蛋白质变性与沉淀时

实验1－2 蛋白质的性质实验（二）蛋白质的沉淀反应一、目的和要求：1、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。

2、了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。

3、了解蛋白质变性与沉淀的关系。

二、原理在水溶液中的蛋白质分子由表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。

蛋白质的沉淀反应可分为两类：（1）可逆的沉淀反应：此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来的溶剂中，并保持其天然性质而不变性。

如大多数蛋白质的盐析作用或低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质，提纯蛋白质时，常利用此类反应。

（2）不可逆沉淀反应：此时蛋白质分子内部结构发生重大变化，蛋白质常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂中，加热引起的蛋白质沉淀与凝固，蛋白质与金属离子或某些有机酸的反应都属于此类。

蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷），并不析出，因此变性的蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。

三、操作方法：（1）蛋白质的盐析加5％卵清蛋白溶液2毫升于试管中，再加等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数分钟则析出球蛋白的沉淀，倒出少量浑浊沉淀，加少量水，是否溶解？为什么？将管内溶液过滤，向滤液中添加硫酸铵粉末到不再溶解为止，此时析出的沉淀为清蛋白，取出部分清蛋白，加少量蒸馏水，再观察沉淀的再溶解。

（2）重金属离子沉淀蛋白质取一支试管，加入蛋白质溶液2毫升，再加入3％AgNO31—2滴，振荡试管，有沉淀生成，放置片刻，倾出上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解？为什么？注意使用醋酸铅或硫酸铜沉淀蛋白质时不可过量，否则引起沉淀的再溶解，不妨以实验验证之，取一支试管加入约1毫升蛋白质溶液，加入1％CuSO4观察至有沉淀，再继续加入过量的CuSO4，观察沉淀消失，当然也可用0.5％的醋酸铅进行验证。

（3）某些有机酸沉淀蛋白质取一支试管，加入蛋白质液2毫升，再加入1毫升5％三氯乙酸溶液，振荡试管，观察沉淀的生成，放置片刻，倾出上清液，向沉淀中加入少量水，观察沉淀是否溶解。

1. 什么是蛋白质变性？简单叙述变性与沉淀的关系。

在某些理化因素作用下，蛋白质的构象被破坏，失去其原有的性质和生物活性，称为蛋白质的变性。

当破坏了维持蛋白质胶体稳定的因素甚至蛋白质的构象时，蛋白质就会从溶液中析出，这种现象称为蛋白质的沉淀。

变性的蛋白质不一定沉淀，沉淀的蛋白质不一定变性，但变性蛋白质容易沉淀。

2. 底物浓度对反应速度的影响答：在酶量恒定的情况下，酶促反应的速度主要取决于底物的浓度；底物浓度太低时，反应速度随着底物浓度的增加而上升，加大底物浓度，反应速度缓慢，底物进一步增高，反应速度不在随底物浓度的增加而加快，达到最大反应速度，此时酶的活性中心被底物饱和。

3. 请简述一下苹果酸-天冬氨酸穿梭的过程。

胞浆中生成的NADH在苹果酸脱氢酶的作用下，使草酰乙酸还原成苹果酸，后者通过线粒体内膜上的苹果酸-α-酮戊二酸转运体进入线粒体，又在线粒体内苹果酸脱氢酶的作用下重新生成草酰乙酸和NADH。

NADH进入NADH氧化呼吸链进行氧化磷酸化，生成2.5分子ATP。

线粒体内生成的草酰乙酸经天冬氨酸氨基转移酶的作用生成天冬氨酸，后者经谷氨酸天冬氨酸转运体运出线粒体再转变成草酰乙酸，继续进行穿梭。

苹果酸-天冬氨酸穿梭主要存在于肝和心肌组织中。

4. 糖异生过程是否为糖酵解的逆反应？为什么？糖异生不是糖酵解的逆反应。

糖酵解过程中有三步不可逆反应，在糖异生途径之中须由另外的反应和酶代替。

这三步反应是:①丙酮酸转变成磷酸烯醇式丙酮酸，有2个反应组成，分别由丙酮酸所化酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶催化;②1，6-双磷酸果糖转变成6-磷酸果糖，由果糖双磷酸酶催化③6-磷酸葡萄糖水解为葡萄糖，由葡萄糖-6-磷酸酶催化5.什么是乳酸循环？乳酸循环的生理意义是？肌肉特别是在缺氧收缩时产生大量的乳酸,乳酸经血液运输到肝,在肝中进行经糖异生,再生成葡萄糖释入血液,可再回到肌肉,就构成乳酸循环。

乳酸循环的形成的是由肝脏和肌肉中的酶的特点所致。

蛋白质沉淀反应实验集团企业公司编码：（LL3698-KKI1269-TM2483-LUI12689-ITT289-蛋白质的沉淀反应一、目的和要求1、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识2、掌握几种沉淀蛋白质的方法3、了解蛋白质变性与沉淀的关系二、沉淀反应（一）原理在水溶液中，蛋白质分子的表面上由于有水化层和同性电荷的作用，所以成为稳定的胶体颗粒。

但这种稳定的状态是有条件的。

在某些理化因素的作用下，蛋白质分子表面带电性质发生变化、脱水甚至变性，则会以固态形式从溶液中析出，这个过程就称为蛋白质的沉淀反应。

蛋白质的沉淀反应可分为以下两种类型：1、可逆沉淀反应沉淀反应发生后，蛋白质分子内部结构并没有发生大的或者显着变化。

在沉淀因素去除后，又可恢复其亲水性，这种沉淀反应就是可逆沉淀反应，也叫做不变性沉淀反应。

属于这类沉淀反应的有盐析作用、等电点沉淀以及在低温下短时间的有机溶剂沉淀法等。

2、不可逆沉淀反应蛋白质在沉淀的同时，其空间结构发生大的改变，许多副键发生断裂，即使除去沉淀因素，蛋白质也不会恢复其亲水性，并丧失生物活性，这种沉淀反应就是不可逆沉淀反应。

重金属盐、生物碱试剂、强酸、强碱、加热、强烈震荡、有机溶剂等都能使蛋白质发生不可逆沉淀反应。

（二）盐析1、材料与试剂（1）10%的卵清蛋白溶液（要求新鲜配制）、浓蛋白溶液（2）饱和硫酸铵溶液（3）固体硫酸铵（4）滤纸、玻棒2、操作方法（1）取试管一支，加入浓蛋白溶液2ml，再加等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置10分钟将出现沉淀。

此沉淀物为球蛋白。

（2）取上清液于另一支试管。

（3）向上清液液中加入硫酸铵粉末，边加边用玻棒搅拌，直至粉末不再溶解为止。

静置数分钟后，沉淀析出的是清蛋白。

（4）向两支试管中分别加水，观察其沉淀是否溶解。

（三）重金属盐沉淀重金属离子如Pb2+、Cu2+、Hg2+、Ag2+等可与蛋白质分子上的羟基结合生成不溶性金属盐而沉淀：重金属盐类沉淀蛋白质的反应通常很完全，特别是在碱金属盐类存在时。

《生物化学简明教程》附带的习题答案（一）用于测定蛋白质多肽链N端、C端的常用方法有哪些？解答：（1）N-末端测定法：常采用2，4―二硝基氟苯法、Edman降解法、丹磺酰氯法。

（2）C―末端测定法：常采用肼解法、还原法、羧肽酶法。

（二）何谓蛋白质的变性与沉淀？二者在本质上有何区别？解答：蛋白质的变性：天然蛋白质受物理或化学因素的影响后，使其失去原有的生物活性，并伴随着物理化学性质的改变的作用。

变性的本质：分子中各种次级键断裂，使其空间构象从紧密有序的状态变成松散无序的状态，一级结构不破坏。

蛋白质变性后的表现：①生物学活性消失②理化性质改变：溶解度下降，黏度增加，紫外吸收增加，侧链反应增强，对酶的作用敏感，易被水解。

蛋白质由于带有电荷和水膜，因此在水溶液中形成稳定的胶体。

如果在蛋白质溶液中加入适当的试剂，破坏了蛋白质的水膜或中和了蛋白质的电荷，则蛋白质胶体溶液就不稳定而出现沉淀现象。

沉淀机理：破坏蛋白质的水化膜，中和表面的净电荷。

蛋白质的沉淀可以分为两类：（1）可逆的沉淀：蛋白质的结构未发生显著的变化，除去引起沉淀的因素，蛋白质仍能溶于原来的溶剂中，并保持天然性质。

（2）不可逆沉淀：蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质变性而沉淀，不再能溶于原溶剂。

蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在，并不析出。

因此变性蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已经变性。

（三）一个α螺旋片段含有180个氨基酸残基，该片段中有多少圈螺旋？计算该α-螺旋片段的轴长。

解答：180/3.6=50圈，50×0.54=27nm，该片段中含有50圈螺旋，其轴长为27nm。

（五）如果人体有1014个细胞，每个体细胞的DNA含量为6.4 × 109个碱基对。

试计算人体DNA 的总长度是多少？是太阳―地球之间距离(2.2 × 109 km)的多少倍？已知双链DNA每1000个核苷酸重1 ×10-18g，求人体DNA的总质量。