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山西大同大学
生命科学学院教案
课程名称：生物分离工程实验
教材名称：生物分离工程实验
授课对象：11级生工1班
授课学期：2013-2014第二学期
讲课学时：32
授课教师：张睿、张弘弛
技术职务：讲师
工作单位：生科院生工系
编写时间：2014年4月
审阅意见：
温度t = ℃
编号
H2O
加量/g
(NH4)2SO4
溶液加量纯(NH
4
)2SO4
累计量/g
溶液累
计总量/g
PEG400
质量分
数/%
(NH4)2SO4
质量分数/% /ml/g
1 0.5
2 0.3
3 0.3
4 0.3
5 0.5
6 0.5
7 0.5
注：如果实验室的电子台秤（精确至0.01g)能做到每组一台，也可采用在电子台秤上称取质量的方式来加(NH4)2SO4溶液，这样就不需要通过密度转换，更直观。
五、思考题
（一）预习
1.简述两水相萃取中成相的原因。
2.说明实验数据的每步计算方法。
（二）实验结果和讨论
1.将实验结果列入表格，并作出相图。
2.实验操作中应注意哪些问题？分析试验误差。
反胶束萃取法概念概述反胶束萃取法（反胶束提取法）是一种用于分离和富集生物、环境和食品样品中目标分析物的有效技术。
它通过利用表面活性剂的特性，将目标分子从样品中转移至胶束或微胶团的内部，并进一步通过离心、超滤等操作将其分离出来。
该方法具有操作简单、实验周期短、富集效果好等优点，逐渐成为分析化学领域的热门研究方向。
胶束和反胶束的概念1.胶束概念–胶束是由表面活性剂分子在溶液中自组装形成的一种聚集态结构。
–胶束由亲水头基和亲油尾基组成，使得它具有亲水性和亲油性。
–胶束中心是一个亲水性的内核，周围有一层亲油性的尾基包围。
–胶束的形成可以使表面活性剂的溶解度显著增加，有利于提高化学反应速率、增强分析灵敏度等。
2.反胶束概念–反胶束是胶束的一种反向结构，内部是亲油性的，外部是亲水性的。
–反胶束是由两种或两种以上表面活性剂形成的一种聚集态结构。
–反胶束的形成靠表面活性剂的水化亲和力和亲疏水基团之间的相互作用。
–反胶束具有高分子微团的结构特点，可在水中稳定存在，并可用于富集目标分析物。
反胶束萃取法的原理反胶束萃取法利用反胶束的特性，使目标分析物从样品中转移到反胶束的内部。
下面介绍其原理：1.目标分析物结合反胶束–反胶束内部存在亲疏水相分离的结构，亲水头基朝向内部，亲油尾基朝向外部。
–样品中的目标分析物可通过疏水作用与反胶束的亲油尾基结合。
–目标分析物与反胶束结合的过程可以通过搅拌、超声处理等方法促进。
2.反胶束富集目标分析物–目标分析物结合在反胶束内部后，可以通过调节溶液pH、离心、超滤等方法，将反胶束与样品分离。
–目标分析物在反胶束中富集，使得其浓度得到显著提高，有利于进一步分析和检测。
反胶束萃取法的应用反胶束萃取法在环境、食品和生物样品的分析中得到了广泛应用。
以下是几个常见的应用领域：1.环境分析–反胶束萃取法可以用于环境中有机污染物的富集和分析。
–通过调节反胶束内部的条件，如添加盐类、有机溶剂等，能够提高萃取效果。
复合反胶束后萃花生蛋白提取条件优化郭珍;陈复生;李润洁【摘要】花生是世界上非常重要以及研究最为广泛的一种油料作物,同时又富含24％～ 36％的蛋白质.研究AOT-SDS/异辛烷-正辛醇复合反胶束技术萃取花生蛋白,考察了pH、KCl浓度、温度以及时间对花生蛋白后萃率的影响,采用四因素二次通用旋转组合设计试验,并对试验结果进行方差分析,回归分析建立回归方程,采用频率分析法获得了花生蛋白后萃的最佳工艺条件:pH 7.5、时间30 min、KCl浓度1.1 mol/L、温度35℃,在此条件下得到的后萃率为79.03％.【期刊名称】《中国粮油学报》【年(卷),期】2014(029)004【总页数】5页(P82-85,92)【关键词】花生蛋白;二次通用旋转组合;复合反胶束;优化【作者】郭珍;陈复生;李润洁【作者单位】河南工业大学,郑州450001;河南工业大学,郑州450001;河南工业大学,郑州450001【正文语种】中文【中图分类】TS201.2花生是我国主要的油料资源，同时富含24%～36%的蛋白质。
花生蛋白含有多种必需氨基酸，不含胆固醇［1］。
与大豆蛋白相比，抗营养因子较少，可消化性强。
目前我国利用花生制油过程造成了花生蛋白的损失与变性，因此，探寻一种新型制备花生蛋白技术有着重要的意义。
反胶束萃取技术是一种新型的可用于提取具有生物活性物质的技术［2］。
已有研究显示，反胶束萃取技术可以实现大豆中蛋白质和油脂同时分离，并减少蛋白质的变性，且大多数采用的都是AOT单一反胶束体系，而研究发现，把不同类型表面活性剂混合起来制备可以形成具有良好性质的混合反胶束体系，增加增溶水量［3－4］，因此本试验将阴离子表面活性剂AOT与SDS混合配制复合反胶束进行研究。
本试验采用AOT－SDS/异辛烷－正辛醇复合反胶束对花生蛋白进行提取，考察pH、时间、KCl、温度对后萃率的影响，采用二次通用旋转组合设计，以后萃率为指标获取较佳工艺条件，为反胶束在花生蛋白提取过程中的应用获得数据指导。
生化分离工程知识点归纳第一章绪论1、生物物质分离工程：在工业规模上，通过适当的分离纯化技术与装备并消耗一定的能量和分离介质来实现生物物质（产品）制备的过程，是生物产业的一个重要组成部分。
2、生物工程下游加工过程的特点：（1）成分复杂：固体成分、液体成分（2）悬液中的目标产物浓度低（3）稳定性差：化学（温度和pH值）或微生物引起的降解（4）生物产品质量要求高：纯度、卫生、生物活性3、下游加工过程的一般流程（4个阶段）：发酵液的预处理与固液分离、初步纯化（提取）、高度纯化（精制）、成品加工。
4、某一具体产品的分离提取工艺设计中应考虑的问题：①产物本身的性质；②是胞内产物还是胞外产物；③原料中产物和主要杂质浓度；④产物和主要杂质的理化特性及差异；⑤产品用途和质量标准；⑥产品的市场价格；⑦不同分离方法的技术经济比较及废液的处理方法等。
第二章发酵液的预处理与过滤1、发酵液的预处理发酵液的预处理的方法：（1）加热：最简单、最经济的预处理方法是加热，降低料液黏度，也可以对其进行灭菌。
但加热变性的方法只适合于对热稳定性的产物。
（2）调节料液的pH值：促进全细胞聚集。
（3）凝聚和絮凝：凝聚是指通过加入简单电解质降低了胶体粒子间的排斥电位，从而使得范德华引力起主导作用，聚合成较大的胶粒，粒子的密度越大，越易分离。
常用凝聚剂多为阳离子型如明矾、三氯化铁。
絮凝是指预处理时加入絮凝剂（通常指天然或合成的生物大分子聚电解质）既能降低排斥电位，又吸附了周围的微粒，形成桥架作用，促使胶粒形成粗大，密度低的絮凝团。
这些絮凝团很容易被过滤得到。
主要絮凝剂：聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、多聚胺衍生物。
（4）使用惰性助滤剂：硅藻土、珍珠岩。
2、真空过滤器的优点：连续自动操作,节省人力，生产能力大。
真空过滤器的缺点：附属设备多，投资费用高，推动力小适用于量大易过滤的料液。
3、压滤器的优点：过滤推动力大，过滤面积大。
压滤器的：缺点：板框压滤机劳动强度大，投资、维护费用高。
《生化分离工程》思考题及习题第一章绪论1、何为生化分离工程bioseparation engineering/下游加工过程, biotechnology？其主要研究那些内容？2、生化分离技术依据的分离原理有哪些？3、生化分离工程有那些特点？其包括那几种主要分离方法？4、何为传质分离过程？5、简述生化分离工程的发展趋势。
6、亲和技术目前已衍生出那些子代分离技术？7、生化反应与生化分离耦合技术有那些特点？8、为何在生物技术领域中往往出现“丰产不丰收”的现象？9、生物产品与普通化工产品分离过程有何不同？10、设计生物产品的分离工艺应考虑哪些因素？11、初步纯化与高度纯化分离效果有何不同？12、如何除去蛋白质溶液中的热原质？13、生物分离为何主张采用集成化技术？14、若每一步纯化产物得率为90%，共6步纯化得到符合要求产品，其总收率是多少？第二章预处理与固-液分离法1、发酵液预处理的目的是什么？主要有那几种方法？2、何谓絮凝？何谓凝聚？各自作用机理是什么？3、絮凝剂可分为那三种？有那些因素影响絮凝过程？4、在生化工业中常用的过滤方式那两种？各自有何特点？5、离心分离分那两大类？各自有何特点及用途？常用离心法有那几种？6、何谓密度梯度离心？其工作原理是什么？7、如何使用助滤剂?8、错流微滤与传统过滤相比有何优点？第三章细胞破碎法1、细菌细胞壁与真菌（酵母）细胞壁在组成上有何区别？2、细胞破碎主要有那几种方法？3、机械法细胞破碎方法非机械破碎方法相比有何特点？4、何谓脂溶破碎法？其原理是什么？包括那几种？5、酶法细胞破碎常用那几种酶类？6、包涵体是如何产生的?如何使重组蛋白复性?7、如何测定细胞破碎程度？第四章沉淀法1.理解概念：盐溶，盐析2.常用的沉淀法有哪几种？3.生产中常用的盐析剂有哪些？其选择依据是什么？4.何谓分步盐析沉淀？5.有机沉淀法与盐析沉淀法相比有何优缺点？第五章溶剂萃取法1、何谓溶剂萃取？其分配定律的适用条件是什么？2、在溶剂萃取过程中pH值是如何影响弱电解质的提取？3、何谓乳化液？乳化液稳定的条件是什么？常用去乳化方法有那些？4、在发酵工业中，去乳化有何实际意义？5、理解概念：HLB，分配系数，分离因子，介电常数，带溶剂6、生物物质的萃取与传统的萃取相比有哪些不同点？7、pH 对弱电解质的萃取效率有何影响？8、发酵液乳化现象是如何产生的？对分离纯化产生何影响? 如何有效消除乳化现象？9、什么叫超临界流体？10、为何在临界区附近，稍微改变流体的压力和温度，都会引起流体密度的大副变化？11、要提高超临界流体萃取的效率，可以考虑哪些方面？12、名词解释：胶束/反胶束13、影响反胶束萃取蛋白质的因素有哪些？第六章双水相萃取1、何谓双水相萃取？2、双水相体系可分为那几类？目前常用的体系有那两种？3、为什么说双水相萃取适用于生物活性大分子物质分离？4、影响双水相萃取的因素有那些？当电解质存在，PH是如何影响双水相萃取的？5、用双水相萃取细胞破碎（匀浆）液时，一般是把目标产物分布在上相，而细胞碎片、杂蛋白等杂质分布在下相，为什么？6、何谓双水相亲和萃取？第七章膜分离法1、何谓膜分离？主要有那几种膜分离方法？2、膜在结构上可分为那几种？膜材料主要用什么？3、膜组件在形式上有那几种？各自有何优缺点？4、为何说非对称性膜的发明为膜分离走向工业化奠定了基础？5、简述微滤、超滤膜、反渗透膜在膜材料、结构、性能及其应用等方面的异同点6、膜分离的表征参数有那些？何谓膜截留分子量？7、何谓浓差极化现象？它是如何影响膜分离的？减少浓差极化现象的措施？8、膜的清洗及保存方法有那几种？9、膜分离设备按膜组件形式可分为几种？相比较的优缺点？10、反渗透与超滤在分离机理上有何区别？11、超滤、反渗透膜分离主要有那些方面应用？12、比较膜分离技术与亲和层析技术的特点13、亲和剂由哪几部分组成？14、简述亲和膜分离的过程？15、液膜由哪几部分组成？各自的功能是什么？17、影响液膜稳定性的因素有哪些？第八章吸附法1、吸附作用机理是什么？2、吸附法有几种？各自有何特点？3、大孔网状聚合物吸附与活性炭吸附剂相比有何优缺点？4、影响吸附过程的因素有那些？5、何谓穿透曲线？6、膨胀床吸附的特点是什么？第九章离子交换法1、何谓离子交换法?一般可分为那几种?2、离子交换树脂的结构、组成？按活性基团不同可分为那几大类？3、离子交换树脂的命名法则是什么？4、离子交换树脂有那些理化性能指标？5、何谓真密度、湿真密度？6、大孔径离子交换树脂有那些特点？7、pH值是如何影响离子交换分离的？8、普通型离子交换树脂为何不能用来分离提取蛋白质分子？9、各类离子交换树脂的洗涤、再生条件是什么？10、软水、去离子水的制备工艺路线？11、对生物大分子物质，离子交换剂是如何选择的？12、理解概念：交换容量，工作交换容量，膨胀度，湿真密度，交联度13、为何阴树脂交换容量用动态法测定而阳树脂用静态法测定？第十章色层分离1、何谓色层分离法？可分为那几大类？2、何谓保留值、分配容量K、分离度？3、色层图中分离度有那几种表示方法？4、层析剂有那几种？各自有何特点？5、何谓亲和色层分离法？亲和力的本质是什么？亲和色层中常用的亲和关系有那几种？6、何谓疏水作用层析？其最大的特点是什么？7、柱层析法与固定床吸附法有何异同点？8、苯硼酸亲和介质用于分离哪些目标物？原理是什么?9、凝胶层析分离机理是什么?10、亲和层析的机理是什么？11、配基偶联后残留电荷对分离有何影响？如何消除？12、小分子配基为何需插入手臂？13、何谓色层分离法？可分为那几大类？14、简述柱层析系统的工艺流程。
实验六用反胶束萃取技术提取胰蛋白酶Ⅰ反胶束萃取法提取胰蛋白酶一、实验目的和要求1、加深对反胶束萃取基本原理的理解。
2、了解反胶束萃取的工艺过程及影响因素。
3、了解胰蛋白酶酶话的测定方法和原理。
4、研究pH对萃取率和反胶束率的影响规律，求出适宜的萃取pH值。
二、实验原理反胶束萃取技术是近年来发展的具有开发前景的新型分离技术。
他是由表面活性剂分散在有机溶剂（连续相）中，自发形成纳米级的聚集体，称反胶束（或称反胶团）。
在反胶束溶液中，组成反胶束的表面活性剂定向排列，其非极性尾向外伸入非极性有机溶剂的有机主体中，而极性头向内排列，形成一个极性核，核内充满水溶液，具有溶解蛋白质之类大分子物质的能力。
当含有反胶束的有机溶剂与蛋白质水溶液接触时，蛋白质在静电引力、疏水作用或亲和力等推动作用力下溶入极性核，从而被萃取，然后再控制适当的条件使蛋白质从负载有机相中重新反萃取到水相，达到纯化的目的。
影响反胶束萃取的因素很多，主要有水相溶液的pH、离子强度、表面活性剂和有机溶剂的种类、浓度和温度等。
胰蛋白酶（trypsin）广泛存在于动物的胰中，是由胰腺腺泡细胞合成的肽链内切酶，分Ⅰ型和Ⅱ型两种，其相应前体分别胰蛋白酶原Ⅰ（CTN）和胰蛋白酶原Ⅱ（ATN）。
正常胰液中胰蛋白酶原占总蛋白质含量的19%，CTN 是AT N 的2倍.胰蛋白酶为白色或类白色结晶性粉末，等电点pI = 10.8。
胰蛋白酶是生物化学尤其是蛋白质组学研究的重要试剂。
它具有分解肽链的作用，能消化溶解变性蛋白质，对未变性的蛋白质无作用，因此能使浓痰液、血凝块等消化变稀，易于引流排除，加速创面净化，促进肉芽组织新生，而不损伤正常组织或损伤极微（因血清内有胰蛋白酶抑制物）。
可帮助创伤或手术后伤口愈合，治疗烧伤，具有多种药用价值。
此外，还有抗炎作用。
临床上可用于脓胸、血胸、外科炎症、溃疡、瘘管等所产生的局部水肿、血肿、脓肿等。
喷雾吸入，用于治疗呼吸道疾病。
胰蛋白酶存放于密闭，阴凉处保存。
反胶团萃取分离纯化色氨酸的研究摘要：色氨酸是人体内的必需氨基酸之一。
针对色氨酸的分离纯化，提出一种基于反胶团法的分离纯化方法。
结果表明，采用AOT/异辛烷反胶团体系，在AOT 浓度60mmol/L；；萃取pH为2.0；离子强度为0.1mol/L；反萃取PH为10；离子强度为1mol/L的条件下，经过一次萃取，回收率可以达到70%左右。
关键词：色氨酸反胶团 AOT 萃取0 引言色氨酸是人体内的必需氨基酸之一。
色氨酸对人和动物的生长发育、新陈代谢起重要的作用，对预防糙皮病、抑郁症，改善睡眠和增强自信心有着很重要的作用，广泛应用于医药、食品和饲料行业。
反胶团是针对于生物活性的氨基酸或蛋白质提出的一种液液萃取体系。
同传统氨基酸分离纯化手段相比，它具有分离步骤少、易于放大、高选择性、低成本的特点。
从20世纪70年代末反胶团概念的提出到现在，它一直是生化工程研究领域的热点。
在研究利用反胶团从实际复杂体系(如发酵液中)分离纯化目标蛋白时，如果直接从复杂体系入手，盲目性很强，很难对萃取过程或出现的问题进行准确的分析和判断。
而从模拟体系入手，在研究清楚萃取过程的主要规律后，再进行复杂体系的研究，是一种事半功倍的研究思路。
作者通过正交实验分析方法，研究了反胶团体系中AOT浓度、萃取PH、萃取离子强度、反萃PH和反萃离子强度五个因素对色氨酸萃取的影响，从而推断出最优方案。
1 材料与方法1.1 实验材料 AOT(丁二酸-2-乙基己基磺酸钠)购自嘉善巨枫化工厂，异辛烷购自天津市福晨化学试剂厂，其他试剂购自上海苏懿化学试剂有限公司，均为分析纯。
水溶液均用去离子水配制，实验在室温下进行。
1.2 萃取与反萃实验将适量的AOT加入到异辛烷溶液中摇匀，使其均匀分布于有机相，得到澄清透明稳定的反胶团系统。
准确量取1mL色氨酸储备液于不同缓冲液中，稀释，由不同浓度的离子构成酸缓冲液，PH<PI，构成初始水相。
将反胶团相和萃取水相置于100mL三角烧瓶中，在振荡器上剧烈摇晃15min后，倾入离心管，进行离心（3500r/min，5min），用滴管小心地将两相分开，取上层有机相待用。
反胶束萃取-概述说明以及解释1.引言1.1 概述反胶束萃取作为一种新型的分离技术，近年来得到了广泛的关注和应用。
在传统胶束萃取的基础上，反胶束萃取通过添加适宜的表面活性剂和溶剂体系，形成反嵌段结构，使其具有与胶束相反的微观结构和分散状态。
这种微观结构的反转使得反胶束能够更加有效地分离和富集目标物质。
相比传统胶束萃取，反胶束萃取具有许多独特的优点。
首先，反胶束体系具有更大的界面活性剂浓度范围，可适应更广泛的实际应用环境。
其次，反胶束的结构稳定性更高，能够在更高的温度和pH值下保持稳定，具有更好的耐性和抗干扰能力。
此外，反胶束还能够提高分离和富集过程的选择性和灵敏度，提高分析的准确性和可靠性。
反胶束萃取在许多领域中得到了广泛的应用。
在环境分析领域，反胶束萃取可用于水样、土壤和大气中有机污染物的富集和分离。
在食品安全检测中，反胶束萃取可以用于提取食品中的农药残留物和有害物质，以保障消费者的健康。
此外，反胶束萃取还可以用于生物药物的纯化和分离，提高药物的纯度和药效。
尽管反胶束萃取在许多应用领域取得了令人瞩目的成果，但也存在一些问题和挑战需要解决。
例如，反胶束系统的设计和优化仍然是一个挑战，需要考虑多种因素的影响。
此外，反胶束的工艺条件和操作参数也需要进一步研究和改进。
综上所述，反胶束萃取作为一种新型的分离技术，在应用领域具有广阔的发展前景。
通过不断深入研究和改进，相信反胶束萃取将为科学研究和应用实践提供更多的可能性，为解决实际问题提供更好的解决方案。
1.2 文章结构文章结构部分的内容应该包括对整篇文章的大致结构进行介绍和概述。
可以参考以下内容进行编写：在本文中，我们将对反胶束萃取进行全面的介绍和分析。
首先，我们将在引言部分概述反胶束萃取的基本原理和应用领域。
随后，正文部分将详细阐述反胶束萃取的原理和其在不同领域中的应用案例。
最后，在结论部分，我们将总结反胶束萃取的优势，并对其未来的发展前景进行展望。
通过这样的文章结构，读者可以清楚地了解到本文的整体框架和内容安排。
不同反胶束体系后萃取花生蛋白质的比较高艳秀;陈复生;郭珍;杨颖莹;李润洁【摘要】对AOT[二-(2-乙基己基)琥珀酸酯磺酸钠]/异辛烷,SDS(十二烷基硫酸钠)/异辛烷-正辛醇,DTAC(十二烷基三甲基氯化铵)/正庚烷-正己醇3种反胶束体系萃取花生蛋白质的后萃工艺进行研究.主要研究了缓冲溶液pH值、萃取时间、萃取温度、超声功率、KCl浓度对花生蛋白后萃率的影响,分别得到了3种反胶束体系萃取花生蛋白质的最佳后萃工艺条件,并做验证试验.在最优工艺条件下制备不同的花生蛋白样品.通过色差分析,从宏观上比较不同反胶束体系制备的花生蛋白产品色泽的差异,进一步对比不同反胶束体系制备的花生蛋白的扫描电镜(SEM)照片,分析其微观结构的差别,试验结果表明最适合萃取花生蛋白的反胶束体系是AOT反胶束体系,且该体系萃取花生蛋白的后萃率为83.17％,较另外2种体系的后萃率都高.%Peanut protein was extracted using AOT[sodium bis-(2-ethylhexyl) sulfosuccinate] / isooctane,SDS (sodium dodecyl sulfonate) / isooctane-heptylane capryl alcohol,DTAC (heptanes-hexanol reverse micelle systems,and the backward extraction was studied.The effects ofpH,extraction time,and temperature,ultrasonic power,KCl concentration on the backward extraction rates were investigated.And the optimum conditions of the three reverse micelle systems in the backward extraction were obtained and verification test were designed to verify the results.On the optimum conditions,various peanut protein samples were prepared.Through the color difference analysis,we compared the color difference of respective peanut protein products onmacroscopic.Furthermore,comparing scanning electron microscopy (SEM)pictures of three kinds of peanut proteins extracted from the respective reverse micelle systems,we analyzed the differences of microstructure.The results of the test showed that the most suitable reverse micelle system for the extraction of peanut protein was AOT reverse micelle system; the backward extraction efficiency of this system was 83.17％,which was also higher than the other two reverse micelle systems.【期刊名称】《中国粮油学报》【年(卷),期】2013(028)008【总页数】7页(P12-18)【关键词】花生蛋白;反胶束;色差分析;扫描电镜【作者】高艳秀;陈复生;郭珍;杨颖莹;李润洁【作者单位】河南工业大学粮油食品学院,郑州450001;河南工业大学粮油食品学院,郑州450001;河南工业大学粮油食品学院,郑州450001;河南工业大学粮油食品学院,郑州450001;河南工业大学粮油食品学院,郑州450001【正文语种】中文【中图分类】TQ936.2花生是世界上主要的优质食用植物油料品种之一，花生籽仁的主要成分是蛋白质、脂肪和碳水化合物，其含量分别为24%～36%、50%左右和10%～23%[1]。
