蛋白质共价结构

蛋⽩质的⼀级结构共价结构蛋⽩质的⼀级结构（共价结构）蛋⽩质的⼀级结构也称共价结构、主链结构。

蛋⽩质结构层次⼀级结构（氨基酸顺序、共价结构、主链结构）↓是指蛋⽩质分⼦中氨基酸残基的排列顺序⼆级结构↓超⼆级结构↓构象（⾼级结构）结构域↓三级结构(球状结构)↓四级结构(多亚基聚集体)⼀级结构的要点．蛋⽩质测序的⼀般步骤祥见 P116（1）测定蛋⽩质分⼦中多肽链的数⽬。

（2）拆分蛋⽩质分⼦中的多肽链。

（3）测定多肽链的氨基酸组成。

（4）断裂链内⼆硫键。

（5）分析多肽链的N末端和C末端。

（6）多肽链部分裂解成肽段。

（7）测定各个肽段的氨基酸顺序（8）确定肽段在多肽链中的顺序。

（9）确定多肽链中⼆硫键的位置。

蛋⽩质测序的基本策略对于⼀个纯蛋⽩质，理想⽅法是从N端直接测⾄C端，但⽬前只能测60个N端氨基酸。

直接法（测蛋⽩质的序列）两种以上特异性裂解法N C A 法裂解 A1 A2 A3 A4 B 法裂解 B1 B2 B3 B4⽤两种不同的裂解⽅法，产⽣两组切点不同的肽段，分离纯化每⼀个肽段，分离测定两个肽段的氨基酸序列，拼接成⼀条完整的肽链。

间接法（测核酸序列推断氨基酸序列）核酸测序，⼀次可测600-800bp 测序前的准备⼯作蛋⽩质的纯度鉴定纯度要求，97%以上，且均⼀，纯度鉴定⽅法。

（两种以上才可靠）⑴聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)要求⼀条带⑵DNS —cl （⼆甲氨基萘磺酰氯）法测N 端氨基酸测定分⼦量⽤于估算氨基酸残基n=⽅法：凝胶过滤法、沉降系数法确定亚基种类及数⽬多亚基蛋⽩的亚基间有两种结合⽅式：⑴⾮共价键结合8mol/L 尿素，SDS SDS-PAGE 测分⼦量⑵⼆硫键结合过甲酸氧化：—S —S —+HCOOOH → SO 3H β巯基⼄醇还原：举例:：⾎红蛋⽩ (α2β2)（注意，⼈的⾎红蛋⽩α和β的N 端相同。

）分⼦量： M拆亚基： M 1 、M 2 两条带拆⼆硫键： M 1 、M 2 两条带分⼦量关系： M = 2M 1 + 2M 2 测定氨基酸组成主要是酸⽔解，同时辅以碱⽔解。

蛋白质的共价结构蛋白质分子是由一条或多条肽链构成的生物大分子。

多肽链是由氨基酸通过肽键共价连接而成的，各种多肽链都有自己特定的氨基酸序列。

蛋白质的相对分子质量介于6000到1000000或更高。

蛋白质分为两大类：单纯蛋白质和缀合蛋白质。

根据分子形状可分为纤维状蛋白质、球状蛋白质和膜蛋白质。

此外还可按蛋白质的生物学功能分类。

为了表示蛋白质结构的不同组织层次，经常使用一级结构、二级结构、三级结构和四级结构这样一些专门术语。

一级结构就是共价主链的氨基酸序列，有时也称化学结构。

二、三和四级结构又称空间结构（即三维结构）或高级结构。

蛋白质的生物功能决定于它的高级结构，高级结构是由一级结构即氨基酸序列决定的，二氨基酸序列是由遗传物质DNA的核苷酸序列规定的。

肽键（CO—NH）是连接多肽链主链中氨基酸残缺的共价键，二硫键是使多肽链之间交联或使多肽链成环的共价键。

多肽链或蛋白质当发生部分水解时，可形成长短不一的肽段。

除部分水解可以产生小肽之外，生物界还存在许多游离的小肽，如谷胱甘肽等。

小肽晶体的熔点都很高，这说明短肽的晶体是离子晶格、在水溶液中也是以偶极离子存在的。

测定蛋白质一级结构的策略是：（1）测定蛋白质分子中多肽链数目；（2）拆分蛋白质分子的多肽链；（3）断开多肽链内的二硫桥；（4）分析每一多肽链的氨基酸组成；（5）鉴定多肽链的N-末端和C-末端残基；（6）断裂多肽链成较小的肽段，并将它们分离开来；（7）测定各肽段的氨基酸序列；（8）利用重叠肽重建完整多肽链的一级结构；（9）确定半胱氨酸残基形成的S-S交联桥的位置。

序列分析中的重要方法和技术有：测定N-末端基的苯异硫氰酸酯（PITC）法，分析C-末端基的羧肽酶法，用于多肽链局部断裂的酶裂解和Br化学裂解，断裂二硫桥的巯基乙醇处理，测定肽段氨基酸序列的Edman化学降解和电喷射串联质谱技术，重建多肽链一级序列的重叠肽拼凑法以及用于二硫桥定位的对角线电泳等。

蛋白质的共价结构与三维结构一、相关概念蛋白质一级结构：指蛋白质中共价连接的氨基酸残基的排列顺序。

蛋白质二级结构在蛋白质分子中的局布区域内氨基酸残基的有规则的排列。

常见的有二级结构有α-螺旋和β-折叠。

二级结构是通过骨架上的羰基和酰胺基团之间形成的氢键维持的。

蛋白质三级结构: 蛋白质分子处于它的天然折叠状态的三维构象。

三级结构是在二级结构的基础上进一步盘绕，折叠形成的。

三级结构主要是靠氨基酸侧链之间的疏水相互作用，氢键，范德华力和盐键维持的。

凝胶过滤层析：也叫做分子排阻层析。

一种利用带孔凝胶珠作基质，按照分子大小分离蛋白质或其它分子混合物的层析技术。

二、化学组成与分类蛋白质平均含氮量为16%，蛋白含量=蛋白氮*6.25蛋白质的分类：可按单纯蛋白、缀合蛋白、生物学功能分类蛋白质生物功能多样性：催化、调节、转运、贮存、运动、结构成分、支架作用、防御和进攻、异常功能。

三、肽肽的物理化学性质：肽的化学反应和氨基酸的一致。

N端的氨基酸残基也可以与茚三酮反应，这一反应可用于肽的定性和定量测定。

双缩脲反应是肽和蛋白质特有的，氨基酸没有此反应。

一般含有两个或两个以上肽键的化合物与CuSO4碱性溶液都能发生双缩脲反应，生成紫红色或蓝紫色的络合物，利用这个反应可以用分光光度法（540nm）测定蛋白质的含量。

四、蛋白质的结构一级结构的测定1、N-端测定二硝基氟苯法（DNFB法）：用DNFB（Sanger试剂）与肽链N末端的氨基反应，生成DNP－多肽或DNP－蛋白质。

然后水解肽链，分离得到DNP－氨基酸，纸层析、薄层层析或HPLC分离鉴定。

丹磺酰氯法（DNS法）：与DNFB法类似，由于丹磺酰氯有强烈荧光，灵敏度比DNFB法高100倍。

苯异硫氰酸酯法（Edman降解法）：肽链与PITC（Edman试剂）反应生成PTC－多肽（苯氨基硫甲酰多肽）或PTC－蛋白质，在酸性有机溶剂中加热时，N末端的PTC－氨基酸发生环化，生成苯乙内酰硫脲的衍生物（PTH－氨基酸）并从肽链上脱落下来，除去N末端氨基酸后剩下的肽链仍然是完整的。

一、蛋白质的一级结构（Primary structure）又称为共价结构或化学结构。

它是指蛋白质中的氨基酸依照特定的排列顺序通过肽键连接起来的多肽链结构。

肽键：一个氨基酸的α-COOH 和相邻的另一个氨基酸的α-NH2脱水形成共价键。

1)组成肽链的氨基酸已残缺不全，称为氨基酸残基；2)肽链中的氨基酸的排列顺序，一样-NH2端开始，由N指向C，即多肽链有方向性，N端为头，C端为尾。

肽的颜色反映: 多肽可与多种化合物作用，产生不同的颜色反映。

这些显色反映，可用于多肽的定性或定量鉴定。

如黄色反映，是由硝酸与氨基酸的苯基（酪氨酸和苯丙氨酸）反映生成二硝基苯衍生物而显黄色。

多肽的双缩脲反映是多肽特有的颜色反映;双缩脲是两分子的尿素经加热失去一分子NH3而取得的产物。

双缩脲能够与碱性硫酸铜作用，产生兰色的铜-双缩脲络合物，称为双缩脲反映。

含有两个以上肽键的多肽，具有与双缩脲相似的结构特点，也能发生双缩脲反映，生成紫红色或蓝紫色络合物。

这是多肽定量测定的重要反映.（二）天然活性肽1.谷胱甘肽（GSH）：三肽（Glu-Cys-Gly），谷氨酸-半胱氨酸-甘氨酸普遍存在于生物细胞中，含有自由的-SH，具有很强的还原性，可作为体内重要的还原剂，爱惜某些蛋白质或酶分子中的巯基免遭氧化，使其处于活性状态。

2.促甲状腺素释放激素：三肽（焦谷氨酰组氨酰脯氨酸），可增进甲状腺素的释放。

3.短杆菌素S：环十肽，含有D-苯丙氨酸、鸟氨酸，对革兰氏阴性细菌有破坏作用，要紧作用于细胞膜。

4.青霉素：含有D—半胱氨酸和D—缬氨酸的二肽衍生物。

要紧破坏细菌的细胞壁粘肽的合成引发溶菌。

蛋白质的结构蛋白质是由一条或多条多肽(polypeptide)链以特殊方式结合而成的生物大分子。

蛋白质与多肽并无严格的界限，一般是将分子量在6000道尔顿以上的多肽称为蛋白质。

蛋白质分子量转变范围专门大, 从大约6000到1000000道尔顿乃至更大。

一、蛋白质的一级结构p1681. 概念—— 1969年，国际纯化学与应用化学委员会（IUPAC）规定：蛋白质的一级结构指蛋白质多肽连中AA的排列顺序，包括二硫键的位置。