STAT6-ORF表达载体的构建与鉴定

中国生化药物杂志２０１４年第８期总第３４卷
论著基础研究
ＳＴＡＴ６－ＯＲＦ表达载体的构建与鉴定
刘锦宙１，杨燕２，谢而付３
（１．江西省宜春市人民医院消化内科，江西宜春３３６０００；２．江西省宜春职业技术学院，江西宜春３３６０００； ３．南京医科大学医学科学部，江苏南京２１００２９）
［摘要］
目的本文旨在构建ＳＴＡＴ６一ＯＲＦ表达载体，包装成慢病毒颗粒。方法
ｒａｔｓ
ｇａｓｔｒｉｃ ｔｉｓｓｕｅ
ｗａｓ
ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ＲＴ・ＰＣＲ。ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ
ｃｏｎｔｅｎｔ
ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ Ｗｅｓｔｅｍ ｂｌｏｔ，ｈｉｓｔａｍｉｎｅ ｃｏｎｔｒｏｌ
ｉｎ
ｇａｓｔｒｉｃ
ｆｏｒ
ｍｕｃｏｓａ
Ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ＥＬＩＳＡ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ａｆｔｅｒ ３ｈ ｏｆ
ｒａｔｓ ｗｅｒｅ
ｂｙ ｔｈｅ ｌａｔｅｒａｌ ｖｅｎｔｒｉｃｌｅ
ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｇａｓｔｒｉｃ ｊｕｉｃｅ
ｗｅｒｅ
ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｂｙ ｐｙｌｏｒｕｓ ｌｉｇａｔｉｏｎ，ａｆｔｅｒ ３ｈ ｔｈｅ
ｉｎ
ｅｘｅｃｕｔｅｄ
ｔｏ
ｍｅａｓｕｒｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｇａｓｔｒｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｐｅｐｓｉｎ，ａｎｄ Ｈ＋－Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ，ＨＤＣ）ｉｎ ｇａｓｔｒｉｃ ｍｕｃｏｓａ Ｗａｓ
ｒａｔ
ｇａｓｔｒｉｃ ｍｕｃｏｓａ ｉｎ ｈｉｇｈ ｄｏｓｅ ｇｒｏｕｐ，ｌｏｗ ｄｏｓｅ ｇｒｏｕｐ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ，
ｗｉｔｈ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ（Ｐ＜０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｅｕｌａｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ Ｎｅｓｆａｔｉｎ一１，ｃｏｕｌｄ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ｇａｓｔｒｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｐｅｐｓｉｎ， ａｎｄ ｉｔｓ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｍａｙ ｉｎｈｉｂｉｔ ｇａｓｔｒｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｂｙ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ
资助项目：国家自然科学基金｛８１１０１３２２） 作者简介：刘锦宙，男。本科，副主任医师。研究方向：消化内科．Ｅ—ｍａｉｌ：
ｑｃｈｌ８２１４６００６４＠１６３．ｔｏｍｏ
者分子交叉机制目前仍不清楚１８。…。推测可能与ＩＬ４．ＳＴＡＴ６信 号所介导功能的转变密切相关。１“。本研究选择能够高效率感 染目的细胞的慢病毒载体ｐＬＶＴＨｍ为骨架构建ＳＴＡＴ６．ＯＲＦ表 一∞一
ｒａｔ
ｇａｓｔｒｉｃ ｍｏｃｏｓａ
ｄｅｃｌｉｎｅｄ．ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ Ｗａｓ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ（Ｐ＜０．０５）．Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ，ａｆｔｅｒｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ｔｗｏ ｇｒｏｕｐｓ ｏｆ
ｒａｔｓ
ｇａｓｔｒｉｃ Ｈ＋一Ｋ＋ＡＴＰ ｅｎｚｙｍｅ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎＷａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｒｅｄｕｃｅｄ，ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ Ｗａｓ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ（Ｐ＜０．０１）．Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ ＨＤＣ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ
ｈ。
ＤＥＰＣ（依材料多少而稀释），６２℃２ ｍｉｎ，常温１２０００ ｇ离心
１
④将第①步的目的回收片段与ｐＭＤ２０．Ｔ载体相连：在微量
Ｖｅｃｔｏｒ １．０ ＩｘＬ、ＤＮＡ ０．１ ｐｍｏｌ一
ｍｉｎ，管内即为ＲＮＡ。取１ ＩｘＬ用分光光度计（７２２Ｓ型，ｅｐｐｅｎｄｏｆｆ
公司，ＡＧ）检测纯度和浓度，１¨Ｌ进行琼脂糖电泳（配制新鲜的 ｌ％琼脂糖凝胶，置换干净ＴＡＥ缓冲液进行电泳）检测其完整性， 余下部分立即保存于一８０℃超低温冰箱中，或立即用于反转录
０．３ ｐｍｏｌ、ｄＨ２０ ｕｐ
１０
５００
ＩＬＬ）异丙醇混匀，室温静置１０
ｇ离心１０
ｍｉｎ。
弃上清，５００
ＩｘＬ ７５％乙醇洗涤；４℃，１２０００
ｇ离心２ ｍｉｎ，重复１
次。空甩１次（常温１２０００ ｇ离心１ ｍｉｎ）。超净台内把柱子盖打
开吹ｌ～２ ｍｉｎ，将柱子放到新的１．５
ｍＬ
ＥＰ管。加入１０～４０斗Ｌ
Ｒ３９２．１２
［中图分类号】
［文献标识码】
Ａ
［文章编号】
１００５—１６７８（２０１４）０８—００６９—０４
Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｎｅｓｆａｔｉｎ－１
ｏｎ
ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｇａｓｔｒｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｐｅｐｓｉｎ ｉｎ
ｒａｔ ｇａｓｔｒｉｃ
ｍｕｃｏｓａ
ＬＩＵ Ｊｉｎ．ｚｈｏｕｌ，ＹＡＮＧ Ｙａｎ２，ＸＩＥ Ｅｒ．ｆｕ３ （１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆＩｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｙｉｅｈｕｎ Ｐｅｏｐｌｅ’Ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｊｉａｎｇｘｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｙｉｃｈｕｎ，３３６０００，Ｃｈｉｎａ；２．Ｙｉｃｈｕｎ Ｖｏｃａｔｉｏｎａｌ
ｏｆ ｋｅｙ ｅｎｚｙｍｅｓ．ｉｎ ｈｉｓｔａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
ｎｅｒｖｏｕｓ
ｓｙｓｔｅｍ，Ｈ＋－Ｋ＋ＡＴＰ ｅｎｚｙｍｅ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｐａｔｈｗａｙ．
ａｃｉｄ；ｐｅｐｓｉｎ
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ｌａｔｅｒａｌ
ｖｅｎｔｒｉｃｌｅ
ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ；ｒａｔ；ｇａｓｔｒｉｃ
反应。
５斗Ｌ
ＤＮＡ溶液，全量为５ ＩｘＬ；加入５斗Ｌ（等
量）的Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｉ（购自ＴａＫａＲａ公司）；１６ ｏＣ反应３０ ｍｉｎ［室温 （２５℃）也能正常进行连接反应，但连接效率稍微降低；５ ｍｉｎ也 能正常进行连接反应，但连接效率稍微降低；长片段ＰＣＲ产物
１．２实验方法
比例接种于１００
ＬＢ液体培养基中，３７屯振荡培养２～３ ｈ，至
ＯＤ６００为０．５左右。 感受态细胞的制备（ＣａＣｌ：法）：将上述细胞培养液转入离心 管中，冰浴１０ ｍｉｎ后，于４℃下３０００ ｇ离心１０ ｒａｉｎ；弃去上清液， 用预冷的ＣａＣｌ，溶液１０ ｍＬ轻轻悬浮细胞，冰浴１５ ｍｉｎ，然后于
ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（Ｐ＜０．叭）．Ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ｐｅｐｓｉｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｔｗｏ ｇｒｏｕｐｓ Ｗａｓ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ（Ｐ＜０．０５）．Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｉｎ
ｃａｔｈｅｔｅｒ ｗｅｒｅ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ，ｈｉｇｈ ｄｏｓｅ ｇｒｏｕｐ，ｌｏｗ ｄｏｓｅ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｃｏｎｔｒａｌ ｇｒｏｕｐ，ｅａｃｈ
ｗａｔｅｒ
Ｗａｓ ｉｎｊｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｎｅｓｆａｔｉｎ一１ ０．０５ ｇ，０．５ ｇ ａｎｄ ５肛Ｌ ｅｑｕａｌ ｖｏｌｕｍｅ ｓｔｅｒｉｌｅ
应用嵌套ＰＣＲ法从生长状态良好的２９３Ｆｒ细
胞的ｃＤＮＡ中扩增ＳＴＡＴ６的完整读码框片段（２５４４ ｂｐ），根据需要在引物的５’端分别引入Ｃｌａ Ｉ和Ｍｌｕ Ｉ酶切位点，将ＰＣＲ产物克隆 到ｐＭＤ２０Ｔ载体上，得到ｐＭＤ２０Ｔ—ＳＴＡＴ６－ＯＲＦ克隆；测序验证后，用Ｃｌａ Ｉ和Ｍｈ Ｉ双酶切ｐＭＤ２０Ｔ．ＳＴＡＴ６克隆，回收酶切产物得到的 ＳＴＡＴ６一ＯＲＦ片段，通过Ｔ４ ＤＮＡ连接酶连接到ｐＬＶＴＨｍ表达载体上，经双酶切和测序验证正确，获得ｐＬＶＴＨｍ．ＳＴＡＴ６．ＯＲＦ表达载体。 结果构建带有增强绿色荧光蛋白ＥＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）标记的ＳＴＡＴ６．ＯＲＦ表达载体，包装成慢病毒颗粒，结果 表明成功构建及包装带ＳＴＡＴ６－ＯＲＦ目的片段的慢病毒表达载体。结论ｐＬＶＴＨｍ—ＳＴＡＴ６过表达载体构建成功，可以进行慢病毒包 装与鉴定。 ［关键词］ ＳＴＡＴ６－ＯＲＦ；慢病毒颗粒；增强绿色荧光蛋白
１．２．１人胚肾ＨＥＫ２９３ＦＦ细胞株的总ＲＮＡ提取与纯化： ＴＲＩｚｏｌ法提取ＲＮＡ，异丙醇纯化ＲＮＡ，按下列步骤操作： 细胞按１×１０６爪／ｍＬ密度接种于６孑Ｌ板培养，经处理后弃 去上清，每孔加入１
ｍＬ
ＴＲＩｚｏｌ（ＴＡＫＡＲＡ公司产品），静置５
ｍｉｎ
充分裂解（ＴＲＩｚｏｌ变粘稠）后吸到１．５ｍＬ ＥＰ管中，或液氮速冻后 一８０℃保存备用。加２００ ＩＬＬ氯仿剧烈振荡，室温静置５
万方数据
论著基础研究
中国生化药物杂志２０１４年第８期总第３４卷
达载体。 １材料与方法
取单菌落，接种于３～５
１２
ｍＬ
ＬＢ液体培养基中，３７℃下振荡培养
ｈ左右，直至对数生长后期。将此菌悬液以１：５０～１：１００的
ｍＬ
１．１实验材料 １．１．１细胞株、菌株和质粒：人胚肾ＨＥＫ２９３ＦＴ细胞株，大 肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＩ－ｌＳｏｔ均由南方医科大学基因工 程研究所保存，ｐＬＶＴＨｍ能表达ＥＧＦＰ，载体ｐＭＤＴＭ２０－Ｔ ｖｅｃｔｏｒ为日本 ＴａＫａＲａ公司产品。
在免疫细胞中，ＳＴＡＴ６在ＩＬ４或ＩＬ－１３的刺激下，通过ＪＡＫ 激酶ｊａｎｕｓ ｋｉｎａｓｅ，ＪＡＫ）的作用，胞质中非磷酸化（失活状态）的 ＳＴＡＴ６蛋白被磷酸化（激活）后形成二聚体，进入细胞核内，识别
核内特异的ＤＮＡ结合元件并与之结合，启动下游特定基因的表 达，产生相应的生物学效应，如ＩｇＥ的产生，Ｔｈ２细胞的分化及淋 巴细胞的发育等¨“。但越来越多的研究表明，该信号与癌症的 发生发展也密切相关∞。－。长期慢性的炎症可以诱发癌症，但２
ｒａｔ
Ｔｏ
ｏｂｓｅｒｖｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｎｅｓｆａｆｉｎ一１
ｒａｔｓ
ｏｎ
ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ｇａｓｔｒｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｐｅｐｓｉｎ ｉｎ
ｒａｔｓ
ｇａｓｔｒｉｃ ｍｕｃｏｓａ，ａｎｄ ｅｘｐｌｏｒｅ ｉｔｓ ｐｏｓｓｉｂｌｅ
ｍａｌｅ ＳＤ
ａｆｔｅｒ ｉｎｔｒａｅｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ
４ ｍｉｎ，
汕），轻轻混匀，冰上放置３０
９０
ｍｉｎ；４２
ｏＣ水浴或金属浴中热休克
ｓ，然后迅速置于冰上冷却５ｒａｉｎ；向每管中加人１ ｍＬ无抗性的
ｏＣ，１２０００
ｇ离心１５ ｍｉｎ。将上清移到新ＥＰ管，加等体积（约
ｒａｉｎ，４℃，１２０００
ＬＢ液体培养基，混匀后３７℃振荡培养４５—６０ ｒａｉｎ，使细菌恢复 至正常生长状态，表达质粒编码的抗生素抗性基因（Ａｍｐｒ）；将 上述菌液摇匀或全部离心富集后，无菌操作台中取１００ ＩｘＬ涂布 于含Ａｍｐ的筛选平板上，吹干平板２０～３０ ｒａｉｎ，并做好标记，待 菌液完全被培养基吸收后倒置于３７℃培养箱中，培养１６～２４ 离心管中配制ｐＭＤＴＭ２０．Ｔ
４℃下３０００ ｇ离心１０ ｍｉｎ；弃去上清液，加入４ ｍＬ预冷ＣａＣｌ２溶
液（１５％甘油，６０ｍｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ，），轻轻悬浮细胞，冰浴５ ｍｉｎ后， 即制成感受态细胞悬液；无菌下将感受态细胞分装至１ ｍＬ灭菌 ＥＰ管（每管１００ ＩＬＬ），液氮速冻贮存于一８０℃可保存半年。 ③质粒转化（热激法）：从一８０℃冰箱中取１００ ｉｘＬ感受态 细胞悬液，冰上放置使其解冻，解冻后立即置于冰上；每管加入 连接产物或质粒ＤＮＡ溶液（含量不超过２５０ ｎｇ，体积不超过１０
Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｙｉｃｈｕｎ，３３６０００，Ｃｈｉｎａ；３．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ，２１００２９，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ
ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８
ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ
ｗｉｔｈ Ｎｅｓｆａｔｉｎ－１
ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ，ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ
ｗａｓ
ａ
ｇｒｏｕｐ ｗｉｔｈ ｅｑｕａｌ ｖｏｌｕｍｅ ｏｆ ｓｔｅｒｉｌｅ
ｗａｔｅｒ
ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ，ｔｈｅ
ｇａｓｔｒｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｐｅｐｓｉｎ
ｗａｓ
ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｒｅｄｕｃｅｄ，ｔｈｅｒｅ