cDNA末端快速扩增技术RACE

编号：2-5主题：RACE技术概述：近年来随着生物技术的不断发展，出现了许多克隆新基因的方法和手段，cDNA 末端快速扩增技术（rapid amplification of cDNA ends，RACE）是一种基于PCR从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5'和3'末端的有效方法，以其简单、快速、廉价等优势而受到越来越多的重视。

目的：1.可用于cDNA文库的构建及筛选。

2.应用RACE克隆已知片段的旁侧内部序列。

3.RACE可用于克隆同源基因的同源片段，为寻找同源基因提供了一种手段。

4.RACE技术与生物信息学,例如EST库相结合,具有快速,高效克隆新基因的特点。

原理：RACE是采用PCR技术由已知的部分cDNA顺序来扩增出完整cDNA5’和3’末端，是一种简便而有效的方法, 包括单边PCR和锚定PCR。

操作步骤：1、3’RACE-PCR3’-RACE的步骤是:利用mRNA的3’末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以连有SMART寡核营酸序列通用接头引物的Oligo(dT)30MN作为锁定引物反转录合成标准第一链cDNA。

然后用一个基因特异引物GSP1(gene specific primer, GSP)作为上游引物，用一个含有部分接头序列的通用引物UPM(universal primer ,UPM)作为下游引物，以cDNA第一链为模板,进行PCR 循环，把目的基因3’末端的DNA片段扩增出来。

2、5’RACE-PCR5‘-RACE的步骤是先利用mRNA的3‘末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以Oligo(dT)30MN作为锁定引物在反转录酶MMLV作用下，反转录合成标准第一链cDNA。

利用该反转录酶具有的末端转移酶活性，在反转录达到第一链的5‘末端时自动加上3-5个(dC)残基，退火后(dC)残基与含有SMART 寡核苷酸序列Oliogo(dG)通用接头引物配对后，转换为以SMART序列为模板继续延伸而连上通用接头。

cD NA末端快速扩增技术(RACE)的优化与改良Ξ李关荣1,2,鲁　成2,夏庆友2,向仲怀2(1.西南农业大学农学与生命科学学院,中国重庆　400716;2.西南农业大学蚕学与生物技术学院,中国重庆　400716)摘　要:cDNA末端的快速扩增(RACE)法是延伸已知部分外显子序列和克隆全长cDNA基因的主要方法之一.广泛用于许多已知功能基因片段的进一步延伸和全长cDNA的克隆.但由于其过程复杂、涉及多步连续的酶促过程,如反转录、TdT加尾、第二链合成、RACE2PCR扩增及RACE产物克隆等,在实际应用中有许多问题和相当难度.主要针对RACE各步骤中存在的问题进行了分析,并对其优化和改良进行了综述.关键词:cDNA末端的快速扩增法;优化;改良中图分类号:Q781 文献标识码:A文章编号:100727847(2003)0320189209The Optimization and Improvement of R apid Amplificationof cDNA E nds(RACE)LI G uan2rong1,2,LU Cheng2,XIA Qing2y ou2,XIANG Zhong2huai2(1.College o f Agronomy and Life Sciences,Southwest Agricultural Univer sity,Chongqing400716,China;2.College o f Sericulture and Biotechnology,Southwest Agricultural Univer sity,Chongqing400716,China)Abstract:Rapid am plification of cDNA ends(RACE)is one of the main methods for extending partially known ex on sequence and cloning of its full2length cDNA.It has been widely used in further extending of functional fragments of genes of interests especially the cloning of the full2length cDNAs.RACE inv olves multiple enzyme2 catalyzed processes,such as reverse transcription,TdT tailing,the second2strand cDNA synthesis,RACE2PCR am plification and the cloning of RACE products,which in practice have many problems and difficulties.These problems are analyzed in depth and the optimizations and im provements on each of the processes are reviewed.K ey w ords:RACE;optimization;im provement(Life Science Research,2003,7(3):189～197) cDNA末端快速扩增(Rapid Am plification of cDNA Ends,RACE)是扩增在mRNA的3′2末端或5′2末端的未知序列和已知部分外显子序列间的核酸序列的方法.此种单边特异性的扩增又称为“单边PCR”(One2sided PCR)或锚定PCR(Anchored PCR).通常扩增复杂混合物中相对较少的目标分子的PCR要求扩增序列段的两个序列特异性引物,但为了扩增和鉴定未知序列区域,此种要求就构成了严重的局限.3′2和5′2RACE法提供了解决此问题的可能方法.这两种方法的结合可望获得全长cDNA基因.1　RACE技术的原理及步骤3′2RACE利用mRNA3′2末端天然存在的P oly第7卷　第3期2003年9月 生命科学研究Life Science Research V ol.7　N o.3Sep.2003Ξ收稿日期:2003204201;修回日期:2003208208基金项目:国家自然科学基金资助项目(30070580)作者简介:李关荣(19632),男,四川营山人,西南农业大学副教授,博士,主要从事生物化学与功能基因克隆研究,T el:+8620232 68251264,E2mail:lgrxn@s (A)尾作为PCR扩增的通用引发点.首先用反转录酶和Olig o2dT接头引物对mRNAs进行反转录,使之转换为cDNA.然后,用一个能与已知外显子序列区退火的基因特异引物(G SP)和定位在P oly(A)尾部的接头引物直接进行PCR,扩增特异cDNA.这样,就能捕获位于外显子和P oly(A)尾之间的未知3′2mRNA序列.5′2RACE是一种从低拷贝信息中分离和鉴定5′2末端未知序列的方法.Frohman和Loh都综述过此法[1,2].尽管不同的使用者采用的具体的步骤略异,但策略是一致的.第一链cDNA的合成使用基因特异的反义寡核苷酸(G SP1)引发,使特异的mRNA及其相关家族转换为cDNAs,使完全延伸到5′2末端的潜力达到最大.第一链cDNA产物经纯化,去除未渗入的dNTPs和G SP1,用末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT)在cDNA的3′2末端加同聚尾[poly(T)或P oly(C)].最初,加尾后的cDNA用3个引物的混合物(在G SP1的3′2末端退火的基因特异性引物G SP2、互补的含同聚尾的锚定引物和相应的接头引物)进行PCR扩增.这使mRNA的5′2末端和G SP2间的未知序列得以扩增.RACE方法多用于传统cDNA克隆方法不易检测或挑战性极大的稀有mRNA的扩增和克隆. RACE也可用于已有的cDNA文库.随机六聚体引发合成的cDNA也曾用于5′2RACE从单一第一链反应中扩增和克隆了多个基因.RACE产物可直接测序,勿需任何中间克隆步骤;或用于制备探针. 3′2RACE和5′2RACE的产物可以结合得到全长cDNA.RACE法还可与外显子捕获法结合鉴定未知编码区序列.RACE法的重要特征是在PCR中使用一个根据mRNA的已知序列而设计的基因特异引物(G SP)和一个与mRNA的P oly(A)尾互补的“通用引物”(3′2RACE)或与添加在cDNA的3′2末端的同聚尾互补的“通用引物”(5′2RACE).因同聚物不是良好的PCR引物,为了便于RACE产物的克隆,通用引物的5′2末端常引入一个限制性位点.用于RACE2PCR的cDNA模板可用Olig o2dT引物(3′2和5′2RACE),也可用与mRNA中的已知序列互补的引物(仅5′2RACE).在RACE2PCR产物复杂时,可取一等分的产物用第二个(在第一个引物内)特异的引物和原来的通用引物进行第二轮PCR,此为所谓的Nested PCR.2　RACE步骤的优化和改良2.1　反转录影响RACE结果的最关键步骤是mRNA的反转录合成第一链cDNA.这在克隆全长mRNA的5′2末端时尤其突出,因为不完全的cDNA仍然可以用TdT加尾和其后被PCR扩增.这些不完全分子与全长分子具有相同的末端,它们和全长分子都可以在PCR中扩增.这些不完全cDNA的存在,极大降低甚至不能产生代表全长cDNA的PCR产物,因为在有异质和具相同末端底物的PCR反应液中,较小的DNA分子较易发生扩增[3].因此,应当优化反转录过程,尽可能地避免不完全cDNAs的产生,因而必须使用高质量的、未被降解的mRNA.常用一步分离法[4],从组织或少量组织培养细胞中提取总RNA,对于大量的组织培养细胞,可采用胞质RNA制备方法制备[5].还有人建议用olig o(dT)2 cellulose或用试剂盒纯化RNA,去掉非腺苷酸化的RNAs.使用poly(A)2mRNA可以避免含内含子序列的cDNAs的产生和克隆.如果材料足够,可用与RACE等量的RNA样品进行电泳、N orthern印迹.用已知cDNA序列做探针检测,以证实目的序列存在且并未明显降解.但是,即使高质量的mRNA,在反转录过程中也会产生许多不完整的cDNAs.通常认为,这种切短的cDNAs的产生是由于反转录酶在有稳定的二级结构的mRNA区不能继续进行聚合反应所致[6].G CΠAU比率高的转录本及含有稳定的二级结构区,更有可能产生切略了的cDNAs.在反转录过程中降低mRNAs二级结构稳定性的一个有效方法是在反应前提高反应混合物的温度(37～42℃).嗜常温的反转录酶(AMV2RT和M M LV2RT)只能在低于大约50℃的温度下起作用.现已有热稳定的DNA聚合酶,可以在很高的温度下(60～70℃)有活性.在此温度下,RNA的二级结构不稳定,反转录可以更容易进行到mRNA分子的5′2末端.在某些条件下,可以反转录mRNA的嗜热DNA聚合酶主要有rTth(PE公司)和TetZ(Amersham).甚至Taq酶也有表现出反转录酶活性的报道.虽然rT th酶较嗜常温的反转录酶对二级结构不敏感[7],但也有不足.首先,rT th主要是一个DNA 指导的DNA聚合酶,其最适温度在70℃,与嗜常温的反转录酶的操作温度相比,更有利于DNA的去稳定.因此,更有可能引发污染的基因组DNA发091 生　命　科　学　研　究 2003年生延伸.DNA的污染问题可以通过用RNase2free DNase进行预处理而很容易避免[8].其次,高于15 min的反转录反应,在最适聚合酶活性所要求的高温和二价阳离子(Mn2+)的存在下,由于RNA的快速水解,偏向于产生切略的cDNAs.部分降解的RNAs分子可以引发反转录,产生不完全的cDNAs.此种现象可能会导致rT th产生长于1kb的cDNA的合成能力下降,因为长的延伸需要长的温育时间,而时间的延长又会增加模板降解(水解).因此,反转录的时间应控制在15min之内,需要反转录的区域应控制在最小长度.因此,在用RACE扩增、克隆5′2末端时,反转录应采用特异引物而不是olig o (dT),且此引物应尽可能定位在远离部分cDNA的5′2末端,以便保留足够的序列以设计两个PCR内引物和第3个检测特异PCR产物的S outhern杂交区.另外,因为全长cDNA只有在酶分子和模板分子的比例为1或较高的情况下才能有效产生,在反转录反应中不应使用过量的RNA或cDNA引物.究竟多少量的RNA才会造成模板过剩,只能通过经验确定.有证据表明,对大多数方法中引物浓度可以在数个数量级内变化.2.2　TdT加尾和第二链cDNA的合成标准的RACE要求把第一链cDNA用TdT酶加上一个脱氧核糖核酸同聚尾[1,2,9].然后此同聚尾作为下步与锚多聚连接物杂交的底物.锚多聚连接物有一个3′2末端同聚物锚(N)15,可与cDNA的同聚尾互补,然后由锚(N)15引发第二链cDNA的合成.但此法也可能失败或促进无关产物的形成.为了使同聚加尾成功,反转录后自由的核苷酸和过剩的cDNA引物必须除去.如果自由的核苷酸未除去,它将被TdT加入到3′2末端cDNA尾中去,从而干扰互补同聚物尾与锚引物的杂交.如果不除去过剩的cDNA引物,其3′2末端将与cDNA末端竞争加尾,从而降低cDNA加尾的效率.加尾的cDNA 引物还可以与加尾的锚引物退火,与cDNA发生竞争,从而降低第二链cDNA合成的效率.这些小分子将会在下步用锚引物PCR反应中作为退火和延伸的底物,降低PCR的效率[10].为了去除过剩的自由核苷酸和引物,可采用分子排阻类方法如Centricon microconcentrator(Amicon)[7].但更简便、更经济有效的方法是使用1Π4体积的10m olΠL醋酸胺和3倍体积的100%的乙醇的两步沉淀法.5′2RACE加尾一个主要问题是所有的cDNAs,无论是不是全长,都被TdT加尾.一旦锚引物加到第二链合成中,这些切略了的cDNAs会在PCR中与全长产物竞争扩增[7].如果切略了的cDNA比全长cDNAs短得多的话,它们就可发生趋向性扩增[3],使得PCR反应不能积累足量的全长cDNA,因而不能检测到目的产物,降低这些切略了的cDNAs产生的唯一方法是优化反转录过程[7].另一个导致切略cDNAs产生的原因可能存在于第二链合成中.如果目标cDNA含有与anchor (N)15同聚尾互补的数个核苷酸构成的同聚物区,第二链合成就可从这个内部序列处引发,而不是从末端同聚区,从而会产生切略的第二链.Anchor(N)15的内部引发可以用许多方法克服.因为A∶T配对比G∶C配对的氢键要弱得多,使用A和T同聚物尾趋向于产生较少的内部引发[7,8].但是,对于富含AT的基因组中,anchor(N)15的内部引发率却较高[11].另一种降低非特异性的anchor(N)15引发的方法是在第二链合成中避免使用太多的引物或太低的杂交温度.2.3　加尾的其它替代方法上述加尾策略本身存在许多缺陷,有几个研究组独立地设计了RACE技术的改良方法以绕过cDNA的TdT介导的加尾.所有这些改良方法都使用RNA ligase以共价方式把寡核苷酸锚连在cDNA 的5′2末端[12～15]或直接连接在起始RNA群上[11,16,17].因此这些策略既可消除TdT加尾这一步,又可消除Anchor(N)15引发的第二链cDNA的合成.这样,Anchor(N)15的内部引发可能性就得以完全消除[15].在把Anchor直接连接在RNA上的方法中,从理论上讲,具有3′2末端anchor序列的任何切略cDNAs的产生都得以避免[11].有几个研究组发表了把DNA锚定寡核苷酸连接在cDNA上的方法[12～15].此种RACE变种通常称为锚连接PCR (Ligation2anchored PCR,LA2PCR)[12,13]或称单链cDNA末端的单链连接(Single2strand ligation to ss2 cDNA ends,S LIC)[14,15].连接反应是通过T4RNA连接酶催化进行的,此酶具有连接单链脱氧核糖核酸和核糖核酸的能力[18].然后,使用特异的3′2末端引物和锚引物,连接了锚的cDNA可直接用于PCR 扩增,这与标准的RACE法相同.寡核苷酸锚在用于连接反应前,必须作两个修饰改变.首先,必须使其5′2末端磷酸化,才能使其成为T4RNA连接酶的底物[18].这可通过在合成寡核苷酸时或通过T4多核苷酸激酶和ATP的酶学方191第3期 李关荣等:cDNA末端快速扩增技术(RACE)的优化与改良 法而完成[12];其次,寡核苷酸锚的3′2末端必须封闭,以避免形成寡核苷酸锚的串联体.这一种修饰也可以在体外合成中通过用已封闭了的氨基核苷酸类似物作为最后的碱基或在寡核苷酸合成后,用TdT介导的方法在其3′2末端加上一个双脱氧核苷酸[14,15]而实现;另一个要求是,cDNA合成使用的寡核苷酸必须具有一个5′2末端羟基,这样cDNA分子的5′2末端才不会成为RNA连接酶的底物[12,14]. cDNA合成后,RNA模板可通过化学方法用NaOH 在高温下处理降解.碱处理把RNA水解为带5′2OH 和3′2P或2′2P的核糖核苷酸,RNA的转化产物不是T4RNA ligase的底物[13].通过上述步骤除去或钝化了连接反应的所有竞争性抑制剂后,连接酶的唯一底物就只有寡核苷酸锚和cDNA分子的3′2OH.然后,连接了锚的cDNA就可用特异的3′2末端引物和锚引物直接进行PCR扩增.尽管LA2PCR避免了在第二链合成中由于第一链cDNA分子的内部同聚物与Anchor(N)15的退火产生的切略cDNAs,但其它产生切略cDNAs的途径仍存在.严格地讲,cDNA合成中产生的任何不完整的第一链cDNAs都将作为T4RNA连接酶的底物,都有寡核苷酸锚连在其3′2末端,PCR仍然可以扩增这些切略了的cDNAs.相反,RNA连接酶介导的RACE(R LM2 RACE)[11],也称反转录连接介导PCR(R LPCR),可以避免所有5′2末端切略的产生.在此法中,RNA寡核苷酸锚序列被连接到mRNA的5′2末端.然后,此锚修饰了的mRNA反转录产生第一链cDNA,后者用3′2末端特异引物和一个DNA锚引物进行PCR 扩增[11,16,17,19],因为只有完全延伸为全长的cDNA 才具有3′2末端锚序列,在PCR中切略了的cDNA 将不会被扩增.切略cDNAs产生的唯一途径是在PCR过程中DNA锚引物的非特异性内部退火所致.此类问题可以通过仔细设计引物和调节PCR 参数而避免.在制备用于R LM2RACE的mRNAs时, mRNA必须用酶学或化学方法处理[16,17,19,20],除去共价交联在所有mRNA转录本5′2末端上的72 MeG ppp帽子结构.化学方法去帽采用β2消除法: RNA通过用高碘酸钠ΠS DS和甘油的顺序处理而被氧化.氧化了的mRNAs然后用环己酰胺处理以去除72MeG帽子.去帽后留在5′2末端的焦磷酸基团用CIP处理除去后,再用T4多核苷酸激酶和ATP重新加上一个磷酸基团,使其5′2末端成为T4多核苷酸激酶的底物(5′2末端焦磷酸不是T4RNA ligase的底物)[18].化学去帽的主要缺点是,降解的RNAs和非mRNAs都可被多核苷酸激酶磷酸化,产生连接反应不需要的底物[11],非mRNAs将竞争RNA锚引物,这可能导致mRNAs连接效率的降低.但更有害的是可能降解的mRNAs,其5′2末端也连有锚引物,在反转录时,此切略了的mRNAs会产生具3′2末端锚的切略的cDNAs,后者会在PCR中扩增.酶学方法去帽步骤少,避免了化学去帽的不足[11].RNA样品首先用碱性磷酸酶处理,除去所有降解了的RNAs和不具帽的RNAs的5′2末端磷酸基团[16,19],通过热钝化或用酚2氯仿抽提,使碱性磷酸酶失活后[16],其中的mRNAs用烟酸焦磷酸酶(T AP)处理去帽,此酶水解mRNA帽的三磷酸桥上的磷酸苷键[20].这样,T AP处理后,在去帽的mRNAs上留下了一个5′2P,因此只有具帽的mRNA的5′2末端才转化成T4RNA ligase的底物.切略了的mRNAs却留下了5′2OH,锚引物不能与之连接.这样,只有未降解的mRNAs模板的全长cDNAs延伸产物的3′2末端才有锚引物序列[16].RNA寡核苷酸锚引物既可化学合成[16],也可通过用带有适当启动子(T7、T3和SP6)的线性化质粒模板的体外转录而合成[11,17].在这两种方法中,合成后的RNA寡核苷酸都不需要对其5′2末端进行修饰,因为体外转录产物已经具有了一个5′2末端PPP基团,而化学合成产物有一个5′2OH,它们都不是RNA ligase的底物.因此避免了RNA寡核苷酸锚的串联体的形成.从理论上讲,RNA寡核苷酸锚引物的长度不限,只要有数个核苷酸保证PCR反应的特异性就行.通常用30nt长,只是要控制其内部二级结构的形成和与mRANs群体中的部分互补序列的退火,因为它们会造成连接反应的效率降低.设计RNA锚引物也应遵循通常的PCR引物设计原则.一旦设计和合成了适合的RNA寡核苷酸锚引物后,就可通过T4RNA ligase将其连接到磷酸化的mRNAs上去.有人曾报道,在连接反应中添加PEG8000至终浓度25%可以增强连接效率.为了阻止mRNAs的环化,可在去帽前在其3′2末端加pC p[16]或用高碘酸钠处理RNA以除去3′2OH[17].在使用R LM2RACE扩增、克隆转录本的3′2末端的过程中,把DNA或RNA寡核苷酸锚连接到mRNAs分子的3′2末端.尽管DNA寡核苷酸在RNA连接反应中不是有效的受体,但却是良好的供291 生　命　科　学　研　究 2003年体[18],因此,可采用更易操作的DNA锚替代RNA 锚.如果用DNA锚,则可简单地用T4多核苷酸激酶磷酸化后,然后用T4RNA ligase将之连接在mRNA的3′2末端上.反转录是由另一与连接上的锚完全互补的DNA寡核苷酸引发的,PCR使用锚互补部分作为3′2末端引物和一个与已知cDNA序列互补的5′2末端引物[11,17].因为3′2末端锚是连接在mRNA的尾部的,在整个RACE产物中都保留了完整的mRNA尾.因此,除了能够明确确定克隆的转录本的完整3′2末端外,还可获得转录本3′2末端的有关生化信息.感兴趣的研究者可以根据各个克隆确定P oly(A)尾的长度及其长度的变化.同时还可确定特定转录本中是否具有经典的多腺苷酸化信号[11,17].2.4　PCR扩增关于PCR扩增技术及其参数的优化有很多的文献论述,本部分重点讨论某些简化和增强PCR 重复性的参数以及在PCR中遇到的问题的克服. 2.4.1　PCR的忠实性问题cDNAs的PCR扩增中的一个值得考虑的重要问题是聚合酶的忠实性.因为RACE技术是为确定未知cDNA序列设计的,必须注意使在PCR中引入的突变最少.现已有具3′→5′校对核酸外切酶活性的商品嗜热聚合酶可供使用,如p f u(Stratagene)和Vent(New England Biolabs)等.在这两种酶中,p f u的忠实性最高,每掺入一个核苷酸的突变率为1.6×10-6[21].据报道,Taq聚合酶的核苷酸误掺频率为2.5×10-5,比p f u高12倍左右[21].p f u酶还具有特别高的热稳定性,在95℃,60min仍有95%的活性[21].因此,可使用更高变性温度和变性时间的PCR循环而不会明显影响其聚合酶活性.Barnes报道[22],p f u和K len Taq1(一种遗传修饰了的Taq聚合酶)以1:15混合,其忠实性几乎与pfu本身一样高,扩增时间比两酶单独使用要高得多.因此认为,反应混合物中的少量的p f u足以除去此Taq酶所添加的误配碱基,进而继续推断,PCR扩增通常只限于10kb以内的模板,因为Taq酶过早地终止了引物的延伸.因此,当大于10kb的分子作为PCR 模板时,此种误掺发生频率太高,理想的产物不能有效扩增.p f u聚合酶的校对活性的加入足以克服此种障碍.为了增加PCR反应的产率和特异性,已经设计了一些方法,先把不含模板[23]或模板和聚合酶或活性酶的其它PCR组分混合,只有当混合物预热到引物退火温度以上时,再加入这些组分.有人认为此种“热启动”(hot start)法能防止在室温装配试剂过程中事先变性的模板与引物发生非特异性退火,从而改善引物与模板相互作用的特异性[23]. Taq聚合酶延伸模板的速度较慢,室温下每分钟约15nt[21],因此,非特异性的引物与模板退火或引物与引物配对,在试剂装配和进一步的PCR扩增中都会延伸,从而产生高背景的非特异性产物[23].因为p f u在低温下的聚合酶和外切酶活性低得可以忽略[21],所有PCR的反应组分都可在冰上(或在处于4℃的PCR仪)上装配,而不必担心非特异退火的引物或引物与模板被此酶的3′→5′校对核酸外切酶活性的降解.由于p f u具有高耐热性,初始变性温度高达98℃,5min,而不会引起酶活性明显降低,尽管长的变性时间可导致PCR模板的损害.因此整个反应混合物都可在严谨的条件下变性,然后立即冷却到适宜温度,使引物退火和延伸.这样,模板的复性和非特异性引物的退火均达到最小化.2.4.2　引物的设计引物设计是另一个对PCR结果有重大影响的参数.PCR技术的使用者有许多经验规则,但却无实验证据[3].但还是有几个基本的规律和计算方法,能使研究者成功地设计出产生理想的PCR产物而无或低背景的引物.引物的正确设计与扩增分子的长度有某种依赖性,200～400bp的长度在PCR中扩增效率最高.许多设计算不上很好的引物,在此大小范围内仍能扩增出理想的产物[3].因理想的全长RACE产物的大小在PCR进行前大都未知,设计的引物应当尽可能符合许多优化参数.首先,应避免使用3′2末端有互补性的引物对,以防止引物二聚体的形成.即使3′2末端仅有几个互补碱基,仍可产生引物二聚体,因为Taq酶延伸引物速度快;同时,还应避免使用3′2末端有自我互补的引物,因此种引物将会以自己为模板而延伸.另外,所有PCR引物的3′2末端应设计为不稳定,以使从非目标部位引发降到最低.在目的位点杂交的稳定性是由引物的5′2末端和中部区域决定的,引物是连续延伸的.相反,如果引物与非目的位点序列有短的互补,不稳定的3′2末端在这个短暂杂合未结束前,不可能非特异性地退火和被延伸.Rychlick根据最近邻核苷酸分析创建了一个DNA双链形成的自由能值表,这些值可用于估算给定序列的DNA双链的稳定391第3期 李关荣等:cDNA末端快速扩增技术(RACE)的优化与改良 性.Rychlick建议一个特异引物的3′2末端的5个碱基的稳定性不能超过29kcalΠm ol,这就是说,3′2末端的5个碱基不能超过两个G或C.他还建议,对于小于500bp的位点的扩增,引物长度应保持较短(16～18nt),而长的位点(5kb)的扩增应用较长的引物(大约20nt).尽管这些原则在使用含有克隆接头引物时,难以达到,但与目的分子互补的引物区应控制在16～18nt范围内.引物的G CΠAT比率要尽可能接近模板的G CΠAT比率.虽然RACE目的位点的大多数碱基对组成未知,但其G CΠAT比率却可以通过已知cDNA序列或目的基因组的G CΠAT比率而估算.2.4.3　PCR参数PCR参数显著影响特定PCR扩增的成败,特别是目的位点的大小有数千个碱基时[22].变性循环必须有足够高的温度和足够的时间,才能至少使目的分子的小段成功变性.从理论上讲,要实现最佳的PCR效率,只有所有的目的分子在每个变性循环中都变性才可能.但是,特别值得考虑的是, DNA脱嘌呤的速度随温度的升高和pH的降低而升高.在PCR中,在25℃,pH8.3的T ris bu ffer,当温度达到94℃以上时pH将降低(在95℃时pH值将降到6.1).当遇到一个脱嘌呤点时,Taq酶就不能继续延伸引物[22].据Barnes计算,PCR扩增目标在kb级或更小范围内脱嘌呤发生明显.因此,变性次数(时间)应当控制在成功PCR的最小要求内.94℃,10s这样短的变性循环曾用于成功扩增20kb以上的目的片段,加入助溶剂如甘油、DMS O 改进了这些实验的产率,这可能是由于降低了解链温度的原因.Cheng等也指出,PCR反应中高温的危害性,可通过使用在变性循环中pH稳定的PCR buffer而减低[27].如果使用一个温度系数比T ris小的bu ffer(如T ricine,Bicine,EPPS),在变性中就可以采用较高的温度,脱嘌呤的发生就会降低.对一特定PCR引物对,有许多计算理想杂交温度的公式[24,25].据报道,理想的杂交温度的计算也要求采用模板核苷酸的最近邻分析[3].但是,他们认为,如果引物设计适当,使其3′2末端不稳定,引物退火的最适温度范围相当宽.Schaefer发现,即使是最简单的退火温度估算公式:[2×(AΠT)+4×(GΠC)]25=T Hyb对大多数引物都很适用[26].在此公式中,引物退火温度通过赋予每个A或T2℃和每个G或C4℃来计算.然后杂交温度计为低于退火温度的5℃[24].在可能的情况下,最好使用退火温度相当的引物对.Cheng等报道,当使用退火温度为68℃的引物时,变性温度为94℃、退火Π延伸温度都为68℃的双温热循环效果都很好[27].在扩增目的片段时,一般每个kb需要延伸1min,尽管对于数个kb的目的片段的扩增,可能要求更长的延伸时间.在目的片段大小不清的RACE扩增中,要求的最大延伸时间可以通过N orthern杂交中mRNA 转录本的大小估算.2.4.4　增加特异性除非RACE克隆的目的cDNA很丰富,一次PCR扩增,通常不能产生足以用于克隆的理想产物.在RACE中,产生的许多非目的cDNAs的5′2末端都有锚定引物序列,这与使用两个特异的引物的PCR相比,RACE2PCR扩增的效率要低些,因为有相当量的锚定引物消耗在与非目的cDNAs序列的退火和后来的延伸中.非目的单链cDNAs的积累,增加了特异3′2末端引物的非特异性退火和聚合酶延伸的可能性,从而产生可在以后的循环中竞争核苷酸、聚合酶分子和两个引物的底物.但是,第一次PCR产物可经过纯化除去残留的引物后,使用锚定引物和另一个与第一次PCR 产物的cDNA序列互补的特异3′2末端引物进行第二次PCR扩增[2,9,19].Frohman报道,如果两次PCR 扩增的循环总数达到60个的话,理想的RACE产物就会在琼脂糖胶上,经溴乙锭染色表现出特异的带.另一种可以增强特异PCR产物的产率的方法称为亲和捕获(A ffinity capture).此种方法有许多变化,但其基本方法涉及到使用特异交联在亲和基质上的一个标签寡核苷酸(T agged olig o)来捕获理想的产物.如与目标cDNA序列互补的生物素化的olig o在溶液中与变性的cDNA杂交后,杂合体用Streptavidin亲和柱捕获,然后用适当条件洗脱除去非特异退火的杂合体.这样明显富积了的特异目的cDNA序列就从柱上洗脱下来,再用于PCR扩增.2.4.5　RACE产物的克隆一旦获得可以检测到的RACE产物,就必须进行纯化、回收和克隆.因为PCR产物在经酚Π氯仿抽提和乙醇沉淀的回收过程中,有相当大的损失[28],最好使用专门的试剂盒回收.纯化的产物可用适当的限制酶切割,在低熔点琼脂糖胶上电泳,直接连接到测序载体中.虽然有RACE产物直接用于测序的报道[9],但由于有替代的转录起始位点[11,16]和反转录酶合成的第一链cDNA的3′2末端有非模板指491 生　命　科　学　研　究 2003年。

RACE(rapid-amplificationofcDNAends)是通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术。

cDNA完整序列的获得对基因结构、蛋白质表达、基因功能的研究至关重要。

完整的cDNA序列可以通过文库的筛选和末端克隆技术获得。

末端克隆技术是20世纪80年代发展起来的。

编辑本段优点与筛库法相比较，有许多方面的优点1）此方法是通过PCR技术实现的，无须建立cDNA文库，可以在很短的时间内获得有利用价值的信息。

2）节约了实验所花费的经费和时间。

3）只要引物设计正确，在初级产物的基础上可以获得大量的感兴趣基因的全长。

实验室现有的RACE试剂盒的简介RACE是一种从一个相同的cDNA模板进行5‘和3‘末端快速克隆的方法。

此方法会产生较少的错误条带。

此过程中使用的酶混合物非常适合长链PCR。

用此方法的要求是必须知道至少23－28个核苷酸序列信息，以此来设计5’末端和3‘末端RACE反应的基因特异性引物（GSPs）。

编辑本段引物的设计基因特异性引物（GSPs）应该是：23－28nt50－70％GCTm值≥65度，Tm值≥70度可以获得好的结果需要实验者根据已有的基因序列设计5‘和3‘RACE 反应的基因特异性引物（GSP1和GSP2).由于两个引物的存在，PCR的产物是特异性的。

编辑本段反应中涉及到的一些事项cDNA的合成起始于polyA+RNA。

如果使用其它的基因组DNA或总RNA，背景会很高。

RACEPCR的效率还取决于总的mRNA中目的mRNA的量和不同的引物有不同的退火和延伸温度。

进行5‘和3’RACEPCR的时候应该使用热启动。

4中给出了所有引物的相互关系。

重叠引物的设计会对全长的产生有帮助。

另外，重叠的引物可以为PCR 反应提供一个对照。

并不是绝对的要利用设计的引物产生重叠片段。

物GSP中的GC含量要在50－70％之间。

这样可以使用降落PCR。

避免使用自身互补性的引物序列，否则会产生回折和形成分子内氢键。

RACE技术第一 RACE的简介目前,全长基因的获得是生物工程及分子生物学研究的一个重点。

尽管已经有多种方法可以获得基因的全长序列，但在很多生物研究中，由于所研究的目的基因丰度较低，从而使得由低丰度mRNA通过转录获得全长cDNA很困难。

近年来发展成熟的cDNA末端快速扩增(RACE)技术为从低丰度转录快速获得全长cDNA提供了一个便捷的途径。

cDNA 末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术是一种基于mRNA 反转录和PCR技术建立起来的、以部分的已知区域序列为起点,扩增基因转录本的未知区域,从而获得mRNA(cDNA)完整序列的方法。

简单的说就是一种从低丰度转录本中快速增长cDNA5’和cDNA3’末端，进而获得获得全长cDNA简单而有效的方法，该方法具有快捷、方便、高效等优点,可同时获得多个转录本。

因此近年来RACE技术已逐渐取代了经典的cDNA文库筛选技术,成为克隆全长cDNA序列的常用手段。

随着分子生物学技术的发展，科学家结合其他不同的分子生物学技术对最初的RACE 技术进行了改进，从而丰富了ＲＡＣＥ技术的类型。

目前使用的RACE技术包括：经典RACE、Adapter Ligated RACE、RLM-RACE、Cap-switching RACE、环形RACE、RAC-RACE和T-RACE等等，但没有一种RACE技术适合克隆所有类型的RNA。

因此，本文将通过介绍各种RACE技术的发展、原理及应用，比较认识各种RACE技术的优缺点，并对RACE的前景进行讨论。

第二RACE的原理1.经典RACERACE 是采用PCR 技术由已知的部分cDNA 顺序来扩增出完整cDNA5’和3’末端,是一种简便而有效的方法, 又被称为锚定PCR (anchoredPCR)和单边PCR(one2side PCR)。

①3’RACE的原理一)加入oligo(dT)17和反转录酶对mRNA进行反转录得到(-)cDNA；二)以oligo(dT)l7和一个35bp的接头(dT17-adaptor)为引物，其中在引物的接头中有一在基因组DNA中罕见的限制酶的酶切位点。

RACE技术的原理和操作点击次数：国1044 作者：yshu3507发表于：2009-10-23 13:55 转载请注明来自丁香园来源：丁香园近年来随着生物技术的不断发展，岀现了许多克隆新基因的方法和手段，如图谱克隆技术、转座子标签技术、mRNA差异显示技术二基因组减法技术以及cDNA文库筛选技术等。

但上述方法人多具有实验周期长、技术步骤烦琐且工作量大等特点。

cDNA末端快速扩增技术（rapid amplification of cDNA ends，RACE）是一种基于PCR从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5'和3'末端的有效方法，以其简单、快速、廉价等优势而受到越来越多的重视。

经典的RACE技术是由Frohman等（1988 ）发明的一项技术，主要通过RT-PCR技术由已知部分cDNA序列来得到完整的CDNA5'和3'端，包括单边PCR和锚定PCR。

该技术提出以来经过不断发展和完善，克服了早期技术步骤多、时间长、特异性差的缺点（ Frohman等，1995 : Schaefer，l995 : Chen， 1998 : Bespalova 等，1998 : Matz等11999 ）。

对传统 RACE技术的改进主要是引物设计及 RT-PCR技术的改进：改进之一是利用锁定引物（（lock docking primer ）合成第一链cDNA，即在oligo （ dT）引物的3'端引入两个简并的核苷酸【5'-Oligo （ dT）16-30MN-3'，M=A/G/C ； N=A/G/C/T】，使引物定位在 poly （A）尾的起始点，从而消除了在合成第一条cDNA链时oligo （dT）与poly （A）尾的任何部位的结合所带来的影响；改进之二是在5'端加尾时，采用poly （C），而不是poly （A ）;改进之三是采用RNa se H-莫洛尼氏鼠白血。

RACE的简介目前,全长基因的获得是生物工程及分子生物学研究的一个重点。

尽管已经有多种方法可以获得基因的全长序列，但在很多生物研究中，由于所研究的目的基因丰度较低，从而使得由低丰度mRNA通过转录获得全长cDNA很困难。

近年来发展成熟的cDNA末端快速扩增(RACE)技术为从低丰度转录快速获得全长 cDNA 提供了一个便捷的途径。

cDNA 末端快速扩增 (rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术是一种基于mRNA反转录和 PCR技术建立起来的、以部分的已知区域序列为起点,扩增基因转录本的未知区域,从而获得mRNA(cDNA)完整序列的方法。

简单的说就是一种从低丰度转录本中快速增长cDNA5’和cDNA3’末端，进而获得获得全长cDNA简单而有效的方法，该方法具有快捷、方便、高效等优点,可同时获得多个转录本。

因此近年来RACE技术已逐渐取代了经典的cDNA文库筛选技术,成为克隆全长cDNA序列的常用手段。

第二 RACE的原理RACE 是采用PCR 技术由已知的部分cDNA 顺序来扩增出完整cDNA5’和3’末端,是一种简便而有效的方法, 又被称为锚定 PCR (anchoredPCR)和单边PCR(one2side PCR)。

3’RACE的原理一)加入oligo(dT)17和反转录酶对mRNA进行反转录得到(-)cDNA；二)以oligo(dT)l7和一个35bp的接头(dT17-adaptor)为引物，其中在引物的接头中有一在基因组DNA中罕见的限制酶的酶切位点。

这样就在未知cDNA末端接上了一段特殊的接头序列。

再用一个基因特异性引物(3 amp)与少量第一链(-)cDNA退火并延伸，产生互补的第二链(+)cDNA。

三)利用3amp和接头引物进行PCR循环即可扩增得到cDNA双链。

扩增的特异性取决于3amp的碱基只与目的cDNA分子互补．而用接头引物来取代dT17一adaptor则可阻止长(dT)碱基引起的错配。

5’-race是一种用于鉴定RNA转录起始位点的实验技术，它可以帮助研究者确定基因的启动子区域和转录调控元件，对于理解基因表达调控机制具有重要意义。

本文将介绍5’-race的原理及其在实验中的应用。

一、什么是5’-race？5’-race是Rapid Amplification of cDNA Ends的缩写，翻译为cDNA末端快速扩增。

该技术最早由Frohman等人于1988年提出，并在随后的研究中不断完善和应用。

5’-race主要用于鉴定mRNA的5’端序列，揭示RNA的转录起始位置，并发现新的调控元件。

二、5’-race的原理1. 引物连接：5’-race首先通过连接一个短寡核苷酸引物到RNA的5’端，同时进行逆转录反应以合成cDNA。

这个引物称为内引物。

2. 增大cDNA：在反转录后，通过PCR技术进行cDNA的快速扩增，采用一个外引物和内引物的连接引物结合进行扩增。

3. 清除非特异产物：将PCR产物纯化后，对于其中非特异扩增的产物进行去除，留下特异的5’端cDNA。

4. 提取cDNA：将特异5’端cDNA变性后进行连接进行克隆。

5. 测序：对克隆产物测序，最终得到RNA的转录起始位点。

三、5’-race的应用1. 确定基因启动子区域：通过5’-race技术可以鉴定基因的转录起始位点，从而确定基因的启动子区域，帮助研究者进一步分析基因的转录调控机制。

2. 发现新的转录起始位点：对于未知基因或未知转录本，5’-race可以帮助研究者发现新的转录起始位点，进一步研究其功能及调控机制。

3. 肿瘤基因的研究：在肿瘤基因研究中，通过5’-race技术可以鉴定肿瘤相关基因的启动子区域和转录调控元件，对于肿瘤的发生和发展具有重要意义。

四、5’-race的优势与局限1. 优势：5’-race技术可以在较短的时间内鉴定RNA的转录起始位点，帮助研究者快速了解基因的转录调控机制。

2. 局限：5’-race技术对于RNA的质量和纯度要求较高，同时在设计引物和PCR条件优化上也需要一定的技术经验。

RACERACE(rapid-amplification ofcDNA ends)是通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术。

cDNA完整序列的获得对基因结构、蛋白质表达、基因功能的研究至关重要。

完整的cDNA 序列可以通过文库的筛选和末端克隆技术获得。

近年来随着生物技术的不断发展，出现了许多新基因的方法和手段，如图谱技术、转座子标签技术、mRNA差异显示技术二减法技术以及cDNA文库筛选技术等。

但上述方法人多具有实验周期长、技术步骤烦琐且工作量大等特点。

cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends, RACE)是一种基于PCR从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5'和3’末端的有效方法，以其简单、快速、廉价等优势而受到越来越多的重视。

经典的RACE技术是由Frohman等(1988)发明的一项技术，主要通过RT-PCR 技术由已知部分cDNA序列来得到完整的cDNA5’和3’端，包括单边PCR和锚定PC R。

该技术提出以来经过不断发展和完善，克服了早期技术步骤多、时间长、特异性差的缺点(Frohman等,1995:Schaefer,l995: Chen,1998: Bespalova等,1998: Matz 等11999)。

对传统RACE技术的改进主要是引物设计及RT-PCR技术的改进:改进之一是利用锁定引物((lock docking primer)合成第一链cDNA,即在oligo(dT)引物的3'端引入两个简并的核苷酸【5'-Oligo(dT)16_30MN-3', M=A/G/C;N=A/G/C/T】，使引物定位在poly(A)尾的起始点，从而消除了在合成第一条cDNA链时oligo(dT)与poly (A)尾的任何部位的结合所带来的影响;改进之二是在5‘端加尾时，采用poly(C)，而不是poly(A);改进之三是采用RNase H一莫洛尼氏鼠白血.病毒(MMLV)反转录酶或选择嗜热DNA聚合酶可能在高温h (60 度-70度)有效地逆转录mRNA，从而消除了5‘端由于高CC含量导致的mRNA 二级结构对逆转录的影响;改进之四是采用热启动PCR (hot start PCR)技术和降落PCR(touch down PCR)提高PCR反应的特异性。