当前位置：文档之家 › 3730测序

3730测序

  • 格式：doc
  • 大小：188.50 KB
  • 文档页数：7

3730测序仪操作流程
打开电脑，打开机器，待建立连接后，双击桌面图标“DC”。

待“Service Console”四个指示灯，全部变红后，自动显示操作窗口。

1预备阶段
换胶、换Runing buffer、Water。

胶从四度冰箱中取出，添加至原来的胶瓶中。

少量多次，避免浪费。

Buffer 一般三天换一次，最长一周一次。

主要是阳极杯和buffer槽（阴极）。

Water、Waste 槽中均换新鲜纯净水。

关闭舱门。

2 样品准备
按照BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit说明书。

3 操作Module mangager
点击进入后，根据毛细管长度，胶的类型及应用适当填写，如“3730_Seq_36cm_Pop7”。

Type 选择 regular，Template选择StdSeq36_Pop7，也可略有改动。

点击OK，保存。

Protocal manager
点击进入，Instrument protocal点击的New，键入Name，命名规则如上一步所示。

Run moduler 选择在Module manager 所建立的 Type选择Regular dye set选择bigdye3.1, 点击OK
在analysis Protocal中点击New，键入名字，其他保持默认值，也可根据需要略微改动。

点击Plate manger>new>出现一个对话框，Application选择sequence analysis,Plate type 选择96孔板，Sealing 选择speta，其他根据实际情况填写，点击OK进入下一步。

键入Sample名字，选择Results group 地址，Instrument protocal，analysis Protocal均选择在上一步中建立的。

选中RG 、IP、AP在Edit中选择Fill down¬(96/48)点击OK 。

在Run schduler 选中刚刚建立的Plate。

Search all通过Search 或者Find all进行寻找，找到后，选中，单击Add。

此时所编写的板子会出现在Input Stack中，选中点击菜单栏中的绿色箭头。

数据分析：在result group中寻找结果，并用sequence analysis软件进行分析。

关机：关掉软件窗口，待service console中四个指示灯全部变红后，关掉控制台。

整个过程中控制台，一直开着，不要关闭。

关闭机器及电脑的电源。

3730DNA分析系统的技术特点：
•双光束双侧激光激发，后置超薄CCD
•全自动上样系统
•内置条形码阅读器
•自动碱基识别与质量评分软件
•最新推出POP-7液体分离胶
•良好的温控装置提供了更大的温控范围（18~70℃）
3730DNA分析系统用于DNA测序的主要优点：
•电泳温度可达70℃，有助于去除二级结构的影响
•良好温控装置保证片段分析准确性及重现性好
•新的液体分离胶(POP~7TM Polymer)使通常读序长度即可达800bp
•新型碱基识别与质量评分软件，提高测序准确性
•毛细管内荧光检测，灵敏度高
•双光束双侧激光激发，荧光信号强度高度均一
•高灵敏度提高了测序模板DNA的浓度范围
•ABI 3730XL 测序仪为满足测序用户对大规模测序节省时间、降低成本和操作复杂性的要求，Applied Biosystems 推出新的3730XL 系列DNA分析仪。

3730xl 采用最新的光路系统设计，结合更优化的试剂组合和全自动化操作流程，在提高产率、提高数据质量的同时最大限度的降低试剂的消耗。

应用3730 测序平台分离胶的用量可以节省30倍，反应缓冲液节省200倍，荧光染料只需要原来浓度的一半，3730xl由于致力于改进影响测序质量的最关键因素，所以能够提供给您更快更准测序成本更低的操作平台。

• ABI全自动DNA测序仪（遗传分析仪）的详细介绍
•3730xl的主要特点：
•- 双光束双侧激光激发，光栅分光装置和后置超薄CCD检测成像系统
- 内置一体化自动进样器及样品孔打孔装置
- 内置样品板条形码自动识别
- 100次（9600个样品）运行试剂一次上机
- 自动碱基识别与质量评分判定
- 最新推出POP-7液体分离胶，动态内镀毛细管壁
- 电泳温度范围18-70C
3730xl 主要好处
- 高质量测序结果
•电泳温度70C，去除二级结构的影响
•新型分离胶，可测1100碱基测序长度。

•新型碱基识别与质量评分软件，提高测序准确性
- 最高灵敏度的光路系统
•毛细管内荧光检测
•后置超薄CCD检测系统
•双光束双侧激光激发，荧光信号强度高度均一
•高灵敏度提高检测DNA的浓度范围
- 超低成本测序平台
•高灵敏度减少DNA和测序试剂的使用量。

•胶使用量比3700少30倍
•高成功率及长读结果减少非电泳相关的整体项目成本
•更高的自动化减少劳力成本及人为失误的成本
高通量减少仪器折旧，人力及维护的平均成本
3730xl产率分析
测序模式毛细管电泳时间读序长度每天产率
短片段测序36 cm36min500bp1,728,000 bp
快速测序36 cm60min700 bp1,440,000 bp
标准测序36 cm90min800 bp1,113,000 bp
长片段测序50 cm120min1100 bp1,002,000 bp
规格指标:。

合集下载

3730测序(Sanger法)常见问题分析(汪大海)

3730测序(Sanger法)常见问题分析(汪大海)


Sequencing Analysis 5.2软件 峰图分析窗口
• 电泳图谱Electropherogram窗口
峰形是否正常/有无杂 带/信噪比/测序长度
Sequencing Analysis 5.2软件 Sequence窗口
• 原始数据raw窗口
平均信号高度/峰有无变宽/ 左右峰高是否均衡
信号值正常范围：150-1500
QV= -10×lgpe 上面公式中， Pe代表碱基读取的错 误概率 QV10 代表Pe=10%；
QV20 : Pe=1%； QV30 : Pe=0.1%
QV40 : Pe=0.01%
信噪比(Signal/Noise) S/N
3% Bkg. Noise 30
7.5% Bkg. Noise
13
12.5% Bkg. Noise
四、毛细管寿命与电泳
毛细管寿命到期： 峰的左右不对称，向后拖，有小突起
突起部分
宽峰
● 现象 – 测序峰逐渐变宽。 ● 原因 – 样品进入毛细管 太多。 ● 对策 – 稀释样品浓度， 重新进样。 – 减少电进样(EKI) 时间。
还有很多其它的问题
• 每个影响测序反应和3730正常运行的因 素都可能影响到测序进行
局部高GC一般会导致信号中断或乱峰
重复序列
GT重复导致信号衰减
A/G重复导致信号衰减 或信号乱
回文结构
回文结构导致信号衰减
其他复杂的二级结构也会导致衰减
从序列上看不到明显结构
Thank you!
8
20% Bkg. Noise
5
影响测序质量的主要因素
• DNA模板（关键） • 引物 • 测序试剂 • PCR仪 • 纯化方法
3730测序结果说明

3730测序结果说明

测序结果说明1.测序完成后，我们用对每个样品提供一份测序报告，其中包括：测出的序列彩色峰图（请用Chromas软件打开）序列文件拼接后结果（需要测通的样品）2.在进行DNA测序时，紧接引物的10~30碱基有时不一定能完全读清楚。

3.正常情况下，3730测序仪保证800bp的有效长度，但是有时由于DNA结构上的原因，有时会出现反应中断无法进行的情况。

如：G/C rich；G/C Cluster；Poly A/T/C/G的连续结构等。

此外，另一种情况为反应中途出现的套峰现象，此种情况一般为DNA结构中的重复序列，造成测序用引物和模板之间有两个以上结合位点。

以上情况是由于DNA结构原因造成了无法正常进行DNA测序，对这种情况，我们会根据具体测序结果进行相应收费。

出现以上情况后，我们提倡从另一端进行测序，或者用高级试剂盒进行测序。

4.备注说明一般正常的菌液和质粒自收样日至发送报告日周期为二--三天，PCR产物（纯化及未纯化）为三--四天。

对于三个工作日内无法得到满意测序结果的，我们会用E-mail或电话与客户或代理商联系。

并不是所有的样品都能得到满意的测序结果，对于测序结果不好的，我们会尽力找到可能的原因，以建议进一步如何操作。

测序常见问题解答Q1.为什么提供新鲜的菌液？如何提供新鲜的菌液？A1.首先，新鲜的菌液易于培养，可以获得更多的DNA，同时最大限度地保证菌种的纯度。

如果您提供新鲜菌液，用封口膜封口以免泄露；也可以将培养好的4~5ml菌液离心沉淀下来，倒去上清液以方便邮寄。

同时邮寄时最好用盒子以免邮寄过程中造成离心管挤压破裂。

Q2.DNA测序样品用什么溶液溶解比较好?A2.溶解DNA测序样品时，用灭菌蒸馏水溶解最好。

DNA的测序反应也是Taq酶的聚合反应，需要一个最佳的酶反应条件。

如果DNA用缓冲液溶解后，在进行测序反应时，DNA溶液中的缓冲液组份会影响测序反应的体系条件，造成Taq酶的聚合性能下降。

3730测序流程

3730测序流程


能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；
蛋白质与染色体DNA不复性而呈絮状，通过离心可
沉淀下来
碱裂法提取质粒操作步骤
菌体的培养
（挑单克隆或加少量菌液在含抗生素的培养基中，37℃震荡过夜培养
菌体的收集
（13000rpm离心1min，使菌体充分沉淀，弃上清）
质粒提取步骤一： 加入200ul I液 ，充分振荡,直到管底无沉菌为止 • 溶液I的组分：1.0M Tris-HCl / 0.5M EDTA， pH8.0，用前按比例加入RNase酶 • 溶液I的作用：菌体悬浮 • EDTA是在溶液I中主要起抑制DNase的作用 。 • 如果缺了溶液I，我们也可以用等体积的水或 LB培养基来悬浮菌体。 • 特别注意：菌体一定要悬浮均匀，不能有结 块。

五 上机操作
ABI 3730xl 自动测序仪外观图
胶泵
废液槽 POP7胶瓶 阳极缓冲液瓶 CCD检测窗口 缓冲液槽 水槽
96个样品自动进样及一体化16板自动进样样品架
已跑完板子放这 待上机样品放这
六 测序结果的分析处理
3730xl Sequence Map
测序结果峰图文件
Thanks!
ABI BigDye 3.1的组成成分
• • • • • • 测序酶 脱氧的dNTP 双脱氧的dNTP(荧光标记) Mg2+ ddH2O buffter
DNA测序模板用量
PCR产物
100-200 bp 200-500 bp 500-1000 bp 1000-2000 bp 2000 bp 1- 3 ng 3-10 ng 5-20 ng 10-40 ng 20-50 ng
RNase酶未加或失活
质粒提取步骤二： 加入300ul II液， 轻柔颠倒5~10次。 • 溶液II的组分： 0.4 N NaOH / 2% SDS； 两种溶 液等体积混合后使用 ，必须现用现配 • 溶液II的作用：裂解作用 • 溶液II在天气冷时会产生絮状沉淀，可温水预热 至沉淀消除。 • SDS是离子型表面活性剂。它主要作用是： a.溶解细胞膜上的脂质与蛋 白，从而破坏细胞膜。 b.解聚细胞中的核蛋白。 c.能使蛋白质变性而沉淀下来。
DNA第一代,第二代,第三代测序的介绍

DNA第一代,第二代,第三代测序的介绍

原理是：核酸模板在DNA聚合酶、引物、4 种单脱氧核苷三磷酸 ( d NTP，其中的一种用放射性P32标记 )存在条件下复制时，在四管反应系统中分别按比例引入4种双脱氧核苷三磷酸 ( dd NTP )，因为双脱氧核苷没有3’-O H，所以只要双脱氧核苷掺入链的末端，该链就停止延长，若链端掺入单脱氧核苷，链就可以继续延长。

如此每管反应体系中便合成以各自的双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。

反应终止后，分4个泳道进行凝胶电泳，分离长短不一的核酸片段，长度相邻的片段相差一个碱基。

经过放射自显影后，根据片段3’端的双脱氧核苷，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。

Sanger法因操作简便，得到广泛的应用。

后来在此基础上发展出多种DNA 测序技术，其中最重要的是荧光自动测序技术。

荧光自动测序技术荧光自动测序技术基于Sanger 原理，用荧光标记代替同位素标记，并用成像系统自动检测，从而大大提高了D NA测序的速度和准确性。

20世纪80 年代初Jorgenson 和 Lukacs提出了毛细管电泳技术( c a p il l ar y el ect r ophor es i s )。

1992 年美国的Mathies实验室首先提出阵列毛细管电泳 ( c a p il l ar y ar r a y el ectr ophor es i s ) 新方法，并采用激光聚焦荧光扫描检测装置，25只毛细管并列电泳，每只毛细管在内可读出350 bp，DNA 序列,分析效率可达6 000 bp/h。

1995年Woolley研究组用该技术进行测序研究，使用四色荧光标记法，每个毛细管长，在9min内可读取150个碱基，准确率约 97 % 。

目前, 应用最广泛的应用生物系统公司 ( ABI ) 37 30 系列自动测序仪即是基于毛细管电泳和荧光标记技术的D NA测序仪。

如ABI3730XL 测序仪拥有 96 道毛细管, 4 种双脱氧核苷酸的碱基分别用不同的荧光标记, 在通过毛细管时不同长度的 DNA 片段上的 4 种荧光基团被激光激发, 发出不同颜色的荧光, 被 CCD 检测系统识别, 并直接翻译成 DNA 序列。