外源性DNA残留量测定法(qPCR法)

外源性DNA残留量测定法第一法 DNA探针杂交法供试品中的外源性DNA经变性为单链后吸附于固相膜上，在一定温度下可与相匹配的单链DNA复性而重新结合成为双链DNA，称为杂交。

将特异性单链DNA探针标记后，与吸附在固相膜上的供试品单链DNA杂交，并使用与标记物相应的显示系统显示杂交结果，与已知含量的阳性DNA对照比对后，可测定供试品中外源性DNA的含量。

试剂（1）DNA标记和检测试剂盒（2）DNA杂交膜尼龙膜或硝酸纤维素膜。

（3）2%蛋白酶K溶液称取蛋白酶K 0.20g，溶于灭菌水10ml中，分装后储藏于-20℃备用。

（4）3%牛血清白蛋白溶液称取牛血清白蛋白0.30g，溶于灭菌水10ml中。

（5）1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液（pH8.0）用盐酸调pH值至8.0。

（6）5.0mol/L氯化钠溶液（7）0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液（pH8.0）用10mol/L 氢氧化钠溶液调节pH 至8.0。

（8）20%十二烷基硫酸钠(SDS)溶液用盐酸调pH至7.2。

（9）蛋白酶缓冲液（pH8.0）量取1mol/L Tris溶液1.0ml（pH8.0），5mol/L 氯化钠溶液2.0ml，0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液(pH8.0）2.0ml，20%SDS溶液2.5 ml，加灭菌水至10ml。

（10）TE缓冲液（pH8.0）量取1mol/L Tris溶液（pH8.0）10ml，0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液（pH8.0）2ml，加灭菌水至1000ml。

（11）1%鱼精DNA溶液精密称取鱼精DNA 0.10g，置10ml量瓶中，用TE缓冲液溶解并稀释至刻度，摇匀，用7号针头反复抽打以剪切DNA成为小分子，分装后贮藏于-20℃备用。

（12）DNA稀释液取1%鱼精DNA溶液50μl，加TE缓冲液至10ml。

用于探针标记和阳性对照的DNA制备用于探针标记和阳性对照的DNA，由生产供试品用的传代细胞、工程菌或杂交瘤细胞提取纯化获得，其提纯和鉴定可参考下述推荐方案进行，具体方法可参考《分子克隆实验指南》（［美］J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002）或《精编分子生物学实验指南》（［美］F.奥斯伯等著，颜子颖、王海林译，科学出版社，1998）。

通则3407 外源性DNA 残留量测定法第三法公示稿定量PCR 法PCR 反应过程中可通过荧光标记的特异性探针或荧光染料掺入而检测PCR产物量，通过连续监测反应体系中荧光数值的变化，可即时反映特异性扩增产物量的变化。

在反应过程中所释放的荧光强度达到预设的阈值时，体系的PCR 循环数(Ct 值)与该体系所含的起始DNA 模板量的对数值呈线性关系。

采用已知浓度的DNA 标准品，依据以上关系，构建标准曲线，对特定模板进行定量分析，测定供试品中的外源DNA 残留量。

试剂（1）PCR 反应预混液（2×) 含MgCl2、扩增酶、dNTPs 等，按试剂使用说明书要求配制，或符合条件的其它配方预混液。

（2）TE 缓冲液（pH 8.0）同方法一。

（3）荧光标记探针用TE 缓冲液稀释至100μmol/L，-20℃保存。

（4）正向和反向序列检测引物用TE 缓冲液稀释至100μmol/L，-20℃保存。

（5）碘化钠溶液（6mol/L 碘化钠，15 mmol/L EDTA，0.5%月桂酰肌氨酸钠，25mmol/L Tris-HCl pH 8.0 以及35µg/ml 糖原）：配制100ml 碘化钠溶液，先取干净的烧杯置于磁力搅拌器上，依次加入以下成分，同时用搅拌子不断搅拌混匀：50ml 的无核酸酶水，3.0 ml 的0.5 mol/L EDTA 溶液，2.5ml 的1 mol/L Tris-HCl pH 8.0，缓慢加入89.93g 的碘化钠，加入适量的无核酸酶水至100 ml（可根据需要等比增加或减少）。

用0.2 微米孔径的尼龙膜过滤溶液。

避光4℃储藏。

（6）2%蛋白酶K 溶液同方法一。

（7）蛋白酶K 缓冲液（10×），同方法一但不加氯化钠，或按蛋白酶K 试剂说明书要求配制。

（8）推荐的检测探针及引物CHO 细胞探针: 5ˊFAM-ACTCGCTCTGGAGACCAGGCTGGC-TAMRA3ˊ正向引物: 5ˊ-TGTGTAGCTTTGGAGCCTATCCT-3ˊ反向引物: 5ˊ-CAGCACTCGGGAGGCAGA-3ˊ大肠杆菌。

门冬胰岛素外源性DNA残留量的荧光法检测目的建立门冬胰岛素外源性DNA残留量的荧光检测方法，用于门冬胰岛素的质量控制。

方法参照《中国药典》三部附录及相关资料方法，对门冬胰岛素外源性DNA残留的荧光检测法进行研究，确定检测方法的最适条件，并对方法的线性、加样回收率、精密度、耐用性、重复性等方面进行方法学验证。

结果建立了门冬胰岛素原料药中外源性DNA残留量的荧光检测方法，并进行了方法学验证。

结论该方法操作简便、准确快捷，且无需标准宿主DNA，可用于门冬胰岛素质量标准中外源性DNA残留量的检测方法。

[Abstract] Objective To develop a fluorescence method of determining residual DNA in recombinant Insulin Aspart for its quality control. Methods According to CP (2010 edition) and relative methods, fluorescence method was researched .The method validation was studied from standard curve,recovery,precision,reproducibility etc. Results Fluorescence method of determining residual DNA was developed and the method was valided. Conclusion This method is convenient,fast and good reproducibility, it can be used determination of residual DNA in recombinant insulin aspart .[Key words] Fluorescence method;Residual exogenous DNA;Insulin aspart;Quality control门冬胰岛素是一种新型的人胰岛素改构产物，通过基因工程重组技术、利用大肠杆菌或酵母表达得到的一种重组蛋白类药物。

大肠杆菌表达的重组蛋白外源性E.coli 宿主残留DNA检测方法研究摘要：目的：建立大肠杆菌表达的重组蛋白外源性E.coli宿主残留DNA的检测方法用于生产过程以及最终产品的质量控制。

方法：参考试剂盒相关说明书，样品加标回收了率无法达到2020版中国药典（Ch.P）第四部3407章节和美国药典(USP)1130章节的要求，通过对药物浓度、处理温度、糖原的蛋白酶K的使用量以及不同的加标量的优化，即将样品稀释10倍后，加30pg的E.coli标准品，20μl的蛋白酶K消化1h,选择15μl PCR反应体系。

结果：回收率满足在50%~150%之间。

结论：借助商品化的试剂盒，优化的外源性DNA提取条件满足法规要求、操作简便，非常适用于大肠杆菌表达的重组蛋白生产过程以及最终产品的外源性残留DNA的检测。

关键词：大肠杆菌表达的重组蛋白大肠杆菌外源性DNA背景介绍：本文所述大肠杆菌表达的重组蛋白的的制备工艺是通过质粒重组、转染、大肠杆菌发酵并纯化得到；根据CDE 2003年3月20日颁布的《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》最终产品控制这部分的内容，外源性残留DNA属于工艺相关杂质，存在潜在的传染性、免疫原性、致癌性以及影响正常基因的激活和抑制。

EMA[1]对外源性DNA残留也做出了相应规定，指出外源DNA残留量是纯化工艺验证的重要指标。

WHO[2]规定非口服的生物制品DNA残留量为10ng每人份剂量，并规定了外源性残留DNA的片段大小一般要小于200bp。

我国在2020年9月发布《基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则》的征求意见稿也对外源性DNA残留量做出了建议，一般要求控制在10ng/剂以内,片段大小控制在200bp以内，FDA[3]要求生物制品每剂量外源性DNA残留量小于100pg，大剂量放宽至10ng每人份剂量。

综合法规及指导原则要求，我们的产品的残留DNA的接受标准定为10ng/剂，选择相较于DNA探针杂交法和荧光染色法更快捷、灵敏、准确的qPCR（实时荧光定量聚合酶链式反应）法作为研究目标，通过对残留DNA提取效率和检测灵敏度的优化以适应各国法规要求来保障产品的质量。

qpcr检测原理qPCR（quantitative polymerase chain reaction）检测法是一种高效、准确、灵敏的分子生物学手段，用于检测DNA或RNA的定量变化，广泛应用于医学、农业、环境保护等领域。

本文将围绕qPCR检测原理展开阐述。

一、反转录qPCR检测的第一步是将RNA转录为cDNA（complementary DNA），即反转录（RT）。

反转录可用逆转录酶将RNA模板加上逆转录引物转录为cDNA。

逆转录引物是一种针对RNA模板所需的专门引物，通过与RNA模板互补结合，形成稳定的反转录复合物。

随后，逆转录酶将RNA模板作为引物的3'端作为起始点，利用其中的ribo-ATP、ribo-GTP、ribo-CTP、ribo-UTP为媒介，转录出cDNA链。

二、PCR扩增反转录完成后，使用合适的引物扩增目的DNA片段（如靶基因）。

PCR （polymerase chain reaction）是将目的DNA序列在特定条件下进行点PCR扩增，即反复进行三步循环扩增，包括变性、退火和延伸。

1.变性将待扩增样品低温离解至单链DNA，使其可与引物互补结合。

高温变性可以让DNA双链分离。

2.退火引物结合到待扩增的DNA上，使最终PCR产物是引物两端的扩增片段，引物与目的DNA在此步结合。

3.延伸添加DNA聚合酶，该酶将基因组DNA扩增，并通过定向平移方式创造新DNA链。

引物根据碱基模板DNA结合，在新的DNA链上形成一个新链的第一个引物，顺次扩增目标DNA片段。

三、荧光检测cp值（cycle threshold value）是qPCR检测过程中的必要指标。

通过荧光信号与以往经验判断，判定cp值大小，从而推断样品内片段初始含量。

扩增过程中，比对每个循环的荧光强度，通过计算反应的阈值周期数，确定所需测试反应物的浓度大小。

PCR扩增结果和荧光信号将会反映目的基因的数量。

当复制物数量大于荧光极限时，在放大基因产物的同时，荧光信号也随之增加。

外源性DNA残留量测定法第一法 DNA探针杂交法供试品中的外源性DNA经变性为单链后吸附于固相膜上，在一定温度下可与相匹配的单链DNA复性而重新结合成为双链DNA，称为杂交。

将特异性单链DNA探针标记后，与吸附在固相膜上的供试品单链DNA杂交，并使用与标记物相应的显示系统显示杂交结果，与已知含量的阳性DNA对照比对后，可测定供试品中外源性DNA的含量。

试剂（1）DNA标记和检测试剂盒（2）DNA杂交膜尼龙膜或硝酸纤维素膜。

（3）2%蛋白酶K溶液称取蛋白酶K 0.20g，溶于灭菌水10ml中，分装后储藏于-20℃备用。

（4）3%牛血清白蛋白溶液称取牛血清白蛋白0.30g，溶于灭菌水10ml中。

（5）1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液（pH8.0）用盐酸调pH值至8.0。

（6）5.0mol/L氯化钠溶液（7）0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液（pH8.0）用10mol/L 氢氧化钠溶液调节pH 至8.0。

（8）20%十二烷基硫酸钠(SDS)溶液用盐酸调pH至7.2。

（9）蛋白酶缓冲液（pH8.0）量取1mol/L Tris溶液1.0ml（pH8.0），5mol/L 氯化钠溶液2.0ml，0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液(pH8.0）2.0ml，20%SDS溶液2.5 ml，加灭菌水至10ml。

（10）TE缓冲液（pH8.0）量取1mol/L Tris溶液（pH8.0）10ml，0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液（pH8.0）2ml，加灭菌水至1000ml。

（11）1%鱼精DNA溶液精密称取鱼精DNA 0.10g，置10ml量瓶中，用TE缓冲液溶解并稀释至刻度，摇匀，用7号针头反复抽打以剪切DNA成为小分子，分装后贮藏于-20℃备用。

（12）DNA稀释液取1%鱼精DNA溶液50μl，加TE缓冲液至10ml。

用于探针标记和阳性对照的DNA制备用于探针标记和阳性对照的DNA，由生产供试品用的传代细胞、工程菌或杂交瘤细胞提取纯化获得，其提纯和鉴定可参考下述推荐方案进行，具体方法可参考《分子克隆实验指南》（［美］J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002）或《精编分子生物学实验指南》（［美］F.奥斯伯等著，颜子颖、王海林译，科学出版社，1998）。

实时荧光定量PCR法检测外源性DNA在重组III型人源化胶
原蛋白冻干纤维中的残留
梁凯歌;孙丹丹
【期刊名称】《中国医药生物技术》
【年(卷),期】2023(18)1
【摘要】目的对实时荧光定量PCR(qPCR)法检测重组III型人源化胶原蛋白冻干纤维中的外源性DNA残留量进行探究和分析,确定该方法用于DNA质量控制的可行性。

方法采用宿主细胞残留DNA样本前处理试剂盒(磁珠法)提取DNA,利用E.coli残留DNA检测试剂盒(PCR-荧光探针法)进行扩增反应,绘制标准曲线,建立重组III型人源化胶原蛋白冻干纤维中外源性DNA残留量的qPCR检测方法。

结果对8批重组III型人源化胶原蛋白冻干纤维进行测定,外源性DNA残留量在
0.03~300 pg/μl内,重复性良好,均远低于每剂10 ng,线性良好(R^(2)>0.99),回收率均在50%~150%之间。

结论该方法可用于重组III型人源化胶原蛋白冻干纤维中外源性DNA残留量的定量测定。

【总页数】5页(P30-34)
【作者】梁凯歌;孙丹丹
【作者单位】山西锦波生物医药股份有限公司功能蛋白山西省重点实验室
【正文语种】中文
【中图分类】R73
【相关文献】
1.细胞人基因组DNA 对荧光实时定量PCR检测细胞培养液中HBV DNA 的影响
2.人血浆DNA双重实时荧光定量PCR检测法的建立
3.荧光定量PCR检测重组新蛭素中毕赤酵母基因组DNA的残留量
4.实时荧光定量PCR检测工程酵母制备重组单克隆抗体原液中的宿主DNA残余
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生物制品中外源DNA残留外源DNA为残留宿主细胞的DNA片段。

这些残留DNA可能带来传染性或致瘤性风险，比如残留DNA可能携带HIV病毒或Ras癌基因。

由于微生物来源的基因组DNA 富含CpG和非甲基化序列，增加了重组蛋白药物在体内的免疫源性风险。

方法：1.首先要确认检测方法能适用于DNA残留量的测定。

药典方法有DNA探针杂交法、荧光染色法、定量PCR法。

并且需要用已上市的药物进行对照，来排除本身药物对这个方法的影响。

有必要时可用三种方法进行检测，来确认方法的可行性。

2.确认蛋白质对检测方法没有影响，可以通过蛋白酶K进行水解，再进行DNA残留量检测，蛋白酶K水解前后，DNA残留量应该不变或者变化很少，并且需要判断蛋白酶K的加入对检测方法有没有影响。

或者用核酸酶进行水解残留的DNA，此时DNA残留量应该检测不出来的，并且需要判断核酸酶的加入对检测方法有没有影响。

若有影响可以通过碘化钠沉淀或者其他商业的方法（质粒提取试剂盒或者胶回收试剂盒等等）进行除去蛋白质来纯化或者富集DNA，来进行检测DNA含量。

3.DNA的等电点较低，约在2~4左右，带有大量的负电荷，可以用阴离子填料Q、DEAE、adhere等进行层析，因为具有蛋白纯化作用，并且载量高，可以通过控制上样条件、洗脱条件进行层析，但是DNA含量很难达到pg级别。

还有膜层析，是上面带有阴离子配基，具有吸附带负电荷的物质，但载量较小，可以在最后用于蛋白质过滤来达到DNA除去效果和澄清除菌的效果。

4.阴离子聚合物进行吸附，可能会吸附目的蛋白，这时候要进行计算目的蛋白回收率。

阴离子聚合物有聚乙烯亚胺、聚丙烯酰胺等，要考虑一下有无细胞毒性，残留量的问题。

优点是价格比较便宜，可以用于前期处理，有澄清样品的作用。

5.鱼精蛋白为碱性蛋白，带有大量的正电荷，能够与DNA结合产生沉淀，从而将DNA去除。

该方法操作简便、迅速，能有效降低DNA残留量。

缺点是需要使用大量的鱼精蛋白，容易造成鱼精蛋白残留，很难达到DNA残留量到pg级别。

生物制品宿主细胞残留DNA检测限定标准及方法浅析贾惠言;姚雪静【摘要】近年来热度骤增的生物制品药物对诸多疾病疗效斐然,在药品市场中所占比重也是节节攀升.于是生物制品与之俱来的生物安全性问题被渐渐提上日程,其中宿主细胞残留DNA由于可能会传递肿瘤或病毒相关基因,存在潜在的危险性,各国药品监督管理机构对其残留量有着严格的限度控制.同时,各国药典也陆续提供数种关于宿主细胞残留DNA检测经典的方法,目前以实时定量聚合酶链式反应(PCR)方法为最优,因其专一性强、灵敏度高、快速且可实现高通量.本文介绍了一些国内与国外监管机构出台的关于生物制品宿主细胞残留DNA检测的限定规定,并对现有的常见检测方法进行描述、总结和比较.【期刊名称】《药学研究》【年(卷),期】2018(037)002【总页数】4页(P115-118)【关键词】生物制品;宿主细胞残留DNA;实时定量聚合酶链式反应【作者】贾惠言;姚雪静【作者单位】荣昌生物制药<烟台>有限公司,山东烟台264006;荣昌生物制药<烟台>有限公司,山东烟台264006【正文语种】中文【中图分类】R392-33哺乳动物细胞系如今已经成为表达制备生物制品最广泛的宿主[1]。

在已经上市和正在进行临床试验的生物制品中，70%来源于哺乳动物细胞系。

其中数种细胞系为制药同行所熟知，如幼仓鼠肾细胞系、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、小鼠骨髓瘤NS0细胞系以及人胚肾细胞系(HEK－293)。

中国仓鼠卵巢细胞尤为广泛，至少在最近很长一段时间，CHO将继续作为生产生物制品的黑马宿主细胞[2]。

众所周知，通过细胞培养生产生物制品时，需要在下游工艺中去除所有的源于宿主细胞残留的杂质，如胞质蛋白、基因及潜在病毒等。

其中宿主细胞DNA残留问题受到了制药同行很大的关注。

究其原因，在于生物制品中即便是微量地来源于宿主细胞的外源性DNA都有传递肿瘤或病毒相关基因的可能性。

如果生物制品在携带残留DNA的情况下注射进入患者的体内，如果细胞DNA为致癌基因，具有致瘤性，在患者体内生成肿瘤；如果为病毒基因，不排除该基因扩增并组装的可能，威胁患者的健康。