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第五节酶的分离、纯化及活性测定1一、酶的分离、纯化•:一类由细胞内产生然后分泌到细胞外进行作用胞外酶生然后分到行作的酶，这类酶大多都是水解酶类。
•胞内酶:另一类酶在细胞内合成后在细胞内起催化作用的，这类酶数量较多。
的多2一般原则：般原则：防止强酸、强碱, 要求加入的化学试剂不使酶变性；在低温下操作，全部操作在低温0～4℃；在分离提纯过程中避免剧烈搅拌 在分离提纯过程中，避免剧烈搅拌；在提纯溶剂中加一些保护剂如少量EDTA 在提纯溶剂中加一些保护剂，如少量EDTA、少量β-巯基乙醇；在不破坏所需酶的条件下，可使用各种“激烈的烈”的手段。
3酶的分离提纯三个基本环节：第一抽提，即把酶从材料转入溶剂中制成酶溶液；第二纯化，即把杂质从酶溶液中除掉或从酶溶液中把酶分离出来；第三制剂，即将酶制成各种剂型。
在酶的分离纯化过程中．每步都须做三件事：第一第，测定酶活力(IU/ml)；第二，测定蛋白质含量(mg/ml)；第三，测量体积(ml)。
4基本操作程序微生物、动物、选材植物加入提取液抽提胞内酶先破碎抽提先净化处理再沉淀法分离离子交析分离纯化换层析，凝胶过滤，液相色谱，亲和色谱和超滤等5（一）酶的抽提（）酶的抽提1、破碎细胞对于细胞外酶可用水缓冲液浸泡过对于细胞外酶可用水、缓冲液浸泡过滤后，可得粗抽提液。
对于细胞内酶要破碎细胞、动物细胞较易破碎，通常用匀浆器捣碎机，制成较易破碎，通常用匀浆器、捣碎机，制成匀浆离心后可得酶抽提液。
细菌细胞壁较厚，需用超声波、溶胞壁较声溶菌酶等抽提。
酶等提62、酶的抽提酶的抽提一般的酶可用稀酸或稀碱的水溶液抽提出来。
抽提条件：提出来抽提条件⑴抽提溶的pH选择应该在酶的pH稳定，并离范围之内，并且最好远离等电点。
低温下抽提⑵低温下抽提（0～40C）7（二）酶的纯化（）酶的纯化抽提液中除含有所需有酶外，还含有其它大抽提液中除含有所需有酶外还含有其它大分子物质。
常用分离纯化的方法：①溶解度②电荷性质③大小或质量④亲和部位。
Chapter 3 酶的分离与纯化我们要研究或使用一种酶，首先要采用相关方法先得到它，因此酶的分离与纯化是酶的生产、应用及酶学性质研究的基础。
Section 1 酶制剂的制备过程一个完整的酶制剂制备方案应该包括：酶活力测定体系的建立、材料的选择、材料的预处理、酶的酶学性质初步研究、酶的分离与纯化、酶制剂的保存。
一、材料的选择注意把握植物的季节性、微生物的生长期（对数生长期）和动物的生理状态等。
二、材料的预处理（一）细胞破碎上节课我们提到根据酶的分布，可将酶分为胞内酶和胞外酶。
若是胞外酶，就不存在细胞破碎的问题，但是胞外酶的种类很少，绝大多数酶都属于胞内酶。
要想获得胞内酶，就得先进行细胞破碎，使酶从细胞内释放出来，这样才能进一步进行酶的提取和分离纯化。
细胞破碎的方法很多，有机械破碎法、物理破碎法、化学破碎法和酶溶法。
在实际使用时，我们要根据细胞的特性和酶的特性选择适宜的方法，有时也可以联合采用2种或2种以上的方法，以达到细胞破碎的效果，而又不影响酶的活性。
1、机械破碎法按照所用破碎机械的不同，又可以分为捣碎法、研磨法和匀浆法。
（1）捣碎法：常用于动物内脏、植物叶芽等比较脆嫩的组织细胞的破碎，也可以用于微生物，特别是细菌的细胞破碎。
（2）研磨法：常用于微生物和植物组织细胞的破碎。
（3）匀浆法：常用于破碎易于分散、比较柔软、颗粒细小的组织细胞。
大块的组织或者细胞团需要先用组织捣碎机或研磨器械捣碎分散后才能进行匀浆。
2、物理破碎法根据物理力的不同，可分为冻融法、渗透压法和超声波破碎法。
（1）冻融法：适用于易于破碎的细胞，如革兰氏阴性菌。
如将-20℃冷冻的细胞突然放进沸水浴中，或沸水浴中的热细胞突然放进-70℃冷冻，这样都可以使细胞破坏。
但是，在酶的提取时，要注意不能在过高的温度下操作，以免引起酶的变性失活。
（2）渗透压法：适用于易于破碎的细胞，如动物细胞或革兰氏阴性菌。
使用时，先将细胞分离出来，悬浮在高渗透压的溶液中，平衡一段时间后，将细胞迅速转入低渗透压的蒸馏水或缓冲溶液中，由于渗透压的作用而使细胞破碎。
酶的分离纯化摘要：本文概述了在实验中由于酶浓度、饱和度等不同条件下对酶进行分离纯化的适用方法。
酶的分离纯化有很多种方法，在纯化的工艺上有很大的不同，不同来源的酶在分离纯化中表现出不同的洗脱特性。
现有酶的分离纯化方法都是依据酶和杂蛋白在性质上的差异而建立的。
关键词：酶；分离；纯化；方法前言：酶的分离纯化工作，是酶学研究的基础。
酶的纯化过程在目前来说仍是一门实验科学。
一个特定酶的提纯往往需要经过多个实验的探索才能总结出一般经验规律。
酶的分离纯化又与其他蛋白质的纯化过程存在很大的差异，酶的分离纯化有其自己独有的特点：一是特定酶在细胞中的含量少，二是酶通过测定活力的方法可以加以跟踪，前者给实验带来困难，后者为实验提供了捷径。
正文：1. 酶的分离与纯化的概念[1]酶的分离与纯化是指将酶从细胞或其他含酶材料中提取出来，再与杂质分开，从而获得符合使用目的、有一定纯度和浓度的酶制剂的过程。
酶分离纯化的一般原则：①防止酶变性失活1．）酶纯化一般在低温条件下进行（0~4℃）2.）各种溶液应该用缓冲液，PH应调到使酶最稳定的PH3.）各种溶液中还可以加入酶保护剂②建立一个可靠和快速的测活方法方法专一、灵敏、精确、简便、经济③酶原料的选取选择目的酶含量丰富的原料，且要考虑取材方便、经济节约等因素2. 酶的分离纯化 2.1 细胞破碎[2]各种生物组织的细胞具有不同的特点，在采用破碎方法时，要根据细胞的性质，酶的性质来选取合适的破碎方法。
1.）机械破碎法通过机械运动所产生的剪切力作用，使细胞破碎的方法，称为机械破碎法，常用的有如下几种。
捣碎法：利用高速组织捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力，将组织细胞破碎。
常用于动物内脏、植物叶芽等脆嫩组织细胞破碎，也可用于微生物，尤其是细菌的细胞破碎。
此法在实验宝和生产规模均可采用。
研磨法：用研钵直接研磨。
常用于微生物的微生物材料的破碎。
匀浆法：利用高压匀浆泵、玻璃或Teflon加研棒匀浆器高速球磨机将细胞破碎。
第三章酶活性的测定及分离纯化在酶的分离纯化、性质研究以及酶制剂的生产和应用时，都要遇到对酶的活性、纯度及含量进行经常的、大量的测定工作，这是必不可少的指标。
酶活性是指酶催化一定化学反应的能力，检查酶的含量及存在，通常是用该酶在一定条件下催化某一特定反应的速度，即酶的活性来表示。
3.1 酶活性单位酶活性指的是酶制剂催化能力的大小，它既与酶蛋白的浓度有关，又与酶分子的催化能力大小有关。
酶活性用单位体积或单位质量酶制剂所含的酶单位来表示，即u/ml或u/mg。
3.1.1 实用单位不同的酶采用不同的标准。
如DNA聚合酶Ⅰ以在特定反应条件下，30分钟内催化10nmol dNTP合成为TCA（三氯乙酸）不溶物所需的酶量；又如T4 DNA连接酶的单位定义为：在20μl反应体积中，16℃，30分钟内，将50%的HindⅢ酶切的λDNA片段重新连接起来所需的酶量。
ACC合成酶的单位是：30℃，1小时转化SAM生成1nmol ACC所需的酶量。
3.1.2 国际酶活性单位1961年，国际酶学会议为酶活性单位规定了一个统一的标准，即在特定的条件下，1分钟转化1μmol底物，或转化1μN底物有关基团所需的酶量为1个单位(u)。
这是酶活性的国际单位。
3.1.3 Katal1972年，国际酶学委员会提出了一个新的酶活单位，叫katal(kat)，katal是一个很大的酶活单位，1 katal是指1秒钟转化1mol底物，或转化1N底物有关基团所需的酶量。
1 katal＝6×10u。
3.1.4 转换数在标准条件下，每摩尔单体酶或每摩尔催化中心在1分钟内转换底物成产物的μmol数，可表示为：1/Kp称为一个催化循环，单位为分钟。
3.1.5 比活性酶的纯度往往用比活性来表示，比活性是用同一酶制剂的酶活性除以蛋白质的质量，即单位质量蛋白质所具有的酶活性，常用的单位为u/mg protein。
酶制剂的比活性越高说明酶的纯度越高。
但在实际工作中，人们为了工作方便，往往对不同的酶使用不同的酶活单位。
3.2 酶活性测定的主要方法酶活性的测定应再最适酶反应条件下进行（温度、pH、离子强度、反应时间等），可测定反应物的减少量或产物的生成量。
随着反应的进行，底物减少，产物积累，会使得反应速度变慢。
因此，必须测定反应的初速度。
通常以底物浓度的变化在起始浓度的5%以内的速度为初速度的近似值。
酶反应速度可用单位时间内底物的减少量或产物的生成量来表示，而酶反应速度又与酶浓度密切相关。
3.2.1 分光光度法（spectrophotometry）硝酸还原酶将NO3－还原成NO2－，NO2－与加入的显色剂对－氨基苯磺酸和α－萘胺反应生成玫瑰红色的偶氮化合物，在520nm处比色可测定产物的生成量。
一些脱氢酶以NAD+或NADP+为辅酶，NAD+或NADP+在340nm处光吸收很少，而其还原形式NADH和NADPH在340nm处光吸收较大，因此可以测定340nm处的光吸收变化来检测NADH和NADPH的生成或减少，从而得知脱氢酶的活性。
对于一些底物或产物没有光吸收变化的酶反应，可以偶联一个适当的酶，以原初反应的产物作为偶联酶的底物，而偶联酶的产物可用分光光度法测定。
3.2.2 旋光测定法（polarimetry）若底物和产物的旋光性不同，可通过测定反应混合物的旋光性（方向和大小）变化来测定酶活性。
3.2.3 荧光法（fluorescence）氧化态的黄素（flavin）化合物发出强烈的荧光，还原态失去荧光。
NAD+和NADP+无荧光，而NADH和NADPH有460nm蓝色荧光。
荧光法灵敏度高。
3.2.4 同位素测定法（isotope determination）用放射性同位素标记底物，酶反应后分离产物，测产物的放射性强度。
此法灵敏度高，但分离产物较麻烦。
若底物或产物中有一种是气体，就易于分离。
3.2.5 电化学方法（electrochemistry）3.2.5.1 pH测定1pH单位的pH计测定反对于某些酶促反应过程中会产生H＋或减少H＋的反应来说，用1000应液的pH变化，或为保持pH不变而加入酸或碱，记录一段时间内加入的酸碱量。
3.2.5.2 电位测定在一些酶促氧化还原反应中，底物和产物具有不同的氧化还原电位，可用由一恒定微电流极化的两个铂电极之间的电位差来测定电位变化3.2.5.3 电流测定原理同上，以恒定电压的两个铂电极测电流变化。
3.2.6 化学反应法（chemical reaction）酶促反应一段时间后，取出一部分反应液，用化学方法分析底物或产物的量。
如ACC的测定：加HgCl2终止反应，加NaOCl-NaOH混合液使ACC转化成乙烯，再用气相色谱测乙烯。
3.3 酶的分离纯化3.3.1 酶分离纯化的一般原则酶的分离纯化是酶学研究的基础，对于不同的研究内容需要不同纯度的酶制剂。
因为酶是蛋白质，所以分离纯化蛋白质的方法也都适用于酶的分离纯化。
但酶又有特殊性，利用它们的特殊性还可以设计出特殊的纯化方法。
为了进行酶学研究，必须获得适量的酶。
首先要选择适当的材料，破碎细胞（酶存在于细胞外则不必破碎细胞）。
若酶主要存在于某一细胞器中，应尽量分离出该细胞器。
纯化酶的过程中要注意保护酶的活性，每一步骤后都要测量酶活性及蛋白质浓度，算出比活性、收率及纯化倍数。
若某一步骤的收率或纯化倍数太低，说明该步骤不合适。
酶纯化一般在低温条件下进行（0～4℃），但也有些酶有冷失活现象，如丙酮酸羧化酶在25℃下最稳定，低温下容易失活。
有些酶虽然本身耐高温，但只要其没有冷失活现象，也应在低温下操作，这样能抑制蛋白酶对目标酶的破坏作用。
各种溶液（抽提液、萃取液、层析用液等）应该用缓冲液，pH应调到使酶最稳定的pH。
若需要用到较酸或较碱的pH（如三氯乙酸沉淀），应尽量缩短时间。
有机溶剂沉淀时也要尽量缩短时间，尽快除去有机溶剂。
各种溶液中还可以加入酶保护剂，常用的酶保护剂有巯基保护剂（巯基乙醇、谷胱甘肽GSH、二硫苏糖醇DTT）、金属离子、EDTA、辅酶等，有时还可加入甘油、牛血清白蛋白、明胶。
用于酶纯化的方法主要有：分级沉淀、柱层析、萃取、制备电泳等。
3.3.2 材料的收集与处理3.3.2.1 原材料的选择生物体中酶含量一般很低，应选择含酶量高的材料作为原料。
选择适当的物种、器官、组织、细胞，甚至细胞器作为酶的来源，还应注意材料处于适当的发育阶段。
必要时还可以采用人工处理（环境条件、试剂处理）来提高酶的含量。
材料来源应尽量方便、价廉，动物主要是选择器官和组织（如兔肌、牛心等），植物要选择器官和发育阶段（如黄化幼苗、绿叶等），微生物要选择菌株（还可以通过诱变来提高酶的含量）。
要注意，不同来源的同一种酶，其结构和性质可能会有差异。
3.3.2.2 细胞的破碎动植物组织少量时可用研钵研磨或匀浆器匀浆，研磨前可用低温预冷或液氮速冻。
大量组织可用高速组织捣碎机。
将组织制成丙酮粉，具有含水量低，脱脂，比较稳定等优点，往组织匀浆中加入－15～－20℃的冷丙酮，抽滤，再加几次丙酮并抽滤，沉淀部分在室温下放置1小时左右至无丙酮味，然后转移到盛有五氧化二磷的真空干燥器中干燥，干燥后的丙酮粉置于低温冰箱中保存备用。
丙酮粉中的脂肪已被除去，可以避免脂质的干扰，并使原来不溶的酶（膜结合酶）溶于水。
从丙酮粉中提取酶可往丙酮粉中加抽提液搅拌，过滤或离心即可。
对于微生物细胞的破碎，可采用碱处理、溶菌酶加EDTA处理、渗透冲击、超声波破碎、固体剪切、液体剪切等方法。
3.3.2.3 酶的抽提在破碎细胞时应加入抽提液。
抽提液常由缓冲液、蛋白酶抑制剂（如苯甲磺酰氟PMSF）、EDTA、巯基保护剂、甘油、Mg2＋等组成。
若抽提的酶是膜结合酶，抽提液中还应含有非离子型的表面活性剂（Triton x-100、Tween 20、Tween 80等）。
3.3.3 酶的初步纯化酶的分离纯化是把目标酶与其他杂质分离开，使目标酶的纯度提高。
酶的纯度用比活性来衡量，以电泳结果为单带，且进一步纯化不能提高比活性为达到均一。
3.3.3.1 沉淀法1．盐析法不同的蛋白质在不同的盐浓度下溶解性不同，在低温下往酶溶液中慢慢加入某种盐，在不同的盐浓度下有不同的蛋白质沉淀出来，离心可获得不同的蛋白质沉淀组分，这叫分级沉淀。
常用的盐是硫酸铵，因为它在低温下溶解度高，对大多数酶无毒，价廉，有时对酶还有稳定作用。
2．有机溶剂沉淀常用来沉淀蛋白质的有机溶剂是乙醇、甲醇、丙酮。
不同的蛋白质在不同的有机溶剂浓度下沉淀出来。
3．三氯乙酸沉淀尽快恢复到中性pH。
4．PEG沉淀聚乙二醇对蛋白质有保护作用，用PEG分级沉淀纯化效果很好。
PEG2000、4000、6000、8000都可以用（平均分子量）。
沉淀法要注意酶溶液的pH、离子强度、蛋白质浓度、温度等条件。
沉淀法还能起到浓缩的作用。
对于耐热的酶还可以采用热变性的方法，高温下短时间处理，许多不耐热的蛋白质发生沉淀，离心后耐热的目标酶保留在上清液中。
3.3.3.2 透析与超滤1．透析将酶液装进透析袋中，置于适当的缓冲液中，在低温下搅拌，更换几次透析液，可除去酶液中高浓度的盐及一些小分子杂质，也能起到换缓冲液的作用。
在装有酶液的透析袋外加固体Sephadex或PEG吸水，可浓缩酶液。
2．超滤超滤也是一种既可纯化又可浓缩的技术，他是利用不同孔径的超滤膜，截留下不同分子量的蛋白质，从而使分子量不同的蛋白质分离开，从而达到浓缩和纯化的目的。
超滤的方式有真空吸滤和离心超滤两种。
蛋白质的超滤特性是可变的，这取决于许多因素。
Westmacott（1972）研究了大肠杆菌部分纯化的青霉素酶制剂的超滤特性，他使用一种截留分子量30,000的各向异性膜，缓冲液的pH和盐浓度不同，酶的通透量变化在1.6%到55%之间；最高通透量在pH5.1～6.2，接近酶的等电点；在pH8.0时，把缓冲液的浓度从1mmol/L提高到30mmol/L，酶的通透量从1.6%增加到20%；加EDTA也能提高酶的通透量，而尿素有相反的作用。
通过控制影响蛋白质超滤特性的因素，可使纯化倍数得到明显的提高，如经超滤可使大肠杆菌青霉素酶的纯度提高7倍。
超滤也可用于快速除去大量的低分子溶质，如从酶液中去掉乙醇或脱盐，这种过程称为析滤。
3.3.4 酶的进一步纯化3.3.4.1 吸附层析羟基磷灰石（hydroxyapatite，HA）是最常用于蛋白质分离的一种吸附剂，它是一种白色颗粒，分子式为Ca10(PO4)6(OH)2，它非特异性地吸附蛋白质。
羟基磷灰石分离大分子的机理还不完全清楚，一般认为HA的结晶表面外露的Ca2+和PO43－参与大分子的分级分离。
酸性和中性的蛋白质与HA上的Ca2+位点结合，高浓度的NaCl、KCl或CaCl2的存在既不影响两者的结合，也不影响洗脱。
