基因工程第三章2：操作技术

Chapter three
3、巢氏PCR（Nested PCR） 、巢氏 （ ）
巢氏PCR需要两到三对引物，一般采用第一套引物扩增 需要两到三对引物， 巢氏 需要两到三对引物 15-30个循环，再用扩增 个循环， 个循环 再用扩增DNA片段内设定的第二套引物扩 片段内设定的第二套引物扩 个循环， 增15-30个循环，这样可使待扩增序列得到高效扩增，而 个循环 这样可使待扩增序列得到高效扩增， 次级序列却很少扩增。套式引物PCR减少了引物非特异性 次级序列却很少扩增。套式引物 减少了引物非特异性 退火，从而增加了特异性扩增，提高了扩增效率。 退火，从而增加了特异性扩增，提高了扩增效率。 若将巢氏PCR的内外引物稍加改变，延长外引物长度 的内外引物稍加改变， 若将巢氏 的内外引物稍加改变 ），同时缩短内引物长度 ），使外 （25-30bp），同时缩短内引物长度（15-17bp），使外 ），同时缩短内引物长度（ ）， 引物先在高退火温度下复性，做双温扩增， 引物先在高退火温度下复性，做双温扩增，使内引物在外 引物扩增的基础上，在低退火温度复性，直到扩增完成， 引物扩增的基础上，在低退火温度复性，直到扩增完成， 这样就可以使两套引物一次同时加入。 这样就可以使两套引物一次同时加入。
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Touch-down PCR的应用范围 的应用范围
low copy of targeted DNA; high degree degeneracy (or less specific) of the set of primers; RT-PCR using oligo-dT.
高温造成化学修饰基团的脱落， 高温造成化学修饰基团的脱落，然后才有聚 合的活性. 合的活性
Chapter tห้องสมุดไป่ตู้ree
2、Touch-down PCR 、
Touch-down PCR又称降落 又称降落PCR。即选定一个温度范 又称降落 。 每降1-2 ℃进行 个循环，然后 进行1-2个循环 个循环， 围，如65—50 ℃ ，每降 度下进行15个循环 在50度下进行 个循环。 度下进行 个循环。 Touch-down的原理：随着退火温度的降低，特异 的原理：随着退火温度的降低， 的原理 性逐步降低， 性逐步降低，但特异性条带在温度较高时已经扩增出 来，其浓度远远超过非特异性条带，随着退火温度的 其浓度远远超过非特异性条带， 降低，特异性条带优先被扩增。 降低，特异性条带优先被扩增。 选择初始复性温度的原则：起始复性温度应该比引 选择初始复性温度的原则： 物的Tm值高出 值高出5-10度，然后每个循环递减 度 物的 值高出 度 然后每个循环递减1-2度
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多重PCR（multiplex polymerase chain （ 多重 reaction， MPCR）也称为复合 ， ）也称为复合PCR，是在常规 ， PCR的基础之上进行改进从而发展起来的一种新 的基础之上进行改进从而发展起来的一种新 型的PCR扩增技术，多重 扩增技术， 型的 扩增技术 多重PCR技术的基本原理与 技术的基本原理与 常规的PCR技术相同。 技术相同。 常规的 技术相同 多重PCR技术主要有两种形式：一、将多条引物 技术主要有两种形式： 多重 技术主要有两种形式 和多个模板DNA混合在同一个反应体系中分别特 和多个模板 混合在同一个反应体系中分别特 异扩增不同的目的条带，常用于突变缺失检测、 异扩增不同的目的条带，常用于突变缺失检测、 多态分析等； 将多条引物和单一的模板DNA 多态分析等；二、将多条引物和单一的模板 混合在同一反应体系中扩增同一模板的不同片段， 混合在同一反应体系中扩增同一模板的不同片段， 常用于对超长片段的扩增。 常用于对超长片段的扩增。
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4、原位PCR
原位PCR就是在组织细胞里进行 就是在组织细胞里进行PCR反应，它结合了具有细胞定位能力的原位 反应， 原位 就是在组织细胞里进行 反应 杂交和高度特异敏感的PCR技术的优点，是细胞学科研与临床诊断领域里的一 技术的优点， 杂交和高度特异敏感的 技术的优点 项有较大潜力的新技术. 项有较大潜力的新技术 原位PCR是Hasse等于 等于1990年建立的，实验用的标本是新鲜组织、石蜡包埋组 年建立的， 原位 是 等于 年建立的 实验用的标本是新鲜组织、 脱落细胞、血细胞等. 织、脱落细胞、血细胞等 其基本方法为①固定细胞:将组织细胞固定于预先用四氟乙烯包被的玻片上 将组织细胞固定于预先用四氟乙烯包被的玻片上， 其基本方法为①固定细胞 将组织细胞固定于预先用四氟乙烯包被的玻片上，并 用多聚甲醛处理，灭活除去细胞内源性过氧化物酶.②蛋白酶K消化处理 消化处理:用 用多聚甲醛处理，灭活除去细胞内源性过氧化物酶 ②蛋白酶 消化处理 用 60ug/ml的蛋白酶 将固定好的组织细胞片 ℃消化处理 后，96℃2min以灭 的蛋白酶K将固定好的组织细胞片 的蛋白酶 将固定好的组织细胞片55℃消化处理2h后 ℃ 以灭 活蛋白酶K.③ 扩增:在组织细胞片上 反应液， 活蛋白酶 ③PCR扩增 在组织细胞片上，加PCR反应液，覆盖并加液体石蜡后， 扩增 在组织细胞片上， 反应液 覆盖并加液体石蜡后， 直接放在扩增仪的金属板上，进行PCR循环扩增 有的基因扩增仪带有专门用于 循环扩增.有的基因扩增仪带有专门用于 直接放在扩增仪的金属板上，进行 循环扩增 原位PCR的装置 ④杂交 的装置.④ 扩增结束后， 原位 的装置 杂交:PCR扩增结束后，用标记的寡核苷酸探针进行原位杂 扩增结束后 交.⑤显微镜观察结果 ⑤显微镜观察结果. 原位PCR既能分辩鉴定带有靶序列的细胞，又能标出靶序列在细胞内的位置， 既能分辩鉴定带有靶序列的细胞， 原位 既能分辩鉴定带有靶序列的细胞 又能标出靶序列在细胞内的位置， 于分子和细胞水平上研究疾病的发病机理和临床过程及病理的转归有重大的实 用价值.其特异性和敏感性高于一般的 其特异性和敏感性高于一般的PCR. 用价值 其特异性和敏感性高于一般的
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多重PCR的优点：①高效性，在同一PCR反应管内同时检出多种病原微生 的优点： 高效性，在同一 多重 的优点 反应管内同时检出多种病原微生 或对有多个型别的目的基因进行分型，且所需模板或样品量极少， 物，或对有多个型别的目的基因进行分型，且所需模板或样品量极少，应 用一滴血就可检测多种病原体。 系统性，多重PCR很适宜对症状相同或 用一滴血就可检测多种病原体。②系统性，多重 很适宜对症状相同或 容易污染相同食品的一组病原菌进行分析，即适宜对成组病原体进行检测， 容易污染相同食品的一组病原菌进行分析，即适宜对成组病原体进行检测， 如肝炎病毒，肠道致病性细菌，性病，无芽胞厌氧菌， 如肝炎病毒，肠道致病性细菌，性病，无芽胞厌氧菌，战伤感染细菌及细 菌战剂的同时检测③经济简便性，多种病原体在同一反应管内同时检出， 菌战剂的同时检测③经济简便性，多种病原体在同一反应管内同时检出， 将大大的节省时间，节省试剂，节约经费开支， 将大大的节省时间，节省试剂，节约经费开支，为临床或食品安全检测提 供更多更准确的诊断信息。 供更多更准确的诊断信息。 多重PCR的不足：①灵敏性和检测的特异性低 ②需要优先扩增某一特定 的不足： 多重 的不足 容易形成引物二聚体。多重PCR要求不同的引物能在同一反应体 片段 ③容易形成引物二聚体。多重 要求不同的引物能在同一反应体 系中进行各自的特异性扩增， 系中进行各自的特异性扩增，但是它的体系建立和条件优化过程需要较长 的时间，所以在一定程度上限制了该方法的推广应用。 的时间，所以在一定程度上限制了该方法的推广应用。
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7、多重PCR
自从1988年，Chamberlain研究表明 年 研究表明PCR可以同 自从 研究表明 可以同 时扩增人类肌营养不良蛋白基因多个基因座以来， 时扩增人类肌营养不良蛋白基因多个基因座以来， 多重PCR技术得到研究人员的广泛关注，并且已 技术得到研究人员的广泛关注， 多重 技术得到研究人员的广泛关注 经逐渐发展成为一种通用技术。如今，多重PCR 经逐渐发展成为一种通用技术。如今，多重 技术已经广泛的应用于病原体鉴定、性别筛选、 技术已经广泛的应用于病原体鉴定、性别筛选、 连锁分析、法医研究、 连锁分析、法医研究、模板定量和遗传疾病诊断 之中。 之中。
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Techniques of genetic engineering
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衍生的） 六. Different ramificate(衍生的）methods of PCR 衍生的
1、热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高 、热启动 是除了好的引物设计之外， 是除了好的引物设计之外 提高PCR特异性最 特异性最 重要的方法之一。 重要的方法之一。 原因：尽管Taq DNA聚合酶的最佳延伸温度在 ℃，聚 原因：尽管 聚合酶的最佳延伸温度在72℃ 聚合酶的最佳延伸温度在 合酶在室温仍然有活性。因此， 反应体系配制过程中， 合酶在室温仍然有活性。因此，PCR反应体系配制过程中， 反应体系配制过程中 以及在热循环刚开始， 以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特 异性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。 异性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。 对策： 对策： 限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制 聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR 限制 聚合酶活性的常用方法是在冰上配制 反应液，并将其置于预热的PCR仪。这种方法简单便宜，但 反应液，并将其置于预热的 仪 这种方法简单便宜， 并不能完成抑制酶的活性， 并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特异性产 物的扩增。 物的扩增。
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热启动通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到 合成， 热启动通过抑制一种基本成分延迟 合成 PCR仪达到变性温度。 仪达到变性温度。 仪达到变性温度 包括延缓加入 延缓加入Taq DNA聚合酶 使用蜡防护层将 聚合酶; 蜡防护层将 包括延缓加入 聚合酶 使用蜡防护层 一种基本成分，如镁离子或酶，包裹起来， 一种基本成分，如镁离子或酶，包裹起来，或者将 反应成分，如模板和缓冲液，物理地隔离开。 反应成分，如模板和缓冲液，物理地隔离开。在热 循环时， 循环时，因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在 一起; 一起 聚合酶的活性需经过 95 ℃ 10mins 的