀要:铁皮石斛为兰科石斛属多年生草本植物,具有滋阴除热㊁生津养胃等功效㊂目前铁皮石斛市场上存在严重的掺假造假现象,迫切需要进一步发展铁皮石斛的鉴定方法和技术㊂本文对铁皮石斛现有的组织形态㊁显微鉴定㊁理化分析鉴定和DNA 分子生物学鉴定等主要方法和技术进行阐述,介绍了各鉴定方法和技术的发展历程及最新进展,着重分析了基于理化性质和DNA 分子生物学的铁皮石斛鉴定,对其优缺点进行比较㊂分析了目前铁皮石斛鉴定方法与技术存在的问题,对其发展趋势进行了展望,以期为铁皮石斛鉴定技术的发展提供新的思路和途径㊂关键词:铁皮石斛;鉴定;理化性质;分子标记中图分类号:S567㊀㊀㊀文献标志码:A㊀㊀㊀文章编号:0528-9017(2022)02-0299-06㊀㊀铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura etMigo)为兰科石斛属多年生附生型草本植物[1],是我国常用的传统中药材,具有滋阴除热㊁生津养胃等功效[2],被誉为 中华九大仙草 之首[3]㊂近年来,现代药理学对铁皮石斛的成分开展了深入的研究,表明其有效成分具有增加免疫力㊁抗衰老与氧化等作用[4]㊂铁皮石斛鲜枝不易保存[5],通常会被加工成 枫斗 ,铁皮枫斗是近几年来颇受欢迎的保健品之一[6]㊂铁皮石斛市场需求量大,但其生长规律以及野生资源的破坏使得产量不足[7],因而价格昂贵㊂市场存在利用外观相似㊁性质相近的金钗石斛或紫皮石斛等来充当铁皮石斛原料进行加工和售卖的现象[8],严重影响了铁皮石斛市场的健康发展,损害了消费者合法权益㊂本文针对铁皮石斛的组织形态㊁显微鉴定㊁理化分析和DNA 分子生物学鉴定等进行阐述,介绍这几个方面的研究进展,分析存在的问题或不足,结合新技术的涌现和实际检测的需要对铁皮石斛鉴定方法和技术的发展进行了分析和展望㊂1㊀组织形态鉴别组织形态鉴定主要以铁皮石斛的表面特征,包括铁皮石斛的茎㊁叶㊁花等器官以及组织学特征为研究对象㊂通常铁皮石斛的形态特征为:茎为丛生,呈直立状,节明显,分节处略弯曲,有些会呈 Z 状,通体圆柱;表面暗绿色或黄绿色,叶鞘具有紫色斑点;易折断,汁较为黏稠,味淡微苦而回味甜,嚼之有浓厚黏性;鲜根近乳白色,老根贴近棕色[9-14]㊂包英华[15]通过收集不同地区的铁皮石斛,根据种内组织形态变异特征将铁皮石斛分为9个变异类型:紫杆红叶型㊁红杆红叶型㊁青杆细茎型㊁青杆粗茎型㊁纺锤粗茎型㊁矮杆粗茎型㊁矮杆弯曲型㊁长杆黑节型和短杆黑节型㊂丁小余等[16]对不同产地的铁皮石斛进行比较,发现可分 F 枫斗型与 H 非枫斗型两类㊂ F 型总体更为柔软,具有较为丰富的蜡质与黏多糖,适合加工为优质枫斗; H 型茎较长,质地坚硬,不宜作为铁皮枫斗的原料㊂组织形态的鉴定是传统的铁皮石斛鉴定方法,方便快捷,主要依靠鉴定人的感官分析,基本不需要借助仪器㊂但对鉴定人的鉴定经验及材料的新鲜度与完整性要求较高㊂2㊀显微鉴别自20世纪80年代之后,随着显微技术的进一步发展,对于铁皮石斛显微性状研究越加精密㊂赵300㊀㊀2022年第63卷第2期玉娇等[17-20]分别根据组织结构㊁细胞形状对铁皮石斛的茎横切面㊁薄壁细胞切片㊁维管束数量以及粉末显微特征等进行具体描述:茎切面大体呈多边形,微木化,细胞壁加厚;薄壁细胞也呈多角形,含有大量淀粉颗粒,外侧薄壁细胞中含硅质块,草酸钙针晶多成束存在,其黏液细胞多贴近表皮处;维管束略排成4~5圈,韧皮部狭小;粉末在显微镜下是淡黄色,表观呈无规则状颗粒,均能观察出淀粉颗粒,多为单粒㊂蔡沓栗等[14]基于‘中华本草“记录,对铁皮石斛根㊁茎㊁叶进行全面的组织形态鉴定,细化仅从单一横切面分析,结合多组织细胞观察,明确其特征及鉴别方法,确定根横切面中铁皮石斛具有明显木质增厚的外皮层㊂蒋素华等[21]利用冷冻切片技术,通过光镜和蔗糖保护,在蔗糖质量分数8%㊁冷凝温度-25ħ的最适条件,观察铁皮石斛根㊁茎㊁叶的显微结构,该方法可在兰科植物中广泛应用㊂同时,不同产地的铁皮石斛在显微鉴定比较时无较大区别㊂李娅琼等[22-23]对野生及栽培变异的铁皮石斛与普通组培铁皮石斛的显微特征进行对比,发现只有在个别部位有些不同,总体上呈现的特征是一样的㊂操作简便㊁样品用量少是显微性状鉴定的优点,至今仍是中药材鉴定的常用方法之一㊂而针对铁皮石斛的显微鉴定主要偏向铁皮石斛与其余药用石斛之间的差别,缺少明确鉴定铁皮石斛的专属性状显微特征㊂3 理化性质理化鉴定指利用化学或物理的方法,对铁皮石斛中所含有效成分进行定性分析,以获取具有鉴别价值的理化特征,铁皮石斛中常用的理化鉴定方法包括色谱法㊁光谱法及质谱法等㊂3.1㊀色谱法㊀㊀陈晓梅等[24]利用气相色谱法(GC)分析铁皮石斛中单糖组成,多糖中甘露糖和葡萄糖相对含量比值可区分铁皮石斛与其余石斛㊂王丽丽等[25]采用裂解气相色谱(Py-GC)结合系统聚类分析所得的指纹图谱,能区别真伪铁皮石斛㊂孟海涛[26]以铁皮石斛等3种霍山产石斛(霍山石斛㊁铁皮石斛与铜皮石斛)为材料,通过高效液相色谱(HPLC)技术建立霍山产3种石斛叶㊁茎㊁花的HPLC指纹图谱体系,明确铁皮石斛在(56.57ʃ0.02)min处存在特征色谱峰㊂黄月纯等[27]对不同地区铁皮石斛叶片黄酮类成分标示HPLC特征图谱,表明不同产地种源成分组成和比例存在显著差异㊂梁芷韵等[28]优化了铁皮石斛黄酮苷类成分HPLC特征图谱分析方法,明确指出不同种源的共性成分与特异性成分,可通过参照物峰判断㊂宋红坤等[29]建立铁皮石斛HPLC特征图谱,初步比较8个品种石斛HPLC特征图谱差异,稳定可靠,重复性好㊂吴成凤[30]对铁皮石斛黄酮类成分采用超高效液相色谱技术(UHPLC)分析,且得到铁皮石斛特征图谱可将其与霍山石斛㊁细茎石斛成功鉴别㊂Xu等[31]利用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)建立基于铁皮石斛多糖成分的HPGPC 指纹图谱,成功鉴定铁皮石斛与其余石斛㊂3.2㊀光谱法㊀㊀光谱鉴定分析主要是依据植物材料中所含成分对红外光或紫外光的吸收峰值叠加后形成相应的光谱,因所含成分及含量不一,所以其所对应的出峰时间㊁峰形等存在差异,通过比较可实现植物间的鉴别㊂在铁皮石斛中常用的光谱鉴定有紫外光谱法与红外光谱法㊂邓星燕[32]通过紫外指纹图谱与偏最小二乘判别分析建立模法,可将云南5个地区铁皮石斛及其余9种药用石斛均成功鉴别和溯源,且发现铁皮石斛茎与叶的紫外指纹图谱差异很大,经类比后叶的紫外指纹图谱更具有产地特征㊂李兆奎等[33]首次通过红外光谱法对5种常见药用石斛(包括铁皮石斛)进行鉴定分析,在1700~1200cm-1与1000~700cm-1处均具有特征峰图,可将5种石斛成功鉴别㊂白音[34]对42种药用石斛进行红外光谱分析,结果表明,在3000~ 2800cm-1以及1800~400cm-1范围之内,红外指纹图谱存在显著差异㊂上述研究说明红外光谱技术可用于多种药用石斛鉴别㊂刘瑞婷[35]通过近红外光谱技术结合SIMCA模式识别方法对7种不同产地的铁皮石斛进行鉴别,成功鉴别7个产地的铁皮石斛;并且针对3种不同品种枫斗完整样与粉碎样进行近红外光谱分析鉴定,均能成功鉴定㊂刘文杰[36]对不同产地的铁皮石斛叶㊁茎㊁根部位进行多糖红外光谱分析,得出不同产地铁皮石斛多糖含量差异很大的结论,由此可将广西㊁云南与浙江的铁皮石斛区分开㊂张雪瑛[37]利用傅里叶变换红外光谱技术得到铁皮石斛等9种石斛的特征光谱,并对4个产地的铁皮石斛进行红外光谱分析,可知在红外光谱的峰高上存在差异,可作为辅助手段建立铁皮石斛综合鉴定体系㊂3.3㊀质谱法㊀㊀杨健等[38]采用热电离质谱和稳定同位素质谱分别测定铁皮石斛中锶元素等,采用主成分分析构建(PCA)模型能够区分不同产地的铁皮石斛㊂严华等[39]采用微波消解法对样品进行前处理,建立电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)方法来测定铁皮石斛中5种重金属元素含量符合现行标准㊂潘琳琳[40]基于核磁共振(NMR)代谢组分析和最小二乘支持向量机(LS-SVM)模型鉴别铁皮石斛粉是否掺假,准确性达98%㊂Jiao等[41]利用气相色谱-质谱联用(GC-MS)和液相色谱-质谱联用(LC-MS)方法,并利用PCA分析,鉴定出78种代谢物㊂Yang等[42]使用超高效液相色谱飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MS)和多变量分析系统地表征了来自不同种源的铁皮石斛化学特征㊂将UPLC-Q-TOF-MS数据通过PCA分析,偏最小二乘判别分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘分析(OPLS-DA)显示出明显的分离㊂马旖旎[43]针对7个不同产地的铁皮石斛采用顶空固相微萃取技术(HS-SPEM)提取铁皮石斛的有效成分,并结合GC-MS技术对相应化学成分进行解析,并建立了7个不同产地的铁皮石斛叶片有效成分的HPLC指纹图谱体系㊂Jin等[44]从不同生长年限的铁皮石斛和霍山石斛茎中萃取分离出代谢物,并使用气相色谱-质谱联用(GC-MS)对其进行了鉴定,对11种具有明显分化的代谢物进行主成分分析(PCA)和OPLS-DA分析,作为鉴定区分铁皮石斛和霍山石斛的生物标记㊂4 DNA分子生物学鉴定DNA分子生物学鉴定是以生物大分子核酸的多态性或特异性为基础的分子水平鉴定㊂DNA分子生物学鉴定具有准确性高㊁数量级多㊁遍及整个基因组㊁遗传稳定等优点㊂随着DNA分子生物学技术的发展,越来越多的DNA分子生物学技术被应用到铁皮石斛的鉴别当中㊂目前常用的有DNA 分子标记方法(如RAPD㊁ISSR㊁AFLP等)及DNA条形码技术等㊂4.1㊀随机扩增DNA多态性㊀㊀RAPD(random amplified polymorphic DNA)技术是以PCR技术为基础,对不同模板DNA采用随机合成的寡聚核苷酸序列引物扩增,DNA片段呈现多态性[45],仅在某一特定模板中成功扩增即可作为该模板的分子标记㊂Klinbunga等[46]首先通过对不同属植物进行扩增,寻找属间特有的产物,再通过对属内不同种植物进行扩增,寻找种内特有产物,最后得到种内不同个体之间的差异进行鉴别㊂颜松[47]利用RAPD技术对铁皮石斛基因组进行扩增,优化反应条件,为该技术在铁皮石斛的应用奠定基础㊂张铭等[48]通过RAPD技术对铁皮石斛基因组进行扩增,筛选最初设计的50种RAPD引物,成功选出一组对铁皮石斛具有高度特异性的引物,达到正确鉴别铁皮石斛与其余药用石斛的目的㊂顾慧芬等[49]对铁皮石斛试管苗采用RAPD技术,成功设计出能特异性鉴定铁皮石斛的引物,并对其进行多代培育验证其稳定性㊂丁鸽等[50]对8个不同地区野生铁皮石斛进行RAPD技术分析鉴别,成功设计出S412引物,该引物可将8个野生群体准确鉴别,并具有良好的稳定和重复性㊂4.2㊀简单重复序列区间㊀㊀ISSR(inter-simple sequence repeat)技术是以微卫星重复序列(SSR)为基础[51],在其引物3ᶄ或5ᶄ端锚定2~4个碱基成为新的引物,如[CT]4CG㊁[AG]4CT等,通过扩增两侧反向SSR 序列,电泳后呈现多态性,分析特征片段并建立进化树用于属间及种间资源鉴定等㊂卢家仕等[52]利用ISSR技术对24份不同石斛属样品进行多样性和聚类分析,可将24份石斛属分为6个类群,与传统分类一致㊂李明焱等[53]采用ISSR技术对新培育的铁皮石斛幼苗进行分析,成功筛选出铁皮石斛新品种新斛1号,电泳多态性与其余品种铁皮石斛存在明显差异㊂段媛媛等[54]采用单因素试验结合ISSR分子标记技术对霍山石斛与铁皮石斛进行多态性分析,筛选出6条多态性与稳定性好的引物,可用于铁皮石斛与霍山石斛的鉴定㊂ISSR技术汲取RAPD与SSR技术的长处,既能达到较好的稳定性,又具有操作简便㊁快速等优点㊂4.3㊀扩增片段长度多态性㊀㊀AFLP(amplified fragment length polymorphism)技术利用两种限制性内切酶对物种基因组DNA进行切割,该方法基于染色体上众多自然的酶切位点[55],将碱基差异较大的物种进行快速准确鉴别㊂Ulrich等[56]在酶切两端接人工合成接头作为扩增模板,将人工接头碱基加上酶切位点碱基往前延伸2~3个碱基为扩增引物,再通过聚丙烯酰胺凝胶放射荧光,通过银染技术得到多态性条带㊂王慧中等[57]利用AFLP技术对13种石斛属植物进行遗传多样性研究,成功筛选出3对选择性扩增引物组302㊀㊀2022年第63卷第2期合,将13种材料分成3类,与传统分类学结果基本一致㊂宋爽等[58]同样对51个药用石斛(包括35个铁皮石斛)利用AFLP技术筛选出5对特征引物,成功将铁皮石斛与其余石斛鉴别㊂4.4㊀DNA条形码技术㊀㊀目前,DNA条形码作为中药分子鉴定中的热点,自2003年加拿大圭尔夫大学Paul Hebert教授提出后,被生物界广泛关注㊂生命条形码联盟(CBOL)[59]对陆地907个植物样品进行研究,认为rbcL和matK片段具有很好的分辨能力,将这两个片段联合作为陆地植物的DNA条形码㊂王晖等[60]利用rbcL和matK对石斛属的5种石斛进行了鉴别,但是这两个基因在种内的变异率很低,不建议作为鉴别石斛属的候补DNA条形码㊂中国植物条形码工作组[61]对1757个种的序列分析发现,ITS2和psbA-trnH片段具有更好的鉴定能力,将ITS2+ psbA-trnH联合片段作为中药分子鉴定的通用条形码㊂钟志敏[62]研究将铁皮石斛与其余药用石斛进行了鉴别,发现ITS2㊁matK以及yclb1对于石斛属具有良好的鉴别能力㊂丁小余等[63]分别对枫斗类石斛ITS区全序列㊁nad1-intron2片段全序列㊁cp DNA psdA-trnH全序列进行分析鉴别,并利用位点特异性PCR对 F 型铁皮石斛与 H 型铁皮石斛ITS2序列分析,在第273位上找到SNP位点,针对该位点设计引物鉴别两种不同品质的铁皮石斛㊂图1为铁皮石斛DNA条形码鉴别流程㊂图1㊀DNA条形码鉴别的流程4.5㊀其他DNA分子生物学技术㊀㊀刘玲等[64]利用目标区域扩增多态性TRAP (target region amplification polymorphism)技术对铁皮石斛群居及其杂交后代进行分子鉴别,通过对铁皮石斛中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(PEPC)㊁苯丙氨酸解氨酶(PAL)以及葡萄糖焦磷酸化酶基因(UGP)构建目标区域,呈现多态性扩增,筛选出7对引物成功将铁皮石斛野生群居鉴别,同时对杂交后代进行鉴别,能有效将亲本与后代区分,有利于选择优质品种进行人工培育㊂TRAP技术根据目的基因序列随机设计引物进行多态性标记,优点是极大地提高基因型与表现型一致㊂此外还有简单重复序列[65](simple sequence repeat,SSR)㊁相关序列扩增多态性[66](sequence related amplified polymorphism,SRAP)㊁单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)㊁抑制消减杂交[67](suppression subtractive hybridization, SSH)等技术在铁皮石斛鉴定研究中的应用㊂5 展望传统的铁皮石斛鉴别方法主要依据不同石斛的特征形状或性状对石斛的质量或真伪进行评价与鉴别㊂然而石斛的外观极其相似,特别是相关近缘种,很难鉴别,如果是加工品如铁皮枫斗,就更加难以区分㊂因此,目前针对铁皮石斛的鉴定方法主要有两类,一类是理化分析方法,另一类是DNA 分子生物学方法㊂理化分析方法检测和分析的主体是铁皮石斛中的化学成分或元素,而铁皮石斛中的化学成分或元素多样,且受多种因素的影响,如气候环境㊁种质资源㊁栽培方式等㊂另一方面,目前的鉴定方法多基于单一或少数指标性成分的检测,缺乏专属性和特异性,无法对不同石斛进行精准的鉴别㊂随着色谱特别是质谱技术的发展,近年来基于质谱技术的代谢组学为理化分析方法提供了新的选择,代谢组学基于高通量分析技术,如核磁共振㊁色谱质谱和毛细管电泳质谱等技术,对铁皮石斛小分子代谢产物的组成㊁含量及其变化进行定性和定量分析,通过代谢物信息与其生理变化的关联分析,寻找铁皮石斛的特征代谢标志物,从而克服了目前其他理化方法检测目标单一或缺乏特异性的不足㊂基于DNA分子的鉴别方法,直接从DNA分子水平反映植物物种的多样性和特异性㊂DNA分子受外界因素以及生物体发育阶段及器官组织差异等的影响较小,DNA分子相对稳定和便于操作,使得DNA分子鉴定技术在铁皮石斛的鉴别方面具有准确性高㊁重现性好等优势㊂然而目前无论是DNA分子标记技术还是DNA条形码技术,其检测过程仍然繁杂,而且分辨率有待提高㊂近年来,三代测序技术的发展,使得测序的时间及成本大大缩短与降低,因此,有望利用测序技术达到对铁皮石斛的精确鉴定㊂铁皮石斛鉴定是一个跨学科交叉的研究领域㊂就目前的技术而言,主要为上述理化分析技术和DNA分子生物学技术㊂然而任何一项技术都不是万能的,每项技术都有各自的特色㊂为了达到鉴定的目的,技术的多元化交叉和联合是当前及未来的发展趁势㊂而最终的目的主要有两方面,即精确鉴定和快速鉴定㊂为了达到精确鉴定,一方面在现有技术的基础上升级改造和提升,另一方面是吸纳和引入新的技术,如代谢组及其他组学的发展,多组学的联合应用也为铁皮石斛的鉴定提供了新选择;三代测序技术的发展,为基于DNA序列信息的铁皮石斛精确鉴别提供了可能;再如利用数字PCR 技术对铁皮石斛进行精准定量分析㊂在快速检测方面,以电子鼻㊁电子舌等各类传感器为代表的智能快检技术有望应用于铁皮石斛的快速检测与鉴定㊂另一方面,将新兴的芯片技术㊁恒温扩增技术㊁功能纳米材料㊁微流控技术及光电技术进行融合,从而打造针对铁皮石斛快速鉴定的新技术㊂参考文献:[1]㊀杨一令,来平凡,蒋士鹏.铁皮石斛的研究进展[J].山东中医药大学学报,2008,32(1):82-85.[2]㊀白音,包英华,王文全,等.药用石斛鉴定方法的研究进展与趋势[J].北京中医药大学学报,2010,33(6):421-424.[3]㊀包英华,潘超美,白音.3种药用石斛鉴别特征的综合分析[J].华南师范大学学报(自然科学版),2014,46(3):112-117.[4]㊀丁小余,张卫明,王峥涛,等.石斛属民族药用植物的分类及生药学研究[J].中国医学生物技术应用,2003,3(1):1-14.[5]㊀郭彩娥,阮沛桦,胡欣,等.鲜铁皮石斛颗粒的质量标准研究[J].广东药科大学学报,2020,36(1):18-23. 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