STAT6-ORF表达载体的构建与鉴定

中国生化药物杂志２０１４年第８期总第３４卷论著基础研究

ＳＴＡＴ６－ＯＲＦ表达载体的构建与鉴定

刘锦宙１，杨燕２，谢而付３

（１．江西省宜春市人民医院消化内科，江西宜春３３６０００；２．江西省宜春职业技术学院，江西宜春３３６０００；

３．南京医科大学医学科学部，江苏南京２１００２９）

［摘要］目的本文旨在构建ＳＴＡＴ６一ＯＲＦ表达载体，包装成慢病毒颗粒。方法应用嵌套ＰＣＲ法从生长状态良好的２９３Ｆｒ细

胞的ｃＤＮＡ中扩增ＳＴＡＴ６的完整读码框片段（２５４４ｂｐ），根据需要在引物的５’端分别引入ＣｌａＩ和ＭｌｕＩ酶切位点，将ＰＣＲ产物克隆

到ｐＭＤ２０Ｔ载体上，得到ｐＭＤ２０Ｔ—ＳＴＡＴ６－ＯＲＦ克隆；测序验证后，用ＣｌａＩ和ＭｈＩ双酶切ｐＭＤ２０Ｔ．ＳＴＡＴ６克隆，回收酶切产物得到的

ＳＴＡＴ６一ＯＲＦ片段，通过Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接到ｐＬＶＴＨｍ表达载体上，经双酶切和测序验证正确，获得ｐＬＶＴＨｍ．ＳＴＡＴ６．ＯＲＦ表达载体。

结果构建带有增强绿色荧光蛋白ＥＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ

ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｐｒｏｔｅｉｎ）标记的ＳＴＡＴ６．ＯＲＦ表达载体，包装成慢病毒颗粒，结果

表明成功构建及包装带ＳＴＡＴ６－ＯＲＦ目的片段的慢病毒表达载体。结论ｐＬＶＴＨｍ—ＳＴＡＴ６过表达载体构建成功，可以进行慢病毒包

装与鉴定。

［关键词］ＳＴＡＴ６－ＯＲＦ；慢病毒颗粒；增强绿色荧光蛋白

［中图分类号】Ｒ３９２．１２［文献标识码】Ａ［文章编号】１００５—１６７８（２０１４）０８—００６９—０４

ＥｆｆｅｃｔｏｆＮｅｓｆａｔｉｎ－１

ｏｎｓｅｃｒｅｔｉｏｎｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆ

ｇａｓｔｒｉｃａｃｉｄａｎｄ

ｐｅｐｓｉｎｉｎ

ｒａｔ

ｇａｓｔｒｉｃｍｕｃｏｓａ

ＬＩＵＪｉｎ．ｚｈｏｕｌ，ＹＡＮＧＹａｎ２，ＸＩＥＥｒ．ｆｕ３

（１．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＩｎｔｅｒｎａｌ

Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ＹｉｅｈｕｎＰｅｏｐｌｅ’ＳＨｏｓｐｉｔａｌｏｆ

ＪｉａｎｇｘｉＰｒｏｖｉｎｃｅ，Ｙｉｃｈｕｎ，３３６０００，Ｃｈｉｎａ；２．ＹｉｃｈｕｎＶｏｃａｔｉｏｎａｌ

Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ

Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｙｉｃｈｕｎ，３３６０００，Ｃｈｉｎａ；３．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＮａｎｊｉｎｇＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ，２１００２９，Ｃｈｉｎａ）

［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｏｂｓｅｒｖｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆＮｅｓｆａｆｉｎ一１

ｏｎｓｅｃｒｅｔｉｏｎｏｆ

ｇａｓｔｒｉｃａｃｉｄａｎｄ

ｐｅｐｓｉｎｉｎｒａｔｓｇａｓｔｒｉｃｍｕｃｏｓａ，ａｎｄｅｘｐｌｏｒｅｉｔｓ

ｐｏｓｓｉｂｌｅ

ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１８ｍａｌｅＳＤｒａｔｓａｆｔｅｒｉｎｔｒａｅｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｃａｔｈｅｔｅｒｗｅｒｅｄｉｖｉｄｅｄ

ｉｎｔｏ，ｈｉｇｈｄｏｓｅ

ｇｒｏｕｐ，ｌｏｗｄｏｓｅ

ｇｒｏｕｐａｎｄｃｏｎｔｒａｌ

ｇｒｏｕｐ，ｅａｃｈ

ｒａｔＷａｓｉｎｊｅｃｔｅｄｗｉｔｈＮｅｓｆａｔｉｎ一１０．０５

ｇ，０．５ｇａｎｄ

５肛Ｌｅｑｕａｌｖｏｌｕｍｅｓｔｅｒｉｌｅｗａｔｅｒｂｙｔｈｅｌａｔｅｒａｌｖｅｎｔｒｉｃｌｅｉｎｊｅｃｔｉｏｎｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｇａｓｔｒｉｃｊｕｉｃｅｗｅｒｅ

ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ

ｂｙｐｙｌｏｒｕｓｌｉｇａｔｉｏｎ，ａｆｔｅｒ３ｈｔｈｅｒａｔｓｗｅｒｅｅｘｅｃｕｔｅｄｔｏｍｅａｓｕｒｅ

ｃｈａｎｇｅｓｏｆｔｈｅｉｒ

ｇａｓｔｒｉｃａｃｉｄａｎｄ

ｐｅｐｓｉｎ，ａｎｄＨ＋－Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅ

ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓ

ｉｎｇａｓｔｒｉｃｔｉｓｓｕｅｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄ

ｂｙＲＴ・ＰＣＲ。ｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆｈｉｓｔｉｄｉｎｅｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ，ＨＤＣ）ｉｎｇａｓｔｒｉｃｍｕｃｏｓａＷａｓ

ｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＷｅｓｔｅｍ

ｂｌｏｔ，ｈｉｓｔａｍｉｎｅｃｏｎｔｅｎｔｉｎｇａｓｔｒｉｃｍｕｃｏｓａＷａｓｄｅｔｅｃｔｅｄ

ｂｙＥＬＩＳＡ．ＲｅｓｕｌｔｓＡｆｔｅｒ３ｈｏｆｒａｔｓｗｉｔｈＮｅｓｆａｔｉｎ－１ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ，ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈ

ｃｏｎｔｒｏｌ

ｇｒｏｕｐｗｉｔｈ

ｅｑｕａｌｖｏｌｕｍｅｏｆｓｔｅｒｉｌｅｗａｔｅｒｆｏｒｉｎｊｅｃｔｉｏｎ，ｔｈｅｓｅｃｒｅｔｉｏｎｏｆｇａｓｔｒｉｃａｃｉｄａｎｄｐｅｐｓｉｎｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｒｅｄｕｃｅｄ，ｔｈｅｒｅｗａｓａｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ

ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（Ｐ＜０．叭）．Ｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｏｆｐｅｐｓｉｎｓｅｃｒｅｔｉｏｎｌｅｖｅｌｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｔｗｏ

ｇｒｏｕｐｓＷａｓｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ（Ｐ＜０．０５）．Ｈｉｓｔａｍｉｎｅｓｅｃｒｅｔｉｏｎｉｎ

ｒａｔｇａｓｔｒｉｃｍｏｃｏｓａｄｅｃｌｉｎｅｄ．ｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅＷａｓ

ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ（Ｐ＜０．０５）．Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ，ａｆｔｅｒｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ｔｗｏｇｒｏｕｐｓｏｆｒａｔｓ

ｇａｓｔｒｉｃＨ＋一Ｋ＋ＡＴＰ

ｅｎｚｙｍｅｍＲＮＡ

ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎＷａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｒｅｄｕｃｅｄ，ｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅＷａｓ

ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ（Ｐ＜０．０１）．ＭｅａｎｗｈｉｌｅＨＤＣ

ｐｒｏｔｅｉｎ

ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎ

ｒａｔｇａｓｔｒｉｃｍｕｃｏｓａｉｎ

ｈｉｇｈｄｏｓｅ

ｇｒｏｕｐ，ｌｏｗｄｏｓｅｇｒｏｕｐｄｅｃｒｅａｓｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ

ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌ

ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅｐｒｅｓｅｎｃｅｏｆ

ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ，

ｗｉｔｈｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ（Ｐ＜０．０５）．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＩｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｅｕｌａｒｉｎｊｅｃｔｉｏｎ

Ｎｅｓｆａｔｉｎ一１，ｃｏｕｌｄｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅｓｅｃｒｅｔｉｏｎｏｆｇａｓｔｒｉｃａｃｉｄａｎｄｐｅｐｓｉｎ，

ａｎｄｉｔｓｍｅｃｈａｎｉｓｍｍａｙｉｎｈｉｂｉｔｇａｓｔｒｉｃａｃｉｄｓｅｃｒｅｔｉｏｎｂｙａｆｆｅｃｔｉｎｇｔｈｅｃｅｎｔｒａｌ

ｎｅｒｖｏｕｓｓｙｓｔｅｍ，Ｈ＋－Ｋ＋ＡＴＰｅｎｚｙｍｅｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ

ｏｆｋｅｙｅｎｚｙｍｅｓ．ｉｎｈｉｓｔａｍｉｎｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓｐａｔｈｗａｙ．

［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ｌａｔｅｒａｌｖｅｎｔｒｉｃｌｅｉｎｊｅｃｔｉｏｎ；ｒａｔ；ｇａｓｔｒｉｃ

ａｃｉｄ；ｐｅｐｓｉｎ

在免疫细胞中，ＳＴＡＴ６在ＩＬ４或ＩＬ－１３的刺激下，通过ＪＡＫ

激酶ｊａｎｕｓｋｉｎａｓｅ，ＪＡＫ）的作用，胞质中非磷酸化（失活状态）的

ＳＴＡＴ６蛋白被磷酸化（激活）后形成二聚体，进入细胞核内，识别

资助项目：国家自然科学基金｛８１１０１３２２）

作者简介：刘锦宙，男。本科，副主任医师。研究方向：消化内科．Ｅ—ｍａｉｌ：

ｑｃｈｌ８２１４６００６４＠１６３．ｔｏｍｏ核内特异的ＤＮＡ结合元件并与之结合，启动下游特定基因的表

达，产生相应的生物学效应，如ＩｇＥ的产生，Ｔｈ２细胞的分化及淋

巴细胞的发育等¨“。但越来越多的研究表明，该信号与癌症的

发生发展也密切相关∞。－。长期慢性的炎症可以诱发癌症，但２

者分子交叉机制目前仍不清楚１８。…。推测可能与ＩＬ４．ＳＴＡＴ６信

号所介导功能的转变密切相关。１“。本研究选择能够高效率感

染目的细胞的慢病毒载体ｐＬＶＴＨｍ为骨架构建ＳＴＡＴ６．ＯＲＦ表

一∞一

万方数据论著基础研究中国生化药物杂志２０１４年第８期总第３４卷

达载体。

１材料与方法

１．１实验材料

１．１．１细胞株、菌株和质粒：人胚肾ＨＥＫ２９３ＦＴ细胞株，大

肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ，Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＩ－ｌＳｏｔ均由南方医科大学基因工

程研究所保存。

慢病毒载体ｐＬＶＴＨｍ由南方医科大学基因工程研究所提

供，ｐＬＶＴＨｍ能表达ＥＧＦＰ，载体ｐＭＤＴＭ２０－Ｔｖｅｃｔｏｒ为日本

ＴａＫａＲａ公司产品。

１．２实验方法

１．２．１人胚肾ＨＥＫ２９３ＦＦ细胞株的总ＲＮＡ提取与纯化：

ＴＲＩｚｏｌ法提取ＲＮＡ，异丙醇纯化ＲＮＡ，按下列步骤操作：

细胞按１×１０６爪／ｍＬ密度接种于６孑Ｌ板培养，经处理后弃

去上清，每孔加入１ｍＬＴＲＩｚｏｌ（ＴＡＫＡＲＡ公司产品），静置５ｍｉｎ

充分裂解（ＴＲＩｚｏｌ变粘稠）后吸到１．５ｍＬＥＰ管中，或液氮速冻后

一８０℃保存备用。加２００ＩＬＬ氯仿剧烈振荡，室温静置５ｍｉｎ，

４ｏＣ，１２０００ｇ离心１５ｍｉｎ。将上清移到新ＥＰ管，加等体积（约

５００ＩＬＬ）异丙醇混匀，室温静置１０

ｒａｉｎ，４℃，１２０００ｇ离心１０

ｍｉｎ。

弃上清，５００

ＩｘＬ７５％乙醇洗涤；４℃，１２０００ｇ离心２ｍｉｎ，重复１

次。空甩１次（常温１２０００ｇ离心１ｍｉｎ）。超净台内把柱子盖打

开吹ｌ～２ｍｉｎ，将柱子放到新的１．５ｍＬＥＰ管。加入１０～４０斗Ｌ

ＤＥＰＣ（依材料多少而稀释），６２℃２ｍｉｎ，常温１２０００ｇ离心

１ｍｉｎ，管内即为ＲＮＡ。取１ＩｘＬ用分光光度计（７２２Ｓ型，ｅｐｐｅｎｄｏｆｆ

公司，ＡＧ）检测纯度和浓度，１¨Ｌ进行琼脂糖电泳（配制新鲜的

ｌ％琼脂糖凝胶，置换干净ＴＡＥ缓冲液进行电泳）检测其完整性，

余下部分立即保存于一８０℃超低温冰箱中，或立即用于反转录

反应。

１．２．２反转录：根据ＰｒｉｍｅｒＳｅｒｉｐｔ“ＲＴ—ＰＣＲ试剂盒步骤进

行操作：在ｍｉｃｒｏｔｕｂｅ中配制下列混合液：ｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ（１０ｍＭ

ｅａｃｈ），１

ｔｘＬ；ｏｌｉｇｏｄＴｐｒｉｍｅｒ（２．５斗Ｍ），１斗Ｌ；ｔｏｔａｌＲＮＡ，１００

Ｐｇ一

１Ｉｘｇ；ＲＮａｓｅｆｒｅｅｄＨ２０，１０ＩｘＬ。ＲＮＡ反应液离心，６５

ｏＣ，５ｍｉｎ处

理，迅速转到冰上冷却，离心数秒钟使模板ＲＮＡ／弓ｌ物等的混合

液聚集于ｍｉｃｒｏｔｕｂｅ管底部。在上述ｍｉｃｒｏｔｕｂｅ管中配制下列反

转录反应液：上述变性、退火反应液１０

ｉｘＬ；５ＸＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＢｕｆｆｅｒ

４

ＩＬＬ；ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＲＮａｓｅ（ｆｏｒ２Ｓｔｅｐ）０．５¨Ｌ；ＲＮａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ

（４０Ｕ／ＩＪ．Ｌ）５ＩｘＬ；总体积２０¨Ｌ。在ＰＣＲ仪上４２℃（一５０℃）

１５—３０ｍｉｎ进行反转录反应，之后７０℃５ｍｉｎ进行反转录酶的

失活反应，立即到冰上冷却，之后４℃保存。反应完毕后，取

１止ｃＤＮＡ用分光光度计（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司，ＡＧ）检测纯度和浓

度，并对其稀释至１５０ｎｇ／ｔｚＬ，于一２０℃保存备用。余下部分立

即保存于一８０℃超低温冰箱中。

１．２．３扩增ＳＴＡＴ６基因：以反转录所得的第一有义链

ｃＤＮＡ为模板，根据序列保守区利用Ｐｒｉｍｅｒ５．Ｏ（ＰＲＥＭＩＥＲＢｉｏｓｏｆｌ

Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ公司，ＵＳＡ）软件设计引物扩增ＳＴＡＴ６基因，内参基

因为ＧＡＰＤＨ，引物均由上海Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司合成。

１．２．４ＳＴＡＴ６基因与ｐＭＤ２０．Ｔ载体相连

①目的片段回收纯化：按凝胶回收试剂盒说明，进行操作。

②感受态细胞的制备：

受体菌的培养：从ＬＢ平板上挑取新鲜活化的Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５ｃｔ取单菌落，接种于３～５ｍＬＬＢ液体培养基中，３７℃下振荡培养

１２ｈ左右，直至对数生长后期。将此菌悬液以１：５０～１：１００的

比例接种于１００ｍＬＬＢ液体培养基中，３７屯振荡培养２～３ｈ，至

ＯＤ６００为０．５左右。

感受态细胞的制备（ＣａＣｌ：法）：将上述细胞培养液转入离心

管中，冰浴１０ｍｉｎ后，于４℃下３０００ｇ离心１０ｒａｉｎ；弃去上清液，

用预冷的ＣａＣｌ，溶液１０ｍＬ轻轻悬浮细胞，冰浴１５ｍｉｎ，然后于

４℃下３０００ｇ离心１０ｍｉｎ；弃去上清液，加入４ｍＬ预冷ＣａＣｌ２溶

液（１５％甘油，６０ｍｍｏｌ／ＬＣａＣｌ，），轻轻悬浮细胞，冰浴５ｍｉｎ后，

即制成感受态细胞悬液；无菌下将感受态细胞分装至１ｍＬ灭菌

ＥＰ管（每管１００ＩＬＬ），液氮速冻贮存于一８０℃可保存半年。

③质粒转化（热激法）：从一８０℃冰箱中取１００ｉｘＬ感受态

细胞悬液，冰上放置使其解冻，解冻后立即置于冰上；每管加入

连接产物或质粒ＤＮＡ溶液（含量不超过２５０ｎｇ，体积不超过１０

汕），轻轻混匀，冰上放置３０

ｍｉｎ；４２ｏＣ水浴或金属浴中热休克

９０ｓ，然后迅速置于冰上冷却５ｒａｉｎ；向每管中加人１ｍＬ无抗性的

ＬＢ液体培养基，混匀后３７℃振荡培养４５—６０ｒａｉｎ，使细菌恢复

至正常生长状态，表达质粒编码的抗生素抗性基因（Ａｍｐｒ）；将

上述菌液摇匀或全部离心富集后，无菌操作台中取１００ＩｘＬ涂布

于含Ａｍｐ的筛选平板上，吹干平板２０～３０ｒａｉｎ，并做好标记，待

菌液完全被培养基吸收后倒置于３７℃培养箱中，培养１６～２４

ｈ。

④将第①步的目的回收片段与ｐＭＤ２０．Ｔ载体相连：在微量

离心管中配制ｐＭＤＴＭ２０．ＴＶｅｃｔｏｒ１．０

ＩｘＬ、ＤＮＡ０．１

ｐｍｏｌ一

０．３

ｐｍｏｌ、ｄＨ２０ｕｐ１０５斗ＬＤＮＡ溶液，全量为５ＩｘＬ；加入５斗Ｌ（等

量）的ＳｏｌｕｔｉｏｎＩ（购自ＴａＫａＲａ公司）；１６ｏＣ反应３０ｍｉｎ［室温

（２５℃）也能正常进行连接反应，但连接效率稍微降低；５ｍｉｎ也

能正常进行连接反应，但连接效率稍微降低；长片段ＰＣＲ产物

（２ｋｂｐ以上）进行连接时，连接反应时间请延长至数小时］；全量

（１０ｐＬ）加入至１００斗Ｌ的ＪＭｌ０９感受态细胞中，冰中放置

３０ｒａｉｎ；４２ｏＣ加热４５ｓ后，再在冰中放置１ｍｉｎ；加入８９０¨Ｌ的ＬＢ

培养基，３７℃振荡培养６０ｍｉｎ；在含有Ａｍｐ的ＬＢ固体平板培养

基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落；挑选白色菌落，使

用菌落ＰＣＲ法等确认载体中插入片段的长度大小，移至锥形瓶

中３７ｏＣ２５０ｒ／ｒａｉｎ培养１２ｈ后进行下述操作。

１．２．５质粒小量提取：将３７℃培养１２—１６ｈ的平板取出，

于无菌操作台中挑取单个克隆放入１５ｍＬ氨苄青霉素抗性（１００

¨ｇ／ｍＬ）的ＬＢ培养基中，于３７ｃＣ２５０ｒ／ｍｉｎ摇菌过夜。对目的

片段经ＰＣＲ鉴定止确的菌液进行质粒提取，质粒提取按试剂盒

操作说明进行。

１．２．６质粒测序鉴定：对酶切鉴定正确的重组Ｔ载体进行

完全反应的测序鉴定，并与ＧｅｎＢａｎｋ公布的序列进行Ｂｌａｓｔ比对

（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＮＭ＿００１１７８０８１．１）。

１．２．７ＳＴＡＴ６过表达慢病毒表达载体ｐＬＶＴＨｍ．ＳＴＡＴ６一

ＯＲＦ构建与鉴定

①慢病毒表达载体ｐＬＶＴＨｍ线性化：ｐＬＶＴＨｍ载休采用内

切酶ＣｌａＩ和ＭｌｕＩ进行双酶切反应，获得粘性末端线性化目的

片段，酶切反应体系及条件同上。双酶切产物经ｌ％琼脂糖凝胶

电泳５ｈ（电压为６０Ｖ）、使用胶回收试剂盒回收线性化片段，产

物一２０℃保存备用，用于后续连接反应。

一７０—

万方数据