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PCR扩增反应的操作第一节PCR扩增反应的基本原理一、聚合酶链式反应（PCR）的基本构成PCR是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组DNA）的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术，在分子生物学中有广泛的应用，包括用于DNA作图、DNA测序、分子系统遗传学等。
PCR基本原理是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3’末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。
在微量离心管中，加入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA 膜板、四种dNTP溶液、耐热Taq DNA聚合酶、Mg2+等。
反应时先将上述溶液加热，使模板DNA 在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火；再将温度升至合适温度，在Taq DNA聚合酶的催化下，以dNTP为原料，引物沿5’→3’方向延伸，形成新的DNA片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。
因此PCR循环过程为三部分构成：模板变性、引物退火、热稳定DNA聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成（见图）。
1．模板DNA的变性模板DNA加热到90~95℃时，双螺旋结构的氢键断裂，双链解开成为单链，称为DNA的变性，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。
变性温度与DNA中G-C含量有关，G-C间由三个氢键连接，而A-T间只有两个氢键相连，所以G-C含量较高的模板，其解链温度相对要高些。
故PCR 中DNA变性需要的温度和时间与模板DNA的二级结构的复杂性、G-C含量高低等均有关。
对于高G-C含量的模板DNA在实验中需添加一定量二甲基亚砜（DMSO），并且在PCR循环中起始阶段热变性温度可以采用97℃，时间适当延长，即所谓的热启动。
PCR扩增的原理和操作步骤PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种重要的分子生物学技术，通过扩增DNA片段，能在短时间内从极少量的DNA样本中大量产生目标DNA片段。
PCR的原理和操作步骤如下：PCR原理：PCR是通过逐渐增加的方式在体外复制DNA片段的技术，它包括三个步骤：变性、退火和延伸。
1. 变性（Denaturation）：将含有目标DNA的样本加热至94-96℃，使DNA双链解开，产生两个单链DNA。
2. 退火（Annealing）：将温度降至50-65℃，引入一对寡核苷酸引物/引模，它们在目标DNA的两个末端特异性结合。
引物的设计与目标DNA的序列互补。
其中的一段是在目标DNA序列的正向链上引物，另一段是在反向链上的引物。
3. 延伸（Extension）：将温度升至72℃，引入热稳定的DNA聚合酶，使其延伸引物，生成新的DNA链。
延伸的速度约为300-1000个碱基每分钟。
如此一来，经过一次PCR循环，两条由引物引导的DNA链将被复制一次，重复进行多次PCR循环，DNA量会呈指数增长。
PCR操作步骤：1.DNA模板制备：从细胞中提取DNA，常用方法有裂解法和酶切法。
通过这些方法获得的DNA片段可作为PCR的模板。
2.引物设计：根据所需扩增的DNA序列设计引物。
引物通常由15-30个核苷酸组成，选择引物时要注意避免二聚体形成和引物之间的副产物形成。
3.反应体系设置：将PCR反应液配置至PCR试管或96孔板中，反应体系一般包括PCR缓冲液、dNTPs、模板DNA、引物、Mg2+离子和聚合酶等成分。
4.PCR循环程序：通常包括初步变性程序、循环变性程序和末端延伸程序。
初步变性程序为94-96℃，1-3分钟；循环变性程序为94-96℃，10-30秒；退火温度为50-65℃，20-60秒；延伸温度为72℃，20-60秒，延伸时间根据目标片段的长度确定，每一循环的延伸时间通常为片段长度的1-2秒。
pcr扩增的原理和步骤
PCR（聚合酶链反应）是一种用于体外扩增DNA的技术，它能够通过特定的引物和DNA聚合酶实现目标DNA序列的大量复制，使得微量的DNA可以在短时间内得到足够多的复制产物。
PCR的原理可以概括为三个主要步骤：变性、引物结合和延伸。
第一步是变性，即将所需扩增的DNA样本加热至94-98°C，使其双链DNA变为两条单链DNA。
此步骤会破坏氢键，使DNA分子解聚，并暴露出目标序列。
第二步是引物结合，通过在变性的DNA溶液中加入两个特异性的引物。
这两个引物的设计是相互互补的，并且定向分别与目标DNA序列的起始和终止位点结合。
引物与目标序列结合后，温度降低至50-65°C，使引物与带有目标序列的DNA分子发生特异性的酵素结合。
第三步是延伸，即在引物结合的条件下，通过在37-75°C之间的适宜温度下加入DNA聚合酶和适宜的核苷酸三磷酸，使DNA聚合酶从引物的3'末端起始位置开始合成新的DNA链。
在延伸过程中，DNA聚合酶沿着DNA模板链朝着反向方向进行复制，并合成与模板链互补的新链。
以上三个步骤构成了PCR扩增的基本过程，通过不断循环这三个步骤，可以使得目标DNA序列不断复制，并得到大量的
扩增产物。
每个PCR周期将使目标序列的数量成倍增加，因此，经过若干个PCR周期后，可以得到足够多的扩增产物用于后续的分析和应用。
PCR原理及操作PCR（聚合酶链反应）是一种在分子生物学领域被广泛应用的技术，用于从DNA样本中扩增特定的DNA片段。
PCR的原理和操作是研究者进行分子生物学研究、基因检测和分析的关键。
PCR的原理：PCR的原理基于DNA的复制过程，它通过模拟DNA复制的三个步骤（变性、退火和延伸）来扩增特定的DNA片段。
1. 变性（Denaturation）：在PCR反应开始时，将DNA加热至94-98°C的高温，使双链DNA分离成两条单链模板。
2. 退火（Annealing）：降低温度至50-65°C，引入特定引物（寡核苷酸），它们能够与目标DNA的特定序列互补碱基配对。
这些引物作为反向互补物，将与目标DNA的两个单链末端的互补序列碱基配对。
3. 延伸（Extension）：在72°C下，加入DNA聚合酶，它能够在引物的协助下将新的DNA链合成。
聚合酶沿着两条单链模板移动，在每个模板上合成新的DNA链。
该过程在一定的温度和时间下进行，使DNA聚合酶能够在引物上扩增DNA。
上述循环会重复数十次，通过指数式扩增目标DNA的数量。
最终，PCR反应产生了大量的目标DNA序列，可以用于进一步的分析和研究。
PCR的操作：PCR的操作依赖于精确的试剂配制、合适的温度控制和合理的反应设计。
以下是PCR的基本操作步骤：1.DNA提取：首先，从样本中提取DNA。
提取方法可以根据样本类型的不同而有所区别。
2.PCR体系的配制：根据需要扩增的目标DNA片段确定引物的序列和浓度，准备合适的引物。
然后将引物和其他反应物如核苷酸、聚合酶和缓冲液等加入反应体系中。
3.PCR反应设置：将反应体系分装到PCR管或特定的聚合酶链反应管中，并在热循环仪中设置适当的温度和时间参数。
4.PCR循环参数：一般来说，PCR反应由多个循环组成。
每个循环通常包括变性、退火和延伸阶段。
循环参数的设置可以根据需要和特定的PCR试剂进行调整。
pcr扩增的原理和步骤PCR扩增的原理和步骤。
PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种重要的分子生物学技术，它可以在体外迅速复制DNA片段，使之成倍增加。
PCR技术的发明为分子生物学、医学诊断和法医学等领域的研究提供了重要工具。
本文将介绍PCR扩增的原理和步骤。
一、PCR扩增的原理。
PCR扩增的原理是通过DNA聚合酶酶的作用，将DNA片段在体外进行反复的复制，从而实现DNA的倍增。
PCR扩增主要包括三个步骤，变性、退火和延伸。
1. 变性。
PCR反应开始时，将待扩增的DNA双链解旋成两条单链。
这一步需要高温（通常为94-98摄氏度）来打开DNA双链，使之变性成两条单链。
2. 退火。
在变性后，降温使引物与目标DNA序列结合。
引物是一小段与待扩增DNA序列互补的寡聚核苷酸链，它们分别结合到目标DNA序列的两端。
这一步通常在50-65摄氏度进行。
3. 延伸。
在退火后，DNA聚合酶开始在引物的引导下合成新的DNA链。
它从引物的3'端开始合成DNA链，向引物的5'端延伸。
这一步需要适当的温度（通常为72摄氏度）和四种脱氧核苷酸（dNTPs）。
通过不断重复这三个步骤，可以在较短的时间内获得数以百万计的DNA片段。
二、PCR扩增的步骤。
PCR扩增的具体步骤如下：1. 反应体系的准备。
首先需要准备PCR反应体系，包括目标DNA模板、引物、DNA聚合酶、dNTPs、缓冲液和辅助物质。
将这些成分按照一定比例混合均匀，制备PCR反应液。
2. 变性。
将PCR反应液放入PCR仪中，进行变性步骤。
一般情况下，变性温度为94-98摄氏度，时间约为1-3分钟。
3. 退火。
变性后，将温度降至50-65摄氏度，使引物与目标DNA序列结合。
这一步通常持续30秒至1分钟。
4. 延伸。
在退火后，将温度升至72摄氏度，开始DNA聚合酶的延伸作用。
延伸时间的长短取决于所扩增DNA片段的长度，通常为1-2分钟。
PCR扩增的原理与操作步骤PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，用于在体外扩增特定的DNA片段。
PCR技术的应用非常广泛，包括基因克隆、基因突变分析、DNA测序等众多领域。
1. 变性（Denaturation）：在变性步骤中，将DNA样品加热至95°C，使DNA双链解开，生成两条单链DNA模板。
2. 退火（Annealing）：将温度降低至50-65°C，引物与模板DNA 进行互补配对。
引物是根据扩增片段的序列设计的，它能够与模板DNA的两侧互补区域形成氢键。
3. 延伸（Extension）：将温度升高至72°C，添加DNA聚合酶酶（一般使用Taq聚合酶），开始合成新的DNA链。
聚合酶以5'到3'方向在引物上作用，延伸DNA链，合成与模板DNA互补的新链。
此步骤形成了两条新的DNA双链。
1.准备反应混合液：将PCR反应所需的试剂按照表格中的比例加入酶标管或PCR管中。
反应混合液主要包括DNA模板、引物、酶、缓冲液和dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸盐）。
2.加热变性：将反应混合液放入热冷热循环仪或PCR仪中升温至95°C，使DNA双链解开。
3.退火：将温度降低至引物的退火温度，通常为50-65°C。
此步骤使引物与模板DNA的互补区域结合。
4. 延伸：将温度升高至72°C，添加DNA聚合酶酶（Taq聚合酶）和dNTPs，开始合成新的DNA链。
5.循环反应：重复2-4步骤的多轮循环。
每一轮循环会使DNA片段数量指数级增加。
6.终止反应：最后一轮循环结束后，将PCR反应管温度降至冷却状态，终止反应。
可以将PCR产物保存在低温下，或继续进行下一步实验。
需要注意的是，PCR扩增的实验条件因不同的实验目的和DNA片段而有所不同。
如引物的设计需要根据具体的扩增序列设计，反应条件的时间和温度也需要根据扩增片段的长度和GC含量进行调整。
PCR扩增的原理和操作步骤PCR（聚合酶链式反应）是一种广泛应用于生物学研究和基因工程领域的技术，它能在体外复制目标DNA段，并在短时间内扩增出大量的目标DNA。
本文将详细介绍PCR扩增的原理和操作步骤。
一、PCR扩增的原理PCR扩增是通过DNA聚合酶的酶活性，在体外模拟DNA的复制过程，快速合成大量特定序列的方法。
其原理包括三个主要步骤：变性、引物结合和延伸。
1.1 变性PCR反应开始时，将待扩增模板DNA加热至95℃，使其发生变性，将DNA双链解开成两条单链。
该步骤使DNA变得单链化，为后续的引物结合和DNA合成提供条件。
1.2 引物结合通过降低反应温度至40-60℃，使引物与DNA单链结合。
引物是两个互补的寡核苷酸序列，在扩增过程中所选择的引物，将确定扩增的目标DNA段。
引物与目标DNA序列互补结合，形成引物／DNA复合物。
1.3 延伸升高反应温度至72℃，加入热稳定的DNA聚合酶，启动延伸步骤。
DNA聚合酶以引物为起始点，向延伸方向沿着模板DNA链合成互补的新DNA链。
此步骤的重复进行，将目标DNA段扩增为大量的复制产物。
二、PCR扩增的操作步骤2.1 材料准备准备PCR反应体系所需的试剂和设备，包括DNA样品、引物、酶、缓冲液、dNTPs、镁离子、试管、PCR仪等。
2.2 PCR反应体系的配置根据需要扩增的目标DNA片段的大小和特点，选择适当的引物浓度和配比。
一般情况下，将试管中的反应体系按以下顺序依次配制：缓冲液、dNTPs、MgCl2、引物、DNA模板、聚合酶、去离子水。
2.3 反应条件设置设置PCR反应条件，包括退火温度、延伸时间等。
这些参数的设定与目标DNA的GC含量、长度等相关。
2.4 PCR反应的进行将装有反应体系的试管放入PCR仪中，根据所设定的程序进行PCR扩增反应。
一般情况下，PCR反应包括预变性（变性阶段）、循环扩增（引物结合和延伸阶段）和最终延伸。
2.5 PCR产物分析将PCR反应体系取出，利用琼脂糖凝胶电泳等方法进行PCR产物的分析。
PCR扩增的原理和操作步骤PCR（polymerase chain reaction）是一种体外合成DNA的方法，能够迅速、高效地扩增特定DNA片段。
PCR广泛应用于基因工程、医学诊断、犯罪侦破等领域，其原理和操作步骤如下：一、PCR扩增的原理：PCR的主要步骤包括三个温度区间：变性（Denaturation）、退火（Annealing）和延伸（Extension）。
1. 变性（Denaturation）：PCR反应开始时，将含有所需DNA模板的反应液加热至95℃，使DNA的两条链解开，此过程称为变性。
在此过程中，DNA双链断裂，成为单链，失去了互补配对的能力。
2. 退火（Annealing）：将反应液降温至合适的温度，引物与目标DNA的互补序列进行特异性结合。
引物（primer）是一小段能够与目标序列互补配对的DNA序列，分别位于所需片段的两侧。
此引物具有互补配对能力，可稳定结合目标序列，防止在扩增过程中扩增非目标序列。
3. 延伸（Extension）：在引物的选择性作用下，加入DNA聚合酶，使其在适宜的温度下从引物的5'端延伸，合成互补链。
采用热稳定性的DNA聚合酶（如Taq DNA聚合酶），能够在较高温度下稳定工作。
通过循环进行上述三个步骤，每一个循环成功，将产生一个DNA双链，再通过新一轮的变性、退火和延伸，不断重复多次循环，扩增出大量目标DNA片段。
二、PCR扩增的操作步骤：1.DNA提取与纯化：首先，从待扩增的样品中提取出DNA，并净化以去除杂质和抑制物。
可以使用DNA提取试剂盒或手工方法进行提取。
2.引物设计与合成：选择适当的引物是PCR扩增的关键。
引物应与目标DNA序列互补配对，并应具备一些额外特性，如熔点适宜、长度适中等。
引物的设计可参考已知序列，也可使用生物信息学工具进行设计。
3.PCR反应体系准备：按照PCR反应所需的组成物质，准备PCR反应液。
主要包括目标DNA模板、引物、dNTP（脱氧核苷酸三磷酸酯）、Mg2+（镁离子）、缓冲液和DNA聚合酶等。
PCR扩增的原理和操作步骤PCR（聚合酶链式反应）是一种在体外复制DNA片段的技术，它通过不断重复的循环反应，使得目标DNA片段在体外得以扩增。
PCR扩增技术已经被广泛应用于基因组学研究、疾病诊断、法医学鉴定等领域。
本文将详细介绍PCR扩增的原理和操作步骤。
一、PCR扩增的原理PCR扩增的原理基于DNA的复制机制，通过模拟细胞内的DNA复制过程，实现对特定DNA片段的快速扩增。
PCR反应涉及三个主要步骤：变性、引物结合和延伸。
1. 变性（Denaturation）：在PCR反应开始时，将反应体系中的DNA双链分离为两条单链，这一步骤通常在94-98℃的高温下进行，以破坏氢键，使DNA双链解开。
2. 引物结合（Annealing）：在变性步骤后，反应体系降温至50-65℃，使引物与目标DNA序列的互补区域结合。
引物是一对短的DNA片段，它们分别位于目标DNA序列的两端，并确定了PCR扩增的起始和终止点。
3. 延伸（Extension）：在引物结合的温度下，加入DNA聚合酶（如Taq聚合酶）和四种脱氧核苷酸（dNTPs），使DNA聚合酶沿着目标DNA序列的互补链合成新的DNA链。
温度一般在72℃左右，这是DNA聚合酶的最佳工作温度。
通过以上三个步骤的循环反应，每一轮PCR反应都会使目标DNA片段的数量翻倍，从而实现了DNA的快速扩增。
二、PCR扩增的操作步骤PCR扩增的操作步骤通常包括实验准备、反应体系配置、PCR反应、PCR产物分析等。
1. 实验准备（1）准备目标DNA样本：从待扩增的样品中提取DNA，可以使用商业DNA提取试剂盒或自制方法。
（2）设计引物：根据目标DNA序列设计引物，确保引物的互补区域与目标序列的两端匹配。
（3）准备PCR反应管：选择合适的PCR反应管和盖子，确保反应体系的完整性。
（4）准备PCR仪：设置PCR仪的温度程序和反应时间。
2. 反应体系配置根据所使用的PCR试剂盒的说明书，配置PCR反应体系。
PCR扩增反应的操作第一节PCR扩增反应的基本原理一、聚合酶链式反应（PCR）的基本构成PCR是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组DNA）的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术，在分子生物学中有广泛的应用，包括用于DNA作图、DNA测序、分子系统遗传学等。
PCR基本原理是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3’末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。
在微量离心管中，加入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA 膜板、四种dNTP溶液、耐热Taq DNA聚合酶、Mg2+等。
反应时先将上述溶液加热，使模板DNA 在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火；再将温度升至合适温度，在Taq DNA聚合酶的催化下，以dNTP为原料，引物沿5’→3’方向延伸，形成新的DNA片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。
因此PCR循环过程为三部分构成：模板变性、引物退火、热稳定DNA聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成（见图）。
1．模板DNA的变性模板DNA加热到90~95℃时，双螺旋结构的氢键断裂，双链解开成为单链，称为DNA的变性，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。
变性温度与DNA中G-C含量有关，G-C间由三个氢键连接，而A-T间只有两个氢键相连，所以G-C含量较高的模板，其解链温度相对要高些。
故PCR 中DNA变性需要的温度和时间与模板DNA的二级结构的复杂性、G-C含量高低等均有关。
对于高G-C含量的模板DNA在实验中需添加一定量二甲基亚砜（DMSO），并且在PCR循环中起始阶段热变性温度可以采用97℃，时间适当延长，即所谓的热启动。
2．模板DNA与引物的退火将反应混合物温度降低至37~65℃时，寡核苷酸引物与单链模板杂交，形成DNA模板-引物复合物。
退火所需要的温度和时间取决于引物与靶序列的同源性程度及寡核苷酸的碱基组成。
一般要求引物的浓度大大高于模板DNA的浓度，并由于引物的长度显著短于模板的长度，因此在退火时，引物与模板中的互补序列的配对速度比模板之间重新配对成双链的速度要快得多，退火时间一般为1～2min。
3．引物的延伸DNA模板-引物复合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条与模板DNA链互补的新链。
重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
延伸所需要的时间取决于模板DNA的长度。
在72℃条件下，Taq DNA聚合酶催化的合成速度大约为40～60个碱基/秒。
经过一轮“变性-退火-延伸”循环，模板拷贝数增加了一倍。
在以后的循环中，新合成的DNA都可以起模板作用，因此每一轮循环以后，DNA拷贝数就增加一倍。
每完成一个循环需2～4min，一次PCR经过30～40次循环，约2～3h。
扩增初期，扩增的量呈直线上升，但是当引物、模板、聚合酶达到一定比值时，酶的催化反应趋于饱和，便出现所谓的“平台效应”，即靶DNA产物的浓度不再增加。
PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。
反应最终的DNA扩增量可用Y ＝（1＋X）n计算。
Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平（Y）均每次的扩增效率，n代表循环次数。
平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。
反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。
大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。
PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。
短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5'端之间，是需要扩增的特定片段。
短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3'端开始延伸，其5'端是固定的，3'端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。
进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链（即“长产物片段”）结合。
引物在与新链结合时，由于新链模板的5'端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3'端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。
不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计，这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。
图PCR的反应历程变性退火延伸二、PCR反应的五个元素参与PCR反应的物质主要为五种：引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。
1．引物引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。
理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
引物设计有3条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应（即错配）。
引物的选择将决定PCR产物的大小、位置、以及扩增区域的Tm值这个和扩增物产量有关的重要物理参数。
好的引物设计可以避免背景和非特异产物的产生，甚至在RNA-PCR中也能识别cDNA或基因组模板。
引物设计也极大的影响扩增产量：若使用设计粗糙的引物，产物将很少甚至没有；而使用正确设计的引物得到的产物量可接近于反应指数期的产量理论值。
当然，即使有了好的引物，依然需要进行反应条件的优化，比如调整Mg2+浓度，使用特殊的共溶剂如二甲基亚砜、甲酰胺和甘油。
对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。
（1）引物长度PCR特异性一般通过引物长度和退火温度来控制。
引物的长度一般为15-30bp，常用的是18～27bp，但不应大于38bp。
引物过短时会造成Tm值过低，在酶反应温度时不能与模板很好的配对；引物过长时又会造成Tm值过高，超过酶反应的最适温度，还会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应，而且合成长引物还会大大增加合成费用。
（2）引物碱基构成引物的G+C含量以40～60%为宜，过高或过低都不利于引发反应，上下游引物的GC含量不能相差太大。
其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值5～10℃。
若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55～80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。
引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。
尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。
（3）引物二级结构引物二级结构包括引物自身二聚体、发卡结构、引物间二聚体等。
这些因素会影响引物和模板的结合从而影响引物效率。
对于引物的3’末端形成的二聚体，应控制其ΔG大于-5.0 kcal/mol或少于三个连续的碱基互补，因为此种情形的引物二聚体有进一步形成更稳定结构的可能性，引物中间或5’端的要求可适当放宽。
引物自身形成的发卡结构，也以3’端或近3’端对引物-模板结合影响更大；影响发卡结构的稳定性的因素除了碱基互补配对的键能之外，与茎环结构形式亦有很大的关系。
应尽量避免3’末端有发卡结构的引物。
（4）引物3’端序列引物3’末端和模板的碱基完全配对对于获得好的结果是非常重要的，而引物3’末端最后5到6个核苷酸的错配应尽可能的少。
如果3’末端的错配过多，通过降低反应的退火温度来补偿这种错配不会有什么效果，反应几乎注定要失败。
引物3’末端的另一个问题是防止一对引物内的同源性。
应特别注意引物不能互补，尤其是在3’末端。
引物间的互补将导致不想要的引物双链体的出现，这样获得的PCR产物其实是引物自身的扩增。
这将会在引物双链体产物和天然模板之间产生竞争PCR状态，从而影响扩增成功。
引物3’末端的稳定性由引物3’末端的碱基组成决定，一般考虑末端5个碱基的ΔG。
∆G值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，此值的大小对扩增有较大的影响。
应当选用3’端∆G值较低（绝对值不超过9），负值大，则3’末端稳定性高，扩增效率更高。
引物的3’端的∆G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。
需要注意的是，如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。
另外末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。
（5）引物的5′端引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。
因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。
引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。
对于引入一至两个酶切位点，应在后续方案设计完毕后确定，便于后期的克隆实验，特别是在用于表达研究的目的基因的克隆工作中。
（6）引物的特异性引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源，特别是与待扩增的模板DNA之间要没有明显的相似序列。
2．酶及其浓度Taq DNA多聚酶是耐热DNA聚合酶，是从水生栖热菌（Thermus aquaticus）中分离的。
Taq DNA 聚合酶是一个单亚基，分子量为94 000 Da。
具有5’-->3的聚合酶活力，5’-->3’的外切核酸酶活力，无3’-->5’的外切核酸酶活力，会在3’末端不依赖模板加入1个脱氧核苷酸（通常为A，故PCR产物克隆中有与之匹配的T载体），在体外实验中，Taq DNA聚合酶的出错率为10-4～10-5。
此酶的发现使PCR广泛的被应用。
此酶具有以下特点：（1）耐高温，在70℃下反应2小时后其残留活性在90%以上，在93℃下反应2小时后其残留活性是仍能保持60%，而在95℃下反应2小时后为原来的40%。
（2）在热变性时不会被钝化，故不必在扩增反应的每轮循环完成后再加新酶。
