pmRNA IRES—hKDR(Ig1-3)重组质粒的构建、表达及鉴定

河南农业科学，2023，52（6）：131‐138Journal of Henan Agricultural Sciencesdoi ：10.15933/ki.1004‐3268.2023.06.014稳定表达猪δ冠状病毒S1蛋白CHO 细胞系的构建与鉴定孙雪珂1，2，丁培阳3，王思桥1，2，刘思源2，李明慧2，常泽杰2，陈艺兰2，李瑞琪2，张改平1，2，4（1.河南农业大学生命科学学院，河南郑州450002；2.河南省农业科学院动物免疫学重点实验室，河南郑州450002；3.郑州大学生命科学学院，河南郑州450001；4.江苏高校动物重要疾病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏扬州225009）摘要：为构建稳定表达猪δ冠状病毒（PDCoV ）S1蛋白的CHO 细胞系，利用电转染技术将重组质粒pCGS3-S 1转染至CHO 细胞，通过有限稀释法筛选稳定表达重组S1蛋白的单克隆细胞系。

利用阴离子交换层析和凝胶过滤层析方法对重组S1蛋白进行纯化，采用间接ELISA 方法检测重组S1蛋白活性。

将纯化的重组S1蛋白免疫BALB/c 小鼠，通过间接ELISA 、间接免疫荧光试验（IFA ）及病毒中和试验对重组S1蛋白免疫原性进行检测。

结果显示，稳定表达PDCoV S1蛋白的CHO 细胞系成功建立，并获得了纯度高于90%、产量为28.5mg/L 的重组S1蛋白；且重组S1蛋白与PDCoV 阳性血清反应性良好，具有良好的免疫原性，中和效价为1∶128。

综上，成功建立了稳定表达PDCoV S1蛋白的CHO 细胞系，且纯化获得的重组S1蛋白具有良好的生物学活性。

关键词：猪δ冠状病毒；S1蛋白；CHO 细胞；稳定表达；蛋白质纯化中图分类号：S855.3文献标志码：A文章编号：1004-3268（2023）06-0131-08收稿日期：2023-01-14基金项目：河南省重大科技专项（221100110600）作者简介：孙雪珂（1997-），女，河南新乡人，在读硕士研究生，研究方向：动物免疫学。

真核表达质粒pcDNA3.1a-FGFR1构建及意义王笑;严金川;龚杰【摘要】Objective: To construct a recombinant eukaryotic expression plasmid pcDNA3. 1 a-FGFR1 .Methods: The fragnent of FGFR1 was amplificated by PCR, after purification the PCR products of FGFR1 and eukaryotic expression plasmid pcDNA3. 1 a were cut and FGFR1 were inserted into pcDNA3. 1 a,and then transformed into DH5α strain and positive clone was selected. The recombinant plasmid was confirmed by restriction endonuclease analysed and sequencing test. Results: DNA sequencing and restriction endonuclease digestion analysis indicated that the eukaryotic expression plasmid pcDNA3. 1 a-FGFR1 was constructed successfully. Conclusion : Construction of pcDNA3. 1 a-FGFR1 eukaryotic expression plasmid was successful. This study for the next step on angiocardiopathy research laid the experimental foundation.%目的:构建真核表达质粒pcDNA3.1a-FGFR1.方法:通过PCR扩增FGFR1目的片段,双酶切纯化PCR产物及pcDNA3.1a,将扩增的FGFR1基因片段插入pcDNA3.1a线性质粒,即构建成pcDNA3.1a-FGFR1真核表达质粒,将质粒转化感受态DH5α菌株,筛选阳性克隆行双酶切鉴定及测序鉴定.结果:酶切及测序结果表明pcDNA3.1a-FGFR1真核表达质粒构建成功.结论:pcDNA3.1a-FGFR1真核表达质粒构建成功,为下一步对心血管疾病研究奠定了一定的实验基础.【期刊名称】《江苏大学学报（医学版）》【年(卷),期】2011(021)004【总页数】4页(P333-336)【关键词】碱性成纤维细胞生长因子1型受体;pcDNA3.1a载体;真核表达质粒;心血管疾病【作者】王笑;严金川;龚杰【作者单位】江苏大学附属医院心血管内科,江苏,镇江,212001;江苏大学附属医院心血管内科,江苏,镇江,212001;江苏大学附属医院心血管内科,江苏,镇江,212001【正文语种】中文【中图分类】R393成纤维细胞生长因子1型受体(fibroblast growth factor receptor 1，FGFR1)属于酪氨酸激酶受体家族［1］，是碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的高亲和性受体，主要通过与配体bFGF结合后作用于血管平滑肌细胞，促进其增生与分化［2］。

如何阅读基因载体图谱1、按属性分类：病毒载体和非病毒载体病毒载体是一种常见的分子生物学工具，可将遗传物质带入细胞，原理是利用病毒具有传送其基因组进入目的细胞，进行感染的分子机制。

可发生于完整活体或是细胞培养中。

可应用于基础研究、基因疗法或疫苗。

用于基因治疗和疫苗的病毒载体应具备以下基本条件：（1）携带外源基因并能包装成病毒颗粒；（2）介导外源基因的转移和表达；（3）对人体不致病；（4）在环境中不会引起增殖和传播。

非病毒载体一般是指质粒DNA。

2、按进入受体细胞的类型分类：原核载体、真核载体、穿梭载体（含原核和真核2个复制子，能在原核和真核细胞中复制，并可以在真核细胞中有效表达）。

3、按功能分类：克隆载体、表达载体克隆载体：具有克隆载体的基本元件（Ori，Ampr，MCS等），可以携带DNA片段或外源基因进入受体细胞并克隆和大量扩增DNA片段（外源基因）的载体。

表达载体：克隆载体中加入一些与表达调控（具有转录/翻译所必需的DNA顺序）有关的元件即成为表达载体。

1、复制起始位点Ori：即控制复制起始的位点。

Ori的箭头指复制方向，其他元件标注的箭头多指转录方向（正向）。

2、抗生素抗性基因：可以便于加以检测，如Amp+ ，Kan+（1）Ampr：水解β-内酰胺环，解除氨苄的毒性。

（2）tetr ：可以阻止四环素进入细胞。

（3）camr：生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。

（4）neor（kanr）：氨基糖苷磷酸转移酶，使G418（卡那霉素衍生物）失活。

（5）hygr：使潮霉素β失活。

3、多克隆位点：MCS克隆携带外源基因片段，它具有多个限制酶的单一切点，便于外源基因的插入。

如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，便于筛选。

决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。

还要再看外源DNA插入片段大小。

质粒一般只能容纳小于10kb的外源DNA片段。

一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。

食品生物技术绪论名词解释1 食品生物技术食品生物技术(food biotechnology)：是现代生物技术在食品领域中的应用，是指以现代生命科学的研究成果为基础，结合现代工程技术手段和其它学科的研究成果，用全新的方法和手段设计新型的食品和食品原料2 基因工程基因工程：通过一系列技术操作过程，获得人们预先设计好的生物，该生物所具有的特性往往是自然界不存在的。

是用人工的方法把不同生物的遗传物质（基因）分离出来，在体外进行剪切，拼接，重组形成基因重组体，然后再把重组体引入宿主细胞或个体中得以高效表达，最终获得人们所需要的基因产物。

3 细胞工程细胞工程(cell engineering)：在细胞水平研究、开发、利用各类细胞的工程。

是人们利用现代细胞分子生物学的研究成果，根据需求设计改变细胞的遗传基础。

4 蛋白质工程蛋白质工程(protein engineering)：通过对Pr化学、Pr晶体学和动力学的研究，获得有关Pr理化特性和分子特性的信息，以此为基础有目的设计改造编码蛋白的基因，通过基因工程技术获得可以表达Pr的转基因生物系统，该生物系统可以是转基因微生物、转基因植物、转基因动物，或细胞系统。

最终产出改造过的Pr5 酶工程酶工程(enzyme engineering)：利用酶催化作用进行物质转化的技术，是酶学理论、基因工程、蛋白质工程、发酵工程相结合而形成的一门新技术6 发酵工程发酵工程是将微生物学、生物化学和化学工程等学科基本原理有机结合，是建立在基因工程技术基础上的一门应用技术性学科。

7 生物工程下游技术生物工程下游技术(biotechnique downstream processing)：将发酵工程、酶工程、蛋白质工程和细胞工程生产的生物原料，经过提取、分离、纯化、加工等步骤，最终形成产品的技术二问答题1 食品生物技术研究内容包括哪些？内容：基因工程、细胞工程、蛋白质工程、酶工程、发酵工程、生物工程下游技术、现代分子检测技术2 食品生物技术在食品工业发展的地位如何?地位食品生物技术研究内容已涉及到食品工业的方方面面，从原料到加工无处不存在食品生物技术的痕迹。

基因工程中PCR技术常考知识点的归纳与拓展作者：***来源：《中学教学参考·理科版》2024年第05期［摘要］PCR技术是基因工程中获取和扩增目的基因的常用方法之一，其中常考查到的知识点有与引物相关的问题、酶切片段分析及变性、复性、延伸等环节的相关分析等。

文章结合典型考题对这几个问题进行归纳分析。

［关键词］基因工程；PCR技术；常考知识点［中图分类号］ G633.91 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1674-6058（2024）14-0080-04【名师简介】曾凡洪，中学高级教师，武汉市学科带头人，曾担任高中生物奥赛主教练。

先后在《生物学教学》《中学生物教学》《中学教学参考》《高中生学习》等报纸杂志上发表文章50余篇，并参与多本著作的编写。

聚合酶链式反应（PCR）是一种用于扩增特定DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，其最大特点是能将微量的DNA大幅增加。

因此，无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出一丁点的DNA，就能用PCR加以放大后进行比对，这也是“微量证据”的威力之所在。

PCR的理论依据是DNA复制，一般的中学实验室很难具备相应的实验设备和操作条件，因此对于这块知识，基本上是以理论讲解为主。

目前的一些考题涉及的PCR知识已经比较具体和深入了，具有一定的难度。

本文结合典型考题对基因工程中PCR技术常考知识点进行归纳分析。

一、与引物相关的问题引物是一小段单链DNA或RNA，是DNA复制的起始点。

在引物的3＇—OH上，核苷酸以酯键形式进行加成，因此引物的3＇—OH必须是游离的。

引物分为两种：存在于自然生物的DNA复制引物（RNA引物）和PCR中人工合成的引物（通常为DNA引物）。

一般所说的引物是指DNA引物。

PCR中的引物是人工合成的两段寡脱氧核苷酸序列。

（一）设计引物的基本要求根据DNA复制原理和引物的作用，在设计引物时，要注意以下几个基本问题。

基础医学与临床Basic & Clinical MedicineMay 2021Vol.41 No.52021年5月 第41卷第5期文章编号：1001-6325(2021)05-0653-08 研究论文RNA 靶向的CRISPR/CasRx 系统在小鼠精原细胞系GCl-spg 中的应用李梦真，柳 俊，邹定峰，缪时英，王琳芳，宋伟，李凯**收稿日期：2021-01-26 修回日期：2021-03-20基金项目：国家自然科学基金(31970794,32000586)* 通信作者(corresponding author) ：likai@ (中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院医学分子生物学国家重点实验室，北京100005) 摘要：目的探究CRISPR/CasRx 介导的RNA 水平的基因敲降在小鼠精原细胞系GCl-spg 的应用。

方法利用同源重组的方法构建 EFla core promoter. CasRx. SV40. U6. DRs 表达质粒(CasRx-gRNA)和 EFla. EGFP,EFla. mCherry 、EFla. tdToamto 3种荧光蛋白表达质粒。

在人胚肾细胞系HEK-293T 内瞬时转染3种荧光蛋白表达质粒和CasRx-gRNA 表达质粒，通过荧光强度、Western blot 检测外源基因(荧光蛋白、EGFP 和mCherry)的敲降情况。

在HEK-293T细胞内转染CasRx-gRNA,通过q-PCR 检测内源基因mRNA 和IncRNA 干扰后的表达水平。

在小鼠精原细胞系GC1 内瞬时转染外源基因eg 加、mCherry 和CasRx-gRNA 表达质粒并通过以上方法检测外源基因(荧光蛋白)沉默效率。

结 果 成功构建了 CasRx-gRNA 和3种荧光蛋白表达质粒。

在HEK-293T 细胞内CRISPR/CasRx 介导的RNA 干扰外源基因(e 曲、mCherry )和内源基因(mRNA 、lncRNA )后，表达水平均显著下调(P<0.01)o 在小鼠精原细胞系GC1内验 证CRISPR/CasRx 系统,可有效和特异敲降外源基因e 加、mCherry 。

增殖抑制基因（HSG）RNAi 慢病毒载体的构建与鉴定楼煜清;李榕;刘洁琳;张岩巍;刘雅;王佐广;温绍君;韩宝惠【摘要】Objective To construct and identify the efficacy of a lentiviral vector harboring RNA interference sequence targeting hyperplasia suppressor gene(HSG). Methods Four siRNA sequences targeting HSG mRNA were designed. The lentivirus vectors of GCSIL-GFP-HSG were constructed and confirmed by DNA sequencing. The 293T cells were co-transfected with pGCSIL-GFP-HSG,pHelper1. 0 and pHelper2. 0 in order to produce virus stocks. The titer of the virus was also tested. The lentivirus was transfected to human A549 lung adenocarcinoma cells. The expression of HSG gene was analyzed by real-time PCR. Results DNA sequencing suggested that the DNA sequences were consisted with the design,which meant that the RNAi sequence targeting the human HSG gene was correct. Examination of the co-transfected cells by fluorescence microscopy suggested that the cells grew well and had strong fluorescence intensity. The titer of the virus was 3× 108 TU / ml. Real-time PCR showed that the expression of the HSG gene was knockdown after the lentivirus transfected to A549 cells. Conclusions The lentiviral&nbsp;vector of the HSG gene of Homo sapiens was successfully constructed,which could be further used in oncology.%目的：为研究 HSG 基因不同表达程度对肺癌细胞的影响，构建并鉴定HSG 基因RNA 干扰慢病毒表达载体，以建立HSG 基因沉默的人肺癌细胞株。

如何构建一个大肠杆菌高效表达的分子克隆？影响基因在大肠杆菌中表达的因素是多方面的，以下我就从载体选择、启动子、终止子、核糖体结合位点、密码子、质粒拷贝数、表达产物的稳定性、受体细胞代谢等方面说明构建大肠杆菌高效表达的方法。

一、表达载体表达载体应具有以下条件：1、能够独立复制。

根据载体复制的特点，可分为严谨型和松弛型。

严谨型载体伴随宿主染色体的复制而复制，在宿主中拷贝数很少（1~3个）；松弛型的复制而不依赖于宿主染色体，在宿主细胞中的拷贝数可多达3000个。

2、应具有灵活得多克隆位点和方便的筛选标记，便于外源基因的克隆、鉴定和筛选。

而且多克隆位点应位于启动子序列之后，以使外源基因表达。

3、应具有很强的启动子，能被大肠杆菌的RNA聚合酶识别。

4、应具有使启动子受抑制的阻遏子，只有在受到诱导时才能进行转录。

阻遏子的阻遏作用可由物理（如温度）、化学（如IPTG、IAA等）因素进行调节，这样可人为地选择启动子启动转录mRNA的时机。

因外源基因的高效表达往往会抑制宿主细胞的生长、增殖。

而阻遏子可使宿主细胞免除此不良影响。

例如可使宿主细胞快速生长增殖到相当量，再通过瞬时消除阻遏，使所表达的蛋白质在短时间内大量积累，同时可减少表达产物的降解。

5、应具有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录其他无关基因。

同时强终止子所产生的mRNA较为稳定。

诱导表达时，由于强终止子所致的高水平转录反过来会影响质粒DNA自身的复制，从而引起质粒的不稳定或脱质粒现象。

因此在外源基因的下游安置强终止子可以克服由质粒转录引起的质粒不稳定。

6、所产生的mRNA必须有翻译的起始信号，即起始密码AUG和SD序列。

二、启动子启动子是表达载体最重要的组成成分，这是因为启动子控制了基因表达的第一个阶段，决定了mRNA合成的速度。

启动子是在转录水平上影响基因表达。

转录的最大速率取决于启动子中碱基的组成，往往会因为一个碱基的不同，启动子效率可能提高上千倍。

人胰岛素的制备一、获得目的基因从供体细胞中提取mRNA，以其为模板，在反转录酶的作用下，反转录合成胰岛素mRNA互补DNA，再以cDNA第一链为模板，在反转录酶或DNA聚合酶I的作用在，最终合成编码它的双链DNA序列。

即得到了目的基因。

反转录-聚合酶链反应法(一)从人体细胞内提取胰岛素基因转录的mRNA1, 细胞总RNA的提取:取胰岛B细胞，用PBS洗后，加入TRIZOL试将细胞破裂，后用DEPC处理，多次离心后，取RNA白色沉淀，测OD值，电泳。

2 ，从总RNA中分离mRNA：取上述提取的总RNA若干，加入Buffer OBB ，Oligotex Suspension ，打匀。

70℃水浴（裂解RNA的二级结构），20-30℃条件下，静置（让Oligotex与mRNA结合）。

将Oligotex/mRNA复合物的沉淀加到EP管SPIN柱上高速离心，加Buffer将其他RNA洗脱，最后用琼脂糖凝胶电泳纯化mRNA。

（二）mRNA转录合成cDNA第一链cone 第一链的合成加入上步获得的mRNA和适当引物于EP管中，加入RNase-free water，混匀后,70℃反应10分钟，反应完成后,立刻将反应体系置于冰上5min;稍微离心一下,顺序加入缓冲液、RNA酶抑制剂、反转录酶、dNTP （加入放射性同位素利于检验），混匀，稍微离心反应物之后,42℃放置2分钟。

取出置于冰上。

电泳分析，同位素活性测定。

（三）PCR法扩增，特异合成目的cDNA链通过胰岛素的特异引物，用PCR法进行扩增，特异的合成胰岛素的cDNA链。

PCR法的操作步骤：预变性引物退火引物延伸循环25-35次最后延伸前端引物：✧5’-ggt tcc gga tct ggt tct ggt tct ctg gtc ccc cgc ggt agt caccac cac cac cac cac cgt ttt gtg aac caa cac ctg tgc ggc-3’✧后端引物：✧5’-agt gtc gac tta gtt gca gta gtt ctc cag ctg gta-3’二、组建重组质粒采用pQE--30质粒作为载体，用双酶切法进行基因重组。