反相胶束萃取Reversed Micelle Extraction 一、反相胶束萃取概况随着生物工程技术的发展，传统的分离方法(如溶剂萃取)无法满足活性蛋白质等生物大分子物质的提取和分离。
因为生物大分子物质一般在40～50℃以上开始变性，且绝大多数生物大分子物质不溶于有机溶剂，有机溶剂也易引起生物大分子物质的变性。
同时生物大分子表面带有许多电荷，普通离子缔合型萃取剂很难奏效。
因此研究和开发易于工业化、高效的生化活性物质分离方法就成为生物工程技术发展的当务之急。
反相胶束萃取技术是在这一背景下产生的新型分离技术。
反胶束萃取技术的起源可追溯至1977年。
Lujsi等人首次提出用反相微胶束萃取蛋白质的概念，当时未引起重视。
到20世纪80年代，生物学家开始认识到该技术的优越性，荷兰、美国的科学家首先进行了反相微胶束萃取蛋白质的研究。
近年来该项研究已在国内外深入展开。
由于反胶束萃取具有成本低、溶剂可反复使用、萃取率和反萃取率高；能降低蛋白质(胞内酶)在非细胞环境中的迅速失活；且构成反胶束的表面活性剂具有溶解细胞能力，可直接用于从整体细胞中提取蛋白质和酶。
所以反相微胶束萃取技术为活性蛋白质和其他活性物质的分离开辟了一条具有工业前景的新途径，得到快速发展。
二、反相胶束萃取的概念▪正常胶束：表面活性剂在极性溶液中形成的胶束或微胶团结构中，表面活性剂的亲水性基团朝外，而疏水性基团则靠内相互聚集成一种微胶团结构（图a），这种微胶束（团）称为正常胶束(normal micelle)。
正常微胶束存在于极性溶剂中(多数情况为水)，较为常见。
▪反相微胶束：当表面活性剂在非极性溶液中形成胶束或微胶团时，表面活性剂的排列方向正好与在极性溶剂中的情况相反，即疏水性基团朝外，而亲水性基团则朝内并形成一个极性核区，由于这种微胶团结构（图b）与正常微胶束结构相反，所以称这种微胶束称为反相微胶束（reversed micelle）。
▪水池(water pool) ：在反相微胶束中，表面活性剂的亲水基团所围成的一个极性核心，称为水池。
▪微胶束萃取：如待分离组分是采用形成微胶束的形式进行萃取的过程，称为微胶束萃取或微胶团萃取。
▪反向微胶束萃取：如待分离组分是以反相微胶束（团）的形式被萃取的过程，就称之为反向微胶束萃取或反向微胶团萃取。
三、反相微胶束形成的条件及其特点反胶束或逆胶束(revcrsed micelle)是表面活性剂分散于连续有机相中自发形成的纳米尺度的一种聚集体，是透明的、热力学稳定的系统．1、表面活性剂表面活性剂是由亲水憎油的极性基团和亲油憎水的非极性基团两部分组成的两性分子。
分为阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和非离子型表面活性剂，它们都可用于形成反胶束。
常用的表面活性剂及相应的有机溶剂见表．表：常用表面活性剂及其相应的有机溶剂表面活性剂有机溶剂AOT（AerosolOT）丁二酸-2-乙基己基酯磺酸钠n-烃类（C6～C10）、异辛烷、环已烷、四氯化碳、苯CTAB（Cetyltrimethyl AmmoniumBromide ）溴化十六烷三甲基铵已醇/异辛烷，已醇/辛烷，三氯甲烷/辛烷环已烷TOMAC三辛基甲基氯化铵辛烷Brij60聚氧乙烯月桂醇醚Triton X已醇/环已烷烷基酚聚氧乙烯磷脂酰胆碱苯、庚烷磷脂酰乙醇胺苯、庚烷在反胶束萃取蛋白质的研究中，用得最多的是阴离子表面活性剂AOT，学名丁二酸—2—乙基己基酯磺酸钠，结构式如图．AOT容易获得，具有双链，极性基团较小，形成反腔束临界胶束浓度较低，并且形成的反胶束较大，有利于大分子蛋白质的进入．2、临界胶束浓度（Critical micelle concentration)临界胶束浓度：是胶束形成时所需的表面活性剂的最低浓度，用CMC来表示。
与表面活性剂化学结构、溶剂、温度、压力等因素有关。
CMC值可通过测定表面活性剂各种物理性质的突变(如表面张力，渗透压、浊度、当量电导等)来确定。
图显示了表面活性剂十二烷基磺酸钠与溶液物理化学性质的关系，在特征浓度为0.008 mol／L 时各性质都有一个突变现象，此时表面活性剂的浓度就是十二烷基磺酸钠在此溶剂中的临界胶束浓度．由于实验方法不同，所得CMC值往往不一致，但是突变点总是落在一个很狭窄的浓度范围（误差0.1～1.0 mM），故用CMC范围表示单个的CMC值更为方便。
表列出了几种表面活性剂相互比较的CMC值，可看出，CMC值与表面活性剂的结构有关。
3、胶束与反胶束的形成当将反胶束的有机溶剂与蛋白质水溶液接触，蛋白质及亲水物质能够通过整合进入此反胶束水池，由于周围水层和极性基团的保护，保持了蛋白质的天然构型，不会造成由于有机溶剂的影响引起蛋白失活。
其过程可用图示意说明。
4、反胶束的形状与大小反胶束的大小取决于反胶束的含水量w0。
含水量是指反胶束中水分子数与表面活性剂分子数之比。
因表面活性剂(surfactant)基本参与形成了反胶束，因而w0 =[H2O]／[surfactan]。
由于每个表面活性剂极性基团有一定的有效面积，因此，它决定了反胶束的大小和每个反胶束中表面活性剂的分子数．在反胶束溶液与水相平衡的情况下，w0值取决于表面活性剂的种类、溶剂的类型、表面活性助剂、水相中盐的种类和盐的浓度等。
对AOT ／异辛烷／H2O体系，当溶解于反胶束中的含水量w0 =50时，则反胶束的流体力学半径为18nm，每个反胶束中的表面活性剂分子数为1380，而极性核表面的AOT分子的有效极性基团面积可达0.568nm2。
当含水量w0超过60(最大含水量) 时，透明的反胶束溶液将浑浊，并发生分相。
对于季胺盐形成的反胶束，w0一般小于3。
在无平衡水相存在的情况下，w0可人为地在一定范围内调整。
蛋白质进入反胶束后，会使反胶束的结构发生变化。
如大小、聚集数和w0等改变，这些变化的基本机理目前不太清楚。
四、反相胶束萃取的基本原理在反相胶束萃取过程中，蛋白质或酶等生物大分子主要以水壳膜形式存在于反相微胶团的极性核心内部，避免了与有机溶剂直接接触，保持整个萃取过程中生物大分子的活性，实现了既能溶出酶及蛋白质等生物大分子，又能与水分相分离，并能保持这些生物大分子的生物活性。
关于蛋白质及酶等生物大分子是以何种形式被反相微胶团萃取的机理，有不同的见解。
1、三元相图及反胶束萃取蛋白质原理对由水、表面活性剂和非极性溶剂构成的三元系统，存在多种共存相，可用三元相图表示，图是水—AOT—异辛烷系统相图。
蛋白质进入反胶束溶液是一种协同过程。
在宏观两相(有机相和水相)界面间的表面活性剂层，同邻近的蛋白质发生静电作用而变形，接着在两相界面形成了包含有蛋白质的反胶束，此反胶束扩散进入有机相中，从而实现蛋白质的萃取，萃取过程如图。
改变水相条件(如pH值、离子种类、强度等)又可使蛋白质由有机相重新返回水相，实现反萃取过程。
2、蛋白质在微胶束中的结合方式（1）“水壳”模型(Water—Shell Model)反胶束系统中水通常可分结合水和自由水。
结合水是指位于反胶束内部形成水池的水，自由水是存在于水相中的水。
蛋白质在反胶束内的溶解情况可用水壳模型解释：大分子蛋白质被封闭在“水池”中，表面存在一层水化层与胶束内表面分开，使蛋白质不与有机溶剂直接接触。
水壳模型较好地解释了蛋白质在反胶束内的存在状态。
其证据较多。
1、从弹性光散射的研究证实在蛋白质分子周围至少存在一个单分子水层；2、糜蛋白酶在反胶束中的荧光特性与在水中特性相象；3、反胶束中酶所显示的动力学特性接近于在水中的特性等，这些事实都有力地支持了水壳模型。
“水壳”模型解释图(2)“吸附”模型“吸附”模型认为生物大分子虽然溶解于由表面活性剂极性部分围成的中心中，但在中心部分生物大分子是以被吸附的状态附着于胶团的极性壁上，见图；“吸附”模型解说图(3)疏水基“架连”模型该模型认为生物大分子的非极性部分与多个微胶团的非极性部分连接，由此形成生物大分子溶解于多个微胶团之间的一种状态，见图。
五、影响反相胶束形成的因素2.水相的酸碱度反相微胶团内水相的酸碱度，会影响生物大分子的荷电性，从而影响生物大分子与反相微胶团的结合。
由于AOT为阴离子表面活性剂，亲水部分带负电，形成的反胶团内表面带负电。
当反胶团内水相pH小于生物大分子的等电点pI时，使生物大分子带正电，这样生物大分子与反相微胶团中带负电性的内表面相吸，形成比较稳定的含生物大分子的反相微胶团，可较容易地进行萃取。
当反相微胶团内水相中的pH大于等电点时，生物大分子带负电，难与反相微胶团内壳结合，呈显较低溶解性甚至不溶解状态，分离效率下降。
利用此原理，通过调节水相的pH，就可分离溶液中不同组分的生物大分子。
3.水相中的离子强度在低离子强度下，酶和蛋白质等生物大分子表面上的荷电性和亲水性得到了改善，溶解度上升，与反相微胶团内表面的结合力增强。
当水相中的离子强度增加到一定程度时，由于抵消了生物大分子表面上的电荷，并且由于离子的水化作用而使蛋白质分子表面上的水膜消失，减少了与反相微胶团内表面的结合作用，从而降低了溶解度，使分离效率降低。
4. w0值大小w0值的大小，也直接影响到反相微胶团的萃取效率。
w0值太小，说明反相微胶团内的水分含量低，生物大分子的溶解度下降，甚至当w0值过小时，形成的反相微胶团太小，生物大分子根本无法进入反相微胶团内，这就必然影响到萃取效率。
图4-3表示了w0值和蛋白质溶解率之间的关系。
六、反相胶束萃取的方法反相微胶团萃取分离过程分两步：第一步是含生物大分子的反相微胶团的形成；第二步是反相微胶团的破乳及生物大分子的释放。
形成含生物大分子的反相微胶团的方法有多种，最常用到的有3种。
1、相转移法通过将含生物大分子的水相与溶解有表面活性剂的有机相接触，缓慢地搅拌，在形成反向微胶团的同时，其中的生物大分子即转入到反相微胶团中，直到处于萃取平衡状态为止。
此过程可用图表示。
2、注入法通过将含有生物大分子的水溶液注入到含有表面活性剂的有机相中，从而实现萃取过程，见图。
3、溶解法对于固体粉末中的生物大分子，或不溶于水的生物大分子，可采用溶解法进行。
先制备好含水(w0 =3～30左右)的反相微胶束的有机溶液，然后把含生物大分子的固体粉末加入此种反相微胶团的有机溶液中，同时搅拌，生物大分子慢慢即可进入到反相微胶团内的水池中心而实现萃取过程。
制备了含生物大分子的反相微胶团后，可参考液膜分离的方法，将混合液送入到澄清器中，使反相微胶团与外相有机溶剂分离。
然后对溶解有生物大分子的反相微胶团进行破乳以释放其中的生物大分子，破乳的原理和方法有化学破乳和物理破乳等。
七、影响反胶束萃取的因素反胶束蛋白质的萃取，与蛋白质的表面电荷和反胶束内表面电荷间的静电作用以及反胶束的大小有关。
