解析中和法在微生物限度检查中的应用

中和试验机体受到病毒感染后，体内产生特异性中和抗体，并与相应的病毒粒子呈现特异性结合，因而阻止病毒对敏感细胞的吸附，或抑制其侵入，使病毒失去感染能力。

中和试验 (Neutralization Test)是以测定病毒的感染力为基础，以比较病毒受免疫血清中和后的残存感染力为依据，来判定免疫血清中和病毒的能力。

中和试验常用的有两种方法：一种是固定病毒量与等量系列倍比稀释的血清混合，另一种是固定血清用量与等量系列对数稀释(即十倍递次稀释)的病毒混合；然后把血清－病毒混合物置适当的条件下感作一定时间后，接种于敏感细胞、鸡胚或动物，测定血清阻止病毒感染宿主的能力及其效价。

如果接种血清病毒混合物的宿主与对照(指仅接种病毒的宿主)一样地出现病变或死亡，说明血清中没有相应的中和抗体。

中和反应不仅能定性而且能定量，故中和试验可应用于1.病毒株的种型鉴定：中和试验具有较高的特异性，利用同一病毒的不同型的毒株或不同型标准血清，即可测知相应血清或病毒的型，所以，中和试验不但可以定属而且可以定型。

2.测定血清抗体效价：中和抗体出现于病毒感染的较早期，在体内的维持时间较长。

动物体内中和抗体水平的高低，可显示动物抵抗病毒的能力。

3.分析病毒的抗原性。

毒素和抗毒素亦可进行中和试验，其方法与病毒中和试验基本相同。

用组织细胞进行中和试验，有常量法和微量法两种，因微量法简便，结果易于判定，适于作大批量试验，所以近来得到了广泛的应用。

(一) 定血清－稀释病毒法(病毒中和试验)1.病毒毒价的测定毒价单位：衡量病毒毒价(毒力)的单位过去多用最小致死量(MLD)，即经规定的途径，以不同的剂量接种试验动物，在一定时间内能致全组试验动物死亡的最小剂量。

但由于剂量的递增与死亡率递增不呈线性关系，在越接近100％死亡时，对剂量的递增越不敏感。

而一般在死亡率越接近50％时，对剂量的变化越敏感，故现多改用半数致死量(LD50)作为毒价测定单位，即经规定的途径，以不同的剂量接种试验动物，在一定时间内能致半数试验动物死亡的剂量。

《中国药典》2005年版微生物限度检查的方法学验证微生物限度检查的范围根据药品使用要求,把药品化为两大类:(1) 规定灭菌药品:(2) 非规定灭菌药品:在非灭菌的各种制剂中,对每克或每毫升的药品按剂型或品种不同规定(1)染菌量检查:包括细菌数,霉菌数及酵母菌数测定,以检查这几类微生物对药品的污染程度.(2) 控制菌检查:包括大肠埃希菌,大肠菌群，沙门菌,金黄色葡萄球菌及铜绿假单孢菌,生孢羧菌及白色念珠菌.药品微生物限度检验中的困难,最根本的原因在于检验对象本身的特殊性.(1) 不确定性:(2) 分布的不均匀性:(3)活体特征:药典中以活的微生物作为检验对象也是独特特性.验证的目的确认所采用的方法适合于供试品的微生物限度检查,即确认供试品在该检验量、该检验条件下无抑菌活性或其抑菌活性以已被充分消除到可以忽略不计。

保证检验结果的准确、可靠及检验方法的完整性。

验证的类型（1）建立药品的微生物限度检查法时。

（2）修订的检验方法。

（3）供试品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时。

（4）定期的验证。

（5）同一产品不同批次、不同企业生产的同一产品。

当建立药品的微生物限度检查方法时，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数的方法学验证，以确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌数的测定。

验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所规定的方法及下列要求进行，对各试验菌的回收率逐一进行验证。

微生物限度检查样品（1）首先应是合格的样品。

（2）本底微生物太多可以先灭活，但不应因此影响药效。

供试液的制备制剂形式多样，决定前处理各异1.液体供试品取供试品溶液10ml,加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml,混匀作为1:10的供试液.油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀.水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液.2.固体、半固体或粘稠性供试品取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml,混匀作为1:10的供试液.必要时加入适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀.增订：3.需要特殊供试液制备方法的供试品（1）非水溶性供试品（2）非水溶性膜剂供试品二部未变动，化学药膜剂取100cm2，剪碎，加100ml pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液，浸泡，振摇，作供试液。

中和稀释法在食品微生物检验中的应用探讨中和稀释法在食品微生物检验中的应用探讨摘要：中和稀释法是一种常用的微生物计数方法。

本文介绍了中和稀释法的原理、方法、注意事项以及在食品微生物检验中的应用，分析了该方法的优缺点及应用前景，旨在提高食品微生物检验的准确性和可靠性。

关键词：中和稀释法、微生物计数、食品安全、检测方法一、中和稀释法的原理与方法中和稀释法是一种通过连续稀释和接种微生物菌液来进行微生物计数的方法。

该方法的原理基于菌落形成单位(CFU)，即每个菌落表示1 个细胞形成的菌群。

通过中和稀释法可以得出样品中微生物的密度。

中和稀释法的方法如下：1.准备0.9%生理盐水或其他适宜的缓冲液。

2.准备一种具备重要生长条件的富含营养因子的培养基，使得微生物菌落可以形成。

3.通过称重或体积测量等方式，将测试样品加到称量瓶或试管中，用缓冲液配制样品稀释液。

4.对第一级瓶进行稀释处理，如1：10，按比例添加缓冲液。

5.从刚制好的第一级液体中，取出1ml 加入到第二级瓶中溶解，并稀释。

6.具备上述条件，在第二级瓶重复步骤5，直至取到合适数量的菌落。

7.针对每个稀释级别，将溶液接种到富含营养因子的培养基中，并放置在特定的环境下使其发育至菌落能够计数的大小。

8.按照菌落数量共推算出样品中微生物的数量，并以CFU/g、CFU/ml 等单位出具分析报告。

二、中和稀释法在食品微生物检验中的应用中和稀释法是食品检测中常用的微生物计数方法之一。

它可以将液态或可分散食品测定中的微生物数目计算出来。

特别是在检测微生物水平的营养液中及微生物分布不均匀的食品甚至包装材料中十分常见。

它可以通过菌落形成单位，得出样品中微生物的密度，并可以针对不同菌群进行检测。

但是，在使用中和稀释法时应注意以下几点：1.首先，要求检测时特别注重采样区域的均匀性，以避免不均衡样品导致进行不准确的检测。

2.除非液相小于10 ml，否则建议使用其他方法进行分析。

浅谈化学消毒的中和剂对水中内毒素活性检测的影响细菌内毒素又称脂多糖,是革兰氏阴性细菌和某些蓝藻的细胞壁组分物质,活菌释放较少,主要由菌体解体后释放. 内毒素是常见的外源性致热原,属于强免疫刺激因子,具有广泛的生物活性,与多种人类疾病密切相关. 机体对内毒素反应极为敏感,Elin 等报道使用0. 1 ～ 0. 5 ngkg - 1 内毒素进行体内注射可以引起人体的发热反应. 血液暴露是内毒素的主要暴露途径. 为了保证与血液接触的药品、医疗器械及医疗用水的安全性,内毒素检查一直被认为是医药行业的重要检验项目. 目前内毒素的法定检测方法是鲎试验,其机制是鲎血中阿米巴细胞与内毒素发生一系列酶促反应导致凝集反应. 光度法鲎试验( 浊度法和显色法) 是内毒素的定量测试方法,2005 年中国药典正式将光度法收录. 鲎试验属于生物毒性测试,不是精确的分析方法,干扰因素很多. 药典规定鲎试验中常用的干扰去除方法是对样品多倍稀释,并控制加标回收率在50% ～200%之内. 但是,对于严重干扰的样品经多倍稀释后内毒素活性降低,有时不能达到测试剂的最低检测限,难以保证合适的回收率. 因此,在鲎试验前不仅需要确定样品含有的干扰因素,还需要避免添加严重干扰鲎试验的物质. 另外,在采用光度法鲎试验时,还应避免添加影响光密度值的物质.近年来细菌内毒素的研究领域从医药行业逐渐外展,水体环境内毒素所致潜在的健康风险已经引起越来越多关注. 当水中微生物增殖或者蓝藻暴发,菌体死亡或者经过消毒处理后释放的大量内毒素,可以通过呼吸和胃肠暴露等途径危害机体健康.在水消毒工艺方面,不同的消毒工艺、消毒剂量和反应时间都会对内毒素的释放和控制效果带来影响. 在评价化学消毒措施对内毒素释放的控制效果时,必须先采用中和剂来去除样品中残留消毒剂,因此应该避免化学消毒的中和剂对鲎试验结果的干扰. 目前环境领域和医疗领域常见化学消毒的中和剂有多种,如组氨酸、甘氨酸、抗坏血酸、吐温80、亚硫酸钠和硫代硫酸钠等. 这些中和剂对所试微生物无抑制或杀灭作用,对培养基的营养成分无破坏作用,但是对鲎试验检测结果的干扰情况尚不清晰.本研究采用动态浊度鲎试验,探讨常见的中和剂单独使用时对内毒素活性定量检测结果的干扰情况,旨在选择适用于内毒素检测的中和剂,并确定合适的使用浓度范围.1 材料与方法1. 1 玻璃器皿无热原稀释试管( 15 mm 100 mm) 、无热原反应试管( 8 mm 75 mm) 和无热原移液器吸头购买自湛江安度斯生物公司. 其他玻璃器皿经铬酸浸泡24 h,热自来水冲洗,超纯水冲洗,马弗炉干烘350 ～400℃ 2 h 去除热原.1. 2 仪器与试剂内毒素定量检测采用ATI320-06 动态试管仪及配套软件( Lab Kinetic 公司,英国) . pH 值测定采用Pb-21 酸度计( Sartorius 公司,德国) . Mill-Q 纯水机( Millipore 公司,美国) . 另外,还需要涡旋混合器、马弗炉、移液器. 动态浊度法鲎试剂( 最低检测限0. 03 EUmL - 1 ) 、无热原检查用水( 0. 003EUmL - 1 ) 和无热原Tris-HCl( pH 7. 4) 缓冲溶液购买自湛江安度斯生物公司. 内毒素工作标准品( control standard endotoxin,CSE,批号xxxx,每支90 EU) 购买自中国药品生物制品检定所( 北京) .生物化学试剂如抗坏血酸、Na2SO3和Na2S2O3为分析纯,组氨酸、甘氨酸和吐温80 购买自Sigma公司. 1. 3 动态浊度法鲎试验检测内毒素活性采用动态浊度鲎试验定量检测内毒素活性,将0. 1 mL 鲎试剂加入反应管,加入0. 1 mL 样品混合均匀,立即放入ATI320-06 动态试管仪进行检测.样品和鲎试剂在37℃ 温育条件下发生凝集反应,ATI320-06 动态试管仪及软件生成每个样品的反应动态曲线,记录反应试管在波长405 nm 处达到95%透光率的达限时间. 样品的达限时间和所含内毒素活性负相关,根据标准曲线来确定样品内毒素活性. 每个样品采用2 个平行样,并以0. 1EUmL - 1CSE 溶液作为阳性对照,记录回收率、稀释倍数、达限时间等其他参数. 样品测试3 次取均值. 试验结果应满足以下条件: ① 标准曲线中阴性对照的达限时间长于最低活性( 0. 031 25EUmL - 1 ) 的达限时间. ② 标准曲线相关系数R 大于0. 98. ③ 平行样的变异系数不得大于10%. ④根据药典规定,加标回收率在50% ～ 200% 之间认为稀释倍数合适,没有明显的干扰.1. 4 内毒素检测的干扰试验( 1) CSE 溶液的配制打开CSE( 每支90EU) ,向安瓿瓶内加1 mL 无热原检查用水配制成90EUmL - 1的CSE 溶液,密封后采用涡旋混合15min. 将CSE 溶液转移至无热原玻璃容器,加无热原检查用水稀释成0 ～ 2 EUmL - 1的CSE 溶液.( 2) 0 ～ 1. 0%浓度的中和剂对鲎试验的影响采用无热原检查用水,将组氨酸、甘氨酸、抗坏血酸、吐温80、亚硫酸钠( 碱性) 和硫代硫酸钠配制成浓度0、0. 5%、1. 0%、2. 0%、5. 0%和10. 0%的中和剂溶液. 此外,采用无热原Tris-HCl( pH 7. 4) 缓冲溶液配制浓度分别为0、0. 5%、1. 0%、2. 0%、5. 0%和10. 0%的亚硫酸钠( 中性) 溶液. 将已配制的不同浓度中和剂溶液按1∶ 9的比例添加至0 ～ 2EUmL - 1的CSE 溶液中,检测组氨酸、甘氨酸、抗坏血酸、吐温80、亚硫酸钠( 碱性) 、亚硫酸钠( 中性) 和硫代硫酸钠浓度分别在0、0. 05%、0. 1%、0. 2%、0. 5%和1. 0%情况下内毒素活性的变化.( 3) 0 ～ 5. 0%浓度的硫代硫酸钠对鲎试验的影响将硫代硫酸钠加无热原检查用水溶解,配制成0、2. 5%、5. 0%、10. 0%、15. 0%、20. 0% 和25. 0%的硫代硫酸钠溶液. 将已配制的硫代硫酸钠溶液按1∶ 4的比例添加至0 ～ 2 EUmL - 1 的CSE 溶液中,检测硫代硫酸钠浓度分别在0、0. 5%、1. 0%、2. 0%、3. 0%、4. 0%和5. 0%情况下内毒素活性的变化.2 结果与分析2. 1 常用的有机类中和剂对鲎试验结果的影响组氨酸、甘氨酸、抗坏血酸和吐温80 是常用的有机类中和剂,在0 ～ 1. 0% 的浓度范围对动态浊度法鲎试验的干扰结果. 结果表明,甘氨酸对内毒素活性的检测未见明显干扰,组氨酸、抗坏血酸和吐温80 对检测结果均有不同程度的影响,干扰程度详. 其中,0～ 1. 0%浓度的组氨酸对内毒素活性的定量检测引起强烈的增强效果; 抗坏血酸引起显著的抑制效果; 吐温80 引起明显的抑制作用. 甘氨酸和组氨酸等氨基酸类用来中和醛类消毒剂. 由于组氨酸是类内毒素物质,可以引起内毒素的聚集和吸附,严重影响光度法鲎试验的光度值,导致检测结果的增强. 当组氨酸浓度从0 提高至0. 05% 时,检测结果从初始内毒素活性0. 38EUmL - 1 增高至0. 95 EUmL - 1,增强率达到150%; 当组氨酸浓度从0. 05% 提高至0. 5% 时,内毒素活性提高至3. 30 EUmL - 1,增强率达到768%. 0 ～1. 0% 浓度的甘氨酸对鲎试验结果基本无明显干扰. 检测结果表明当甘氨酸浓度从0 提高至1. 0%时,初始内毒素活性1. 22 EUmL - 1 增高至1. 39 EUmL - 1,增强率仅为14%. 但是,甘氨酸和戊二醛的中和产物显黄色,会对光度法鲎试验( 浊度法和显色法) 产生严重干扰,因此在光度法鲎试验中,甘氨酸不适于做戊二醛的中和剂使用. 吐温80 是常用的中和剂,可以和卵磷脂配伍用于清除吸附力较强的离子型消毒剂如季铵盐类和酚类. 0～ 1. 0%浓度的吐温80 对内毒素检测引起明显的抑制效果. 当吐温80 浓度从0 提高至1. 0% 时,检测结果从初始内毒素活性1. 18 EUmL - 1 降低至0. 69EUmL - 1,抑制率为41%. 抗坏血酸是常用的抗氧化剂,可以用作卤素消毒的中和剂. 0 ～ 1. 0% 浓度的抗坏血酸对鲎试验结果引起显著的抑制效果. 当抗坏血酸浓度从0% 提高至0. 05%,检测结果从初始内毒素活性1. 23 EUmL - 1 降低至0. 70EUmL - 1,抑制率达到43%; 当抗坏血酸浓度提高至1. 0% 时,内毒素活性降低至0. 34 EUmL - 1,抑制率达到72%. 抗坏血酸的酸性强,向样品中添加会导致内毒素的酸解或者对鲎试剂酶活性造成破坏,抑制鲎试验的反应并影响检测结果.2. 2 常用无机类中和剂对鲎试验结果的影响亚硫酸钠和硫代硫酸钠是常用的无机类中和剂,其在0 ～ 1. 0%的浓度范围对动态浊度法. 亚硫酸钠是卤素和醛类消毒剂的中和剂,由于亚硫酸钠的碱性强,使用时分为碱性和中性两种情况. 0 ～ 1. 0%浓度的亚硫酸钠( 碱性) 对内毒素检测有明显的增强效果. 当亚硫酸钠( 碱性) 浓度从0 提高至1. 0%时,检测结果从初始内毒素活性1. 08 EUmL - 1增高至1. 50 EUmL - 1,增强率为39%. 亚硫酸钠( 碱性)对鲎试验有增强效果,这是因为鲎试剂中含有一定数量的Ca2 + 和Mg2 + 用来保持试剂的分散性,OH- 的增多会影响Ca2 + 和Mg2 + 的状态,导致鲎试剂分散性差,引起反应产物聚集导致增强结果. 0 ～ 1. 0% 浓度的亚硫酸钠( 中性) 对内毒素检测引起显著的抑制作用. 亚硫酸钠( 中性) 浓度从0 提高至1. 0%时,检测结果从初始内毒素活性1. 08 EUmL - 1 降低至0. 38EUmL - 1,抑制率为65%. 虽然亚硫酸钠在调节pH值至中性后,可以消除水样的碱度带来的干扰,但是添加的H+ 和SO2 -3生成的HSO-3破坏鲎试剂中酶的活性,对鲎试验有抑制效果. 硫代硫酸钠是卤素类消毒剂、汞制剂及过氧乙酸等的中和剂.0 ～1. 0%浓度的硫代硫酸钠对鲎试验结果基本无明显干扰,当硫代硫酸钠浓度从0 提高至1. 0%时,内毒素活性从初始值1. 08 EUmL - 1降低为1. 01 EUmL- 1,抑制率仅为6. 5%. 但是当硫代硫酸钠浓度提高至1. 0% ～5. 0%时,对内毒素检测结果有明显的抑制效果. 因此,低浓度的硫代硫酸钠溶液适于在鲎试验之前作为消毒剂的中和剂,但是浓度应该控制在0. 5%以内.3 结论( 1) 在0 ～ 1. 0% 浓度范围内,除甘氨酸和硫代硫酸钠之外,组氨酸、抗坏血酸、吐温80 和亚硫酸钠( 中性和碱性) 对内毒素检测结果均有不同程度的干扰.( 2) 组氨酸对内毒素活性的定量检测有强烈的增强效果; 抗坏血酸引起显著的抑制效果; 吐温80引起明显的抑制效果; 亚硫酸钠( 碱性) 引起明显的增强效果; 亚硫酸钠( 中性) 有显著的抑制效果.( 3) 此外,0 ～ 1. 0% 浓度的甘氨酸对内毒素检测基本无明显干扰,但是甘氨酸和戊二醛的中和产物呈黄色,当作为戊二醛的中和剂使用时会对光度法鲎试验的结果产生干扰. 0 ～ 1. 0%浓度的硫代硫酸钠对鲎试验结果基本无明显干扰,但是高浓度的硫代硫酸钠( 1. 0% ～ 5. 0%) 会对鲎试验引起明显的抑制效果.( 4) 与组氨酸、甘氨酸、抗坏血酸、吐温80 和亚硫酸钠相比,硫代硫酸钠更适合在鲎试验之前用作中和剂,但是浓度应控制在0. 5% 范围以内. 此外,有些消毒措施不适合选择硫代硫酸钠作为中和剂,需进一步筛选出对鲎试验无明显干扰的其他中和剂,避免使用组氨酸、抗坏血酸、吐温80 和亚硫酸钠这类对鲎试验有干扰的中和剂.<!--。

药品微生物限度检查方法验证一般步骤1.样品及确定验证项目样品要求：不含菌或少量菌验证项目：根据药品用药途径、处方、制法确定。

细菌、霉菌及酵母菌计数验证（一般必作）；控制菌检查如为中药制剂必须查标准，根据用药途径、处方、制法确定控制菌检查项目。

特殊的如滴眼剂、用于烧伤、严重创伤等应根据制剂通则项下要求及微生物限度标准来确定。

2. 确定供试液制备方法3. 方法选择预试验（1）目的：确定样品对试验菌有无抑菌活性及计数验证各试验菌的回收试验方法。

（2）查资料，根据样品的功能、主治及所含成分等确定方法选择预试验方案。

（3）根据预试验结果确定各试验菌计数验证方法控制菌验证方法4. 验证试验：选择3个批号样品进行3次独立实验，证明方法的有效性；5. 据验证结果优化试验条件，建立微生物限度检查方法SOP。

6. 写出验证资料。

示教内容11.5.上午：菌液制备方法：一. 新鲜浓菌液制备（要求学员练习操作的内容）新鲜浓菌液接种：细菌大肠埃希菌[CMCC（B）44102]金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]生孢梭菌[CMCC（B）64941]（厌氧梭菌）铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]培养基：营养肉汤3-5ml、硫乙醇酸盐流体培养基3-5ml接种及培养：1.分别取各试验菌半个--1个菌落分别接种营养肉汤（充分研匀、摇匀），36±1℃培养16-18小时。

2.生孢梭菌新鲜培养物取0.1ml接种硫乙醇酸盐流体培养基（临用前排氧）36±1℃培养18-24小时。

霉菌及酵母菌白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]培养基：改良马丁培养基3-5ml；改良马丁琼脂培养基斜面1.取白色念珠菌的菌落接种改良马丁培养基23-28℃培养24小时（可用36±1℃培养18-24）。

2.黑曲霉孢子悬液的制备：沾取黑曲霉孢子接种改良马丁琼脂培养（红字为示教内容基，培养5-7天待培养物黑色孢子生长（全部变黑，已制备好斜面培养物示教）加入5-10ml0.9%氯化钠溶液，小心振挡洗脱表面的黑色孢子1-2次，吸出洗脱液（注意不要触到菌丝体）即为孢子悬液。