体内致突变试验——Pig-a基因突变试验概况和进展

基于TK6细胞的体外PIG-A基因突变检测方法的建立李若婉;周长慧;黄鹏程;常艳【摘要】目的:建立基于人成淋巴TK6细胞的体外磷脂酰肌醇聚糖A类(PIG-A)基因突变试验方法,研究甲基磺酸乙酯(EMS)与苯并芘(B[a]P)诱导TK6细胞PIG-A基因突变的能力,并探讨该方法用于药物开发初期遗传毒性筛选和评价的前景.方法:通过免疫磁珠分离清除TK6细胞株中预先存在的GPI(-)细胞(即PIG-A基因突变细胞),然后连续40 d测定正常传代培养TK6细胞PIG-A基因的自发突变率.设不添加体外代谢活化系统长时处理组(24 h-S9)和添加体外代谢活化系统短时处理组(4h+S9),并分别采用3个不同浓度50、75、100μmol/L的EMS和4、8、16μmol/L的B[a]P处理TK6细胞10 d,在第11天收获细胞.使用CD19、CD55、CD59抗体和核酸染料7-AAD对细胞进行标记,然后用流式细胞仪分析CD19阳性细胞中,CD55和CD59表达阴性的细胞频率.结果:经过免疫磁珠分离,TK6细胞中预先存在的PIG-A基因突变细胞频率降低至2.5×10-5.连续测定40 d TK6细胞的PIG-A基因自发突变率,计算得到其自发突变率为5.04×10-7个/d.与阴性对照组比较,不同浓度EMS和B[a]P诱导产生的PIG-A基因突变细胞比例均呈剂量依赖性增加,并超过阴性对照组的2倍以上.结论:本研究初步建立了基于TK6细胞的体外PIG-A基因突变检测方法.该方法成本较低,简便、快速,具有应用于药物早期遗传毒性筛选和遗传毒性评价的潜力.【期刊名称】《癌变·畸变·突变》【年(卷),期】2019(031)003【总页数】7页(P242-248)【关键词】PIG-A基因;TK6细胞;遗传毒性;基因突变检测【作者】李若婉;周长慧;黄鹏程;常艳【作者单位】中国医药工业研究总院国家上海新药安全评价研究中心,上海益诺思生物技术股份有限公司,上海 201203;中国医药工业研究总院国家上海新药安全评价研究中心,上海益诺思生物技术股份有限公司,上海 201203;中国医药工业研究总院国家上海新药安全评价研究中心,上海益诺思生物技术股份有限公司,上海201203;中国医药工业研究总院国家上海新药安全评价研究中心,上海益诺思生物技术股份有限公司,上海 201203【正文语种】中文【中图分类】Q355遗传毒性的危害识别和风险评估在临床前化学品和药品的安全性评价中起着至关重要的作用。

中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文体内Pig-a基因突变检测方法研究The Study of Pig-a Gene MutationAssay Trial in Vivo姓名：邓媛元学号： 8450309077904015专业：免疫学研究方向：遗传毒性导师姓名：王雪二零一二年六月目录中文摘要 (1)Abstract (3)第一章前言 (7)第二章 SD大鼠Pig-a基因突变检测方法的建立 (11)第一节 SD大鼠Pig-a基因突变检测方法的建立 (11)1.1材料和方法 (11)1.2实验结果 (13)1.3讨论 (15)第二节 SD大鼠经ENU和DMBA暴露后Pig-a基因突变发生率 (17)2.1材料和方法 (17)2.2实验结果 (18)2.3讨论 (19)第三节 SD大鼠自发和诱发产生Pig-a基因突变与其周龄的关系 (21)3.1材料和方法 (21)3.2实验结果 (22)3.3讨论 (23)第四节 SD大鼠Pig-a基因突变检测方法评估 (25)前言 (25)4.1样本重复性分析 (25)4.2仪器稳定性分析 (25)4.3染色细胞稳定性分析 (26)4.4血液样本稳定性分析 (26)4.4流式细胞仪检测准确性评估 (27)4.5检测细胞数目对实验结果的影响 (29)第五节小结 (30)第三章 SD大鼠Pig-a基因突变检测方法的应用 (32)第一节两种抗肿瘤药物诱发SD大鼠Pig-a基因突变研究 (32)前言 (32)1.1顺铂注射液对SD大鼠Pig-a基因突变的影响 (32)1.2盐酸甲基苄肼对Pig-a基因突变的影响 (36)第二节两种中药主要成分诱发SD大鼠Pig-a基因突变研究 (40)前言 (40)2.1材料和方法 (40)2.2实验结果 (41)2.3讨论 (43)第三节小结 (44)第四章SD大鼠Pig-a基因突变检测RET方法的建立 (46)前言 (46)1.1材料和方法 (46)1.2实验结果 (48)1.3讨论 (52)第五章综述 (54)缩略语中英对照 (62)致谢 (63)版权申明 (64)中文摘要随着新药不断上市及对药品安全性的日益重视，作为药物非临床研究的重要组成部分的遗传毒性检测，其检测新技术和新方法的开发成了当务之急。

附件1纳米材料遗传毒性试验选择指南(草案)纳米材料独特的物理化学性质及其与生物体相互作用特性为其在食品加工、抗菌产品生产、药物载体开发、肿瘤诊疗、体内示踪等领域的应用提供了广泛的前景。

新型纳米材料的诞生为人类带来机遇的同时也带来了挑战。

大量纳米材料的涌现，极大程度上增加了人体与纳米材料接触的机会，纳米材料的安全性评价成为关注的热点。

如何合理评价纳米材料对人体的潜在毒性，特别是慢性或者长期毒性，预测其潜在毒性风险是目前全科学界及各相关监管部门亟需解决的问题。

国际标准（ISO / TS 80004-2：2015）[1]对纳米粒子（nanoparticle）的定义为：微小的纳米物体（长度范围约1 nm至100 nm），所有外部尺寸在纳米级，其中纳米物体最长和最短轴的长度没有显著差异。

如果尺寸差异显著（通常超过三倍），则为纳米纤维或纳米板。

纳米粒子的尺寸效应和表面活性高等特点使它极易透过细胞膜，可在表面活性和蓄积性的共同作用下，对细胞遗传物质产生直接或间接的相互作用。

尤其是携带金属离子的纳米粒子进入体内后有可能通过氧化应激等作用机制诱发染色体或DNA断裂[2-5]。

此外，纳米材料进入人体后可能在脏器蓄积并长期存在。

纳米材料的遗传毒性，现已发展成一个专门的亚分支研究领域—纳米遗传毒理学[6-7]。

对纳米材料的潜在致癌和致畸作用评估，是对纳米材料对人体安全性评价中极为重要的一环。

纳米材料与生物体作用方面存在一定特殊性，与大多数化学品和环境诱变剂有所差异，导致现行常规使用的遗传毒性标准化评价组合可能无法有效而可靠地进行评价。

美国FDA医疗器械和辐射健康中心（Center for Devices and Radiological Health, FDA）在2010年9月指出，有必要对标准遗传毒性试验方法进行评价，并分析传统方法是否适用于纳米材料的毒性评价[8]。

经合组织（The Organization for Economic Cooperation and Development，OECD）纳米材料产品工作组（Working Party on Manufactured Nanomaterials，WPMN）于2013年11月18-19日在加拿大渥太华召开纳米材料产品遗传毒性专题研讨会，就是否需要在现有OECD遗传毒性试验指导原则范畴内对纳米材料遗传毒性测试方法进行特别调整，以及/或需要制定新的试验指导原则或指导性文件进行讨论。

基因突变可行性研究报告一、研究目的和意义基因突变是指生物体基因组中发生的突然性变异，可能对生物体的性状和功能产生不同程度的影响。

基因突变的可行性研究旨在探讨基因突变对生物体的影响，评估基因突变的可行性，并为基因突变在遗传工程和生物学研究中的应用提供理论基础。

本研究选取了实验动物小白鼠为研究对象，通过基因编辑技术诱导小白鼠基因突变，并对其进行系统性评估，以验证基因突变的可行性和对小白鼠的生物学影响。

二、研究方法1.实验动物选择及分组本研究选取了实验动物小白鼠为研究对象，将小白鼠随机分为实验组和对照组，每组均包含10只小白鼠。

2.基因编辑技术诱导基因突变利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，设计合适的靶向序列，针对小白鼠基因组中特定基因进行突变诱导。

通过电转染或病毒载体等方法将编辑工具导入小白鼠胚胎干细胞中，筛选获得基因突变幼年小白鼠。

3.检测基因突变效率利用PCR或测序技术对编辑过的小白鼠进行基因突变效率的检测，确认基因编辑是否成功，评估编辑效果。

4.系统性评估基因突变效果对实验组和对照组小白鼠进行生长发育、行为学、生理指标等多方面的系统性评估，比较两组小白鼠的差异性，评估基因突变对小白鼠的影响。

5.数据统计及分析采集实验数据后，利用统计学方法对数据进行分析和处理，确定实验结果的可信度和显著性。

三、研究结果与讨论1.基因突变诱导经过基因编辑技术诱导，成功获得了小白鼠基因突变模型，基因突变效率达到80%以上。

2.生物学影响评估对实验组和对照组小白鼠进行系统性评估后发现，实验组小白鼠在生长发育、行为学和生理指标等方面与对照组存在显著差异。

实验组小白鼠出现了明显的生长迟缓和行为异常等情况，部分实验组小白鼠甚至出现了严重的生理缺陷。

3.数据分析通过数据统计和分析，发现实验组小白鼠的生长发育和生理功能受到显著影响，表现出异常生长曲线和异常生理指标。

四、研究结论及启示1.本研究通过基因编辑技术成功诱导了小白鼠基因突变模型，并对其进行全面、系统性评估，评估了基因突变对小白鼠的生物学影响。

一、实验名称生物实验——突变实验研究二、实验目的1. 探究基因突变对生物性状的影响；2. 熟悉基因突变实验的操作步骤和原理；3. 培养实验设计和数据分析能力。

三、实验原理基因突变是指基因序列发生改变，导致蛋白质合成或功能发生改变。

基因突变是生物进化的重要来源，也是生物多样性的基础。

本实验通过诱变剂诱导基因突变，观察突变体性状变化，分析基因突变对生物性状的影响。

四、实验器材及试剂1. 实验器材：恒温培养箱、显微镜、显微镜载物台、载玻片、盖玻片、镊子、滴管、酒精灯、酒精、蒸馏水、酒精灯等。

2. 实验试剂：MS培养基、诱变剂（如亚硝酸盐、紫外线等）、植物种子、蒸馏水等。

五、实验步骤1. 准备实验材料：将植物种子浸泡在蒸馏水中，用镊子取出，放入MS培养基中培养。

2. 诱变处理：将培养好的植物幼苗放入含有诱变剂的MS培养基中，处理一定时间后取出。

3. 观察突变体性状：将诱变后的植物幼苗放入MS培养基中继续培养，观察突变体性状变化，如植株高度、叶片形状、花色等。

4. 数据记录与分析：对突变体性状进行统计，并与正常植株进行比较，分析基因突变对生物性状的影响。

六、实验结果1. 突变体植株高度明显低于正常植株；2. 突变体叶片形状发生改变，部分叶片呈扭曲状；3. 突变体花色与正常植株存在差异。

七、实验结论1. 基因突变可以导致生物性状发生改变；2. 诱变剂可以诱导基因突变，提高突变率；3. 本实验成功观察到基因突变对植物性状的影响。

八、讨论1. 实验过程中，诱变剂的选择和浓度对突变率有较大影响，需根据实验目的和材料特性进行合理选择；2. 实验结果受到多种因素的影响，如环境条件、遗传背景等，需进行多因素分析；3. 本实验为基因突变研究提供了实验依据，有助于深入理解基因突变对生物性状的影响。

九、实验改进建议1. 在实验过程中，可尝试不同诱变剂和浓度，观察突变率的变化，为后续实验提供参考；2. 增加实验重复次数，提高实验数据的可靠性；3. 对突变体进行分子生物学分析，确定突变基因，为基因功能研究提供线索。

基因定点突变的原理和实验过程嘿，咱今儿就来聊聊基因定点突变这档子事儿！你说这基因啊，就好比是生命的密码本，那定点突变呢，就是给这个密码本做点小修改。

想象一下，基因就像是一条长长的绳子，上面串着好多好多的信息。

而定点突变呢，就是要在这根绳子上精准地找到一个位置，然后把它给变一变。

这可不是随随便便就能干的事儿，得有一套原理和方法才行。

简单来说，基因定点突变的原理就是通过一些特定的技术手段，让我们想要改变的那个基因位点发生特定的变化。

这就好像是在一个复杂的地图上，准确地找到一个小点，然后给它标上不一样的颜色。

那实验过程呢，那可真是精细活儿。

首先得准备好各种材料和试剂，就像厨师做菜得准备好食材一样。

然后呢，要设计好突变的方案，这可得深思熟虑，不能马虎。

接下来，就是一系列复杂的操作啦。

比如说，得把基因片段提取出来，这就好比是从一大包东西里找出我们要的那个小物件。

然后呢，用各种酶啊、试剂啊去处理它，让它按照我们的想法发生变化。

这过程可不简单，就跟走迷宫似的，一个不小心可能就走错路了。

在实验过程中，每一步都得小心翼翼，就跟绣花似的。

稍微有点差错，可能就前功尽弃啦。

你说这是不是很考验耐心和技术啊？而且啊，这可不是一次就能成功的事儿。

有时候得反复尝试好多遍，就跟解一道很难很难的数学题一样，得不断地尝试不同的方法。

做完这些还不算完呢，还得检测突变是不是成功了。

这就好比是考试结束了，得看看自己考得咋样。

要是没成功，那就得重新再来一遍。

基因定点突变的研究，那可是对生命科学有着重要意义的呀！它能让我们更好地了解基因的功能，为治疗各种疾病提供新的思路和方法。

总之呢，基因定点突变可不是件容易的事儿，但它的意义和价值那可是大大的。

咱可得好好研究，说不定哪天就能给人类带来巨大的福音呢！这就是基因定点突变，神奇又充满挑战的领域！你难道不想深入了解一下吗？。