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禽腺病毒家禽分离株的生物学特性张明明,王小辉,秦爱建(扬州大学兽医学院,江苏扬州225009)摘要:为了解禽腺病毒(FA V)家禽分离株的致病性,通过病毒凝集试验、电镜观察、细胞病变试验以及接种鸡胚或鸡体,研究了3株A型F AV分离株的生物学特性。
结果表明,分离株具有腺病毒的典型形态,不能凝集鸡的红细胞;不引起鸡胚成纤维细胞的病变,可导致鸡胚肾细胞变圆、折光性增强;对SPF鸡胚无明显致病作用;以1.0×1010T CID50的剂量,经皮下注射和口服2种途径接种1日龄的SPF鸡,攻毒后未出现明显的临床症状,体重和免疫器官的重量基本不受影响,除肝脏出现一过性病变,大部分脏器基本无病变。
因此,FA V分离株致病性低,生物安全性高,可能是较好的FA V载体。
关键词:A型禽腺病毒;生物学特性;致病性中图分类号:S852.65+9.1 文献标识码:A 文章编号:0529-6005(2010)10-0007-03 Biological characteristics of fowl adenovirus strains isolated from poultryZH ANG Ming-ming,WANG Xiao-hui,QIN Ai-jian(Co llege of Veterinary M edicine,Yangzhou U niver sity,Yang zhou225009,China)A bstract:To understand the patho genicity of three strains of fo w l adeno virus(FAV)subtype A isola-ted from poultry,some biolog ical characteristics w ere explored by hem agglutination test,electron micros-copy,cy to pathic test and inocula tion in chicken embryo s o r chickens.These isolates had typical shape of adenovirus and could not ag glutinate chicken red bloo d cells.They did not cause patholog ical changes in chick embry o fibro blasts,but the chicken embryo kidney cells became ro und w ith enhanced refractivity. And SPF chicken embry os we re also no t affected.After the1-day-old S PF chickens w ere subcutaneously or orally challenged w ith the isolate at the do se of1.0×1010TCID50,no obvious clinical sym ptom s ap-peared.A nd their bo dy weig ht and imm une o rgan w eight w ere no t affected.No lesions appeared in mo st org ans except temporary changes in liver.T herefo re,these FAV isolates have low pathogenicity and larg er bio-safe ty,and they m ay be better candidates for FAV vector.Key words:fow l adeno virus subtype A;biological characteristics;pathog enicityC orresponding author:QIN Ai-jian收稿日期:2010-04-14基金项目:国家高技术研究发展计划(2006AA10A205);江苏省高校自然科学重大基础研究项目(07KJA23021);国家科技攻关计划(2005DKA21205-8)作者简介:张明明(1982-),女,博士,研究方向为动物微生物学与免疫学,E-mail:s tealth.wings@通讯作者:秦爱建,E-mail:aij ian@yz 禽腺病毒(fow l adeno virus,FAV)属腺病毒科(Adenoviridae),是鸡、鸭、鹅等禽类常见的传染性病原体之一。
不同宿主源禽腺病毒分离株对雏鸡的致病性比较孙锦; 黄兵; 李珍祖; 杨军; 王可洲; 李云龙【期刊名称】《《家禽科学》》【年(卷),期】2008(000)001【摘要】鸭腺病毒1型病毒可作为优良的重组疫苗载体。
为了筛选低毒力的鸭腺病毒1型病毒毒株,分别用病毒QU株和HS株对20日龄SPF鸡进行攻毒,4d后检测其血清生化指标的变化情况并与对照组进行比较,同时取其肝脏进行病理组织学观察。
发现QU组的各项生化指标均没有明显变化,肝组织形态与对照组相同;HS 组的谷草转氨酶、碱性磷酸酶、胆碱脂酶和血淀粉酶显著降低,总蛋白、白蛋白和球蛋白极显著降低,并且肝细胞大量坏死。
结果表明,HS株病毒主要引起鸡肝脏和胰腺的损伤,具有较强的致病性;QU株病毒对雏鸡的生理状况几乎没有影响,毒力很弱,适合作为重组疫苗载体。
【总页数】3页(P4-6)【作者】孙锦; 黄兵; 李珍祖; 杨军; 王可洲; 李云龙【作者单位】山东师范大学生命科学学院济南 250014; 山东省农业科学院家禽研究所济南 250023; 山东中医药大学第二附属医院济南 250100; 山东省医学科学院实验动物中心济南 250002【正文语种】中文【中图分类】S852.65【相关文献】1.不同禽源贝氏隐孢子虫分离株对鹌鹑致病性的比较研究 [J], 高庚渠;张龙现;齐萌;王岩;徐利纳;王荣军;黄磊;张素梅;菅复春;宁长申2.不同地区101个禽源性大肠杆菌分离株的致病性试验 [J], 高崧;吴长新3.2株胶东地区Ⅰ群禽腺病毒分离株的致病性试验 [J], 董振杰;刘东;魏建平;佘锐萍4.2株鸡源血清4型禽腺病毒的分离鉴定及致病性研究 [J], 祝常椿;钱焱;满成连;刘源;杜银平;秦涛;陈素娟;彭大新5.2株贝氏隐孢子虫鸡源分离株对雏鸡的致病性比较 [J], 高庚渠;齐萌;黄磊;张素梅;马磊磊;菅复春;宁长申;张龙现因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
Ⅰ群禽腺病毒湖北株的分离鉴定及致病性研究“心包积水-肝炎综合征”(Hydropericardium hepatitis syndrome, HHS)是由血清4型Ⅰ群禽腺病毒(Fowl Adenovirus serotbe4, FAV 4)引起的一种新型家禽疾病。
典型症状是3-5周龄肉鸡、蛋鸡突然死亡,主要特征是心包蓄积黄色水样或胶冻样物、肝脏肿大、质脆色淡。
1963年Helmboldt等在美国的肉用仔鸡中首次发现该病,之后墨西哥、加拿大、日本、澳大利亚等许多国家均报道有本病的发生,说明腺病毒感染之广泛性。
1976年,我国台湾报道了该病,随后在辽宁、吉林、湖南、江苏和河南等省相继也发现该病的存在。
1987年在土耳其的安卡拉报道本病,1989年墨西哥报道了该病的发生,随后在伊拉克、印度、厄瓜多尔、秘鲁、智利、俄罗斯等地相继暴发了该病。
该病在国内已经成为一种严重危害养禽业发展的传染病,带来了严重的经济损失。
国内目前分离到血清1型、血清2型和血清8型的Ⅰ群禽腺病毒,为了解Ⅰ群禽腺病毒在湖北鄂西地区的血清型分布,感染状况及致病性。
本试验从湖北省鄂西不同地区采集疑似心包积水-肝炎综合征发病鸡群的肝脏,开展了病毒分离。
观察解剖时的病理变化并保存病料做病理组织切片。
将无菌采集的肝脏病料研磨后接种于SPF鸡胚然后盲传3代,收集第三代尿囊液提取DNA,应用PCR方法对分离毒株六邻体(hexon)基因进行扩增：根据设计的FAV-4型Ⅰ群禽腺病毒引物鉴别分离毒株的血清型。
结果在发病的蛋鸡中分离到3株Ⅰ群禽腺病毒。
测序结果表明分离的3株病毒基因同源率为100%,是属于同一株毒株。
本研究通过对分离毒株的hexon基因进行序列分析,病毒分离株与FAV4相似性为99.8%,与中国农业大学分离株相似性为99.3%,与其他血清型的相似性为69.6%-98.4%。
与Ⅱ群禽腺病毒的鸡出血性肠炎病毒和Ⅲ群禽腺病毒的减蛋综合征病毒的相似性为43.1-78.6%。
doidoi:10.3969/j.issn.1002-2481.2022.04.20山西农业科学2022，50（4）：591-597Journal of Shanxi Agricultural Sciences山西中部4型禽腺病毒遗传进化及其分离毒株致病性分析刘璐，王晨，张丹，高宇，程宇，谭世明，梁立滨，马海利（山西农业大学动物医学学院，山西太谷030801）摘要：为了解山西地区4型禽腺病毒（FAdV-4）的遗传进化情况及其致病性，为山西省FAdV-4的疫苗研发和防控策略制定提供理论依据，收集了山西中部地区太谷、祁县、介休、临汾、长治、交城、柳林等养鸡场11份疑似心包积水-肝炎综合征病鸡的肝脏组织样本，采用PCR方法进行FAdV-4检测，对阳性样品进行FAdV-4的Hexon 和Fiber-2蛋白的全基因序列扩增，将处理后的阳性病料接种于鸡肝癌细胞（LMH）进行病毒分离和PCR鉴定，测定分离毒株的TCID50，研究病毒对SPF鸡胚和SPF鸡的致病性。
结果表明，11份样品的FAdV-4检测均为阳性，经比对，11份样品中FAdV-4的Hexon和Fiber-2基因序列相同，与GenBank中不同FAdV分离株的同源性分别为67.7%~100%和43.2%~100%，其中，与GenBank中的基因C型FAdV-4毒株处于同一个分支，同源性分别为98.4%~100%和95.9%~100%，说明11份疑似样品均存在FAdV-4感染，且为同一毒株。
分离获得的1株FAdV-4（命名为SX2020）可在LMH细胞中良好复制并产生明显的细胞病变，对SPF鸡胚及SPF鸡均有致病性，感染后出现FAdV-4典型病变，并且病毒可以在感染鸡体内持续向外排毒达21~28d。
关键词：4型禽腺病毒；分离与鉴定；遗传进化；致病性中图分类号：S855.3文献标识码：A文章编号：1002-2481（2022）04-0591-07Analysis of Genetic Evolution of Avian Adenovirus Type4from Central Shanxi Province and Pathogenicity of Isolated Strain of the AdenovirusLIU Lu，WANG Chen，ZHANG Dan，GAO Yu，CHENG Yu，TAN Shiming，LIANG Libin，MA Haili（College of Veterinary Medicine，Shanxi Agricultural University，Taigu030801，China）Abstract：In order to understand genetic evolution and pathogenicity of avian adenovirus type4(FAdV-4)in Shanxi province,provide theoretical foundation for research and development of vaccines and prevention-control strategy of FAdV-4in Shanxi province,in this study,11liver samples of chicken suspected of hydropericardium hepatitis syndrome were collected from Taigu,Qixian,Jiexiu,Linfen,Changzhi,Jiaocheng and Liulin in central Shanxi province,and FAdV-4were detected by PCR method.The Hexon of FAdV-4and gene sequence amplification of Fiber-2protein of the positive samples were conducted.The positive samples treated were inoculated into chicken hepatoma cells(LMH)for virus isolation and PCR identification.The TCID50of the isolated strain was determined,and pathogenicity of the isolated virus to SPF chicken embryos and SPF chicken was studied.The results showed that all11samples were positive for FAdV-4,and the sequences of Hexon and Fiber-2genes of FAdV-4in11samples were the same.The homology of Hexon and Fiber-2gene with different FAdV isolates in GenBank was 67.7%-100%and43.2%-100%.They were in the same branch with FAdV-4C strain in GenBank,and the homology with FAdV-4was98.4%-100%and95.9%-100%,indicating that all the11suspected samples were infected by FAdV-4,and they were the same strain.One isolated FAdV-4virus(named SX2020)could replicate well in LMH cells and produce obvious cytopathic changes(CPE).The virus was pathogenic to SPF chicken embryos and SPF chicken,and the typical lesions of FAdV-4appeared after infection.The virus could continuously excrete outward in infected chicken for up to21-28d.Key words：Avian adenovirus type4（FAdv4）;isolation and identification;genetic evolution;pathogenicity禽心包积水-包涵体肝炎综合征（Hydroperica-rdium syndrome-inclusion body hepatitis，HPS-IBH）是一种主要由4型禽腺病毒（Fowl Adenovirus-4，FAdV-4）引起的高度传染性和高死亡率的新型家禽疾病[1]。
Ⅰ群禽腺病毒的分离鉴定和生物学特性研究及重组禽腺病毒的构建腺病毒最早发现于1953年,由于它们倾向于感染上皮细胞而被命名为腺病毒。
腺病毒属腺病毒科(Adenoviridae),共分为四个属即哺乳动物腺病毒属(Mastadenovirus)、禽腺病毒属(Aviadenovirus)、腺胸腺病毒属(Atadenovirus)和唾液腺病毒属(Siadenovirus)。
禽腺病毒是禽类常见的病毒之一,大部分在禽体内复制却不致病,少数引起轻微的病症。
对禽腺病毒的流行和变异国外有很多研究工作,国内的报道较少。
腺病毒作为载体,宿主范围广,致病性低,在机体内复制不发生整合,安全性高;能在增殖和非增殖细胞中感染和表达基因;能有效进行增殖,病毒滴度高;腺病毒载体应用方便,载体疫苗可经口服途径接种。
因此以腺病毒作为病毒载体具有独特的优势。
许多学者在禽类腺病毒载体方面做了很多研究工作,国内研究较晚,但是所研制的基因工程疫苗离临床应用还有一定距离。
目前,对禽腺病毒载体研究主要使用CMV启动子,获得了较好的表达效果,也有使用病毒自身的晚期启动子/先导序列(MLP/LS)的报道,但是尚未见到对两个启动子的重组病毒的免疫效果进行比较的报道。
本研究从外表健康禽群中随机采取泄殖腔拭子,根据禽腺病毒CELOV的全序列设计引物,PCR扩增了病毒基因组右末端 1.5Kbp的ITR片段。
结果表明:禽腺病毒在禽群中的流行比较广泛,鸡群的阳性率为23.8%(30/126),鸭群的阳性率为51.7%(15/29),鹅群的阳性率为17.3%(10/58)。
从鸡源、鸭源、鹅源ITR扩增阳性的样品中各选取3株,将ITR片段的PCR扩增产物克隆测序,并与CELOV、FAV-9、EDSV以及FAV-JS株的相应序列进行了比较。
结果表明:本次分离的9株禽腺病毒与血清1型的代表株CELOV和我们实验室早期分离株FAV-JS株在ITR片段上的同源性最高可达99.9%,最低也为94.7%;而与D亚群的FAV-9和禽腺病毒Ⅲ群的EDSV相比较,同源性较低。
I群禽腺病毒的分离鉴定及其致病性研究李晓林;王相芹;罗济冠;李明义【期刊名称】《中国动物检疫》【年(卷),期】2016(033)008【摘要】In order to evaluate infection status of fowl adenovirus groupI(FAV-I)in chickens,characteristic analysis of embryo lesion and cytopathic effect was carried out towards the collected 178 suspected samples.Virus was isolated and identified by RT-PCR,gene sequencing and BLAST test,and 25 strains of FAV-I were successfully isolated. Among all of them,20 strains have high homology with serotype 4,and 5 strains have high homology with serotype 8. Results of animal regression test indicated that the clinical symptoms and necropsy lesions of challenging chickens were consistent with natural infection.%为了解Ⅰ群腺病毒（FAV-I）在鸡群中的感染状况，对收集的178份疑似病料进行鸡胚病变、细胞病变特征分析，利用RT-PCR、基因测序和BLAST进行病毒的分离鉴定，成功分离出25株FAV-I，其中20株与血清4型同源性较高，5株与血清8型同源性较高。
动物回归试验结果表明，攻毒鸡的临床症状和病理变化与自然发病鸡基本一致。
畜牧兽医学报 2023,54(5):2050-2061A c t a V e t e r i n a r i a e t Z o o t e c h n i c a S i n i c ad o i :10.11843/j.i s s n .0366-6964.2023.05.026开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):一株鸭腺病毒3型的分离㊁鉴定及致病性分析曹秀芸1,刘吉文1,汤智辉1,郑紫怡1,闫丽萍1,2*,宋素泉1*(1.南京农业大学动物医学院动物健康与食品安全实验室,南京210000;2.南京农业大学免疫研究所,南京210000)摘 要:从现地分离一株3型鸭腺病毒(d u c k a d e n o v i r u s 3,D A d V -3)并命名为D A d V -3Y N 株,分析该毒株的基因特征与致病特性,本研究选用L MH 细胞进行病毒分离与纯化,并对Y N 株的h e x o n ㊁p e n t o n b a s e ㊁f i b e r 1和f i b e r 2基因进行测序分析㊂通过腿部肌肉注射病毒感染7日龄番鸭,观察番鸭精神状态,记录体重变化㊁脏器剖检特征㊁组织病理学变化㊁计算脏器载毒量㊁泄殖腔拭子排毒量以及血清生化等数据,同时测定法氏囊与脾内凋亡相关基因转录水平以探究Y N 株对宿主免疫功能的影响㊂结果显示,番鸭感染Y N 株后体重增长受到显著抑制(P <0.01;P <0.0001);体内各脏器均出现不同程度病变,攻毒组鸭的肝组织与肾组织脏器系数均大于对照组且在攻毒后第7天差异极显著(P <0.01);攻毒组番鸭血清内丙氨酸氨基转移酶㊁天冬氨酸氨基转移酶和尿素氮含量均显著高于对照组(P <0.001,P <0.0001);同时,法氏囊与脾内细胞凋亡相关基因m R N A 水平显著上升(P <0.01;P <0.001)㊂以上结果提示,Y N 株感染7日龄番鸭后,可以导致肝和肾等脏器损伤,同时可以诱导法氏囊与脾内细胞凋亡从而影响番鸭免疫功能㊂关键词:鸭腺病毒3型;基因特征;致病力;免疫功能中图分类号:S 858.32 文献标志码:A 文章编号:0366-6964(2023)05-2050-12收稿日期:2022-05-18基金项目:禽腺病毒亚单位疫苗平台的构建及应用项目(J B G S 202103)作者简介:曹秀芸(1997-),女,浙江绍兴人,硕士生,主要从事病毒分离工作,E -m a i l :1677588114@q q.c o m *通信作者:闫丽萍,主要从事动物传染病学研究,E -m a i l :y a n l i p i n g @n j a u .e d u .c n ;宋素泉,主要从事临床兽医相关研究,E -m a i l :s u q u a n .s o n g@n ja u .e d u .c n I s o l a t i o n ,I d e n t i f i c a t i o n a n d P a t h o g e n i c i t y A n a l y s i s o f a D u c k A d e n o v i r u s T y pe 3C A O X i u y u n 1,L I U J i w e n 1,T A N G Z h i h u i 1,Z H E N G Z i y i 1,Y A N L i p i n g 1,2*,S O N G S u qu a n 1*(1.A n i m a l H e a l t h a n d F o o d S a f e t y L a b o r a t o r y ,C o l l e g e o f V e t e r i n a r y Me d i c i n e ,N a n j i n g A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y ,N a n j i n g 210000,C h i n a ;2.N a n j i n g A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y I n s t i t u t e of I mm u n o l og y ,N a n j i n g 210000,C h i n a )A b s t r a c t :T h e p u r p o s e o f t h i s s t u d y wa s t o i s o l a t e a n o v e l D u c k a d e n o v i r u s 3(D A d V -3)Y N s t r a i n a n d e l u c i d a t e i t s g e n e t i c c h a r a c t e r i s t i c s a n d p a t h o g e n i c i t y.L MH c e l l s w e r e s e l e c t e d f o r v i -r u s i s o l a t i o n a n d p u r i f i c a t i o n ,a n d t h e n t h e v i r u s g e n e s ,i n c l u d i n g h e x o n ,pe n t o n b a s e ,f i b e r 1,a n d f i b e r 2w e r e s e q u e n c e d a n d a n a l y z e d .S e v e n -d a y s -o l d M u s c o v y d u c k s w e r e i n f e c t e d b y i n t r a -m u s c u l a r i n j e c t i o n i n t h e l eg s ,a n d th e m e n t a l s t a t e o f t h e d u c k s w a s o b s e r v e d .B e si d e s ,t h e b o d yw e i g h t c h a n g e s ,n e c r o p s y c h a r a c t e r i s t i c s o f o r g a n s ,h i s t o p a t h o l o g i c a l c h a n ge s ,v i r a l l o a d of o r -g a n s ,c l o a c a s w a b d e t o x i f i c a t i o n ,a n d s e r u m b i o ch e mi s t r y w e r e r e c o r d e d a n d a n a l y z e d .F u r t h e r -m o r e ,t h e t r a n s c r i p t i o n l e v e l s o f a p o p t o s i s -r e l a t e d g e n e s i n t h e b u r s a a n d t h e s pl e e n w e r e m e a s -u r e d t o e x p l o r e t h e e f f e c t o f Y N s t r a i n o n i mm u n e f u n c t i o n .T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e w e i gh t g a i n o f i n f e c t e d d u c k s w a s s i g n i f i c a n t l y i n h i b i t e d (P <0.01,P <0.0001),a n d d i f f e r e n t d e gr e e s o f l e s i o n s a p p e a r e d i n v a r i o u s o r g a n s .T h e c o e f f i c i e n t s o f l i v e r s a n d k i d n e y s o f t h e e x pe r i m e n t a l5期曹秀芸等:一株鸭腺病毒3型的分离㊁鉴定及致病性分析g r o u p w e r e l a r g e r t h a n t h o s e o f t h e c o n t r o l g r o u p,a n d t h e d i f f e r e n c e w a s e x t r e m e l y s i g n i f i c a n t o n t h e7t h d a y a f t e r t h e c h a l l e n g e.A l a n i n e a m i n o t r a n s f e r a s e,a s p a r t a t e a m i n o t r a n s f e r a s e,a n d u r e a n i t r o g e n i n t h e s e r u m o f t h e M u s c o v y d u c k s i n t h e c h a l l e n g e g r o u p w e r e s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n t h o s e i n t h e c o n t r o l g r o u p(P<0.001,P<0.0001).A t t h e s a m e t i m e,t h e m R N A l e v e l s o f a p-o p t o s i s-r e l a t e d g e n e s i n t h e b u r s a a n d t h e s p l e e n i n c r e a s e d s i g n i f i c a n t l y(P<0.01,P<0.001).(C o n c l u s i o n)T h e a b o v e r e s u l t s s u g g e s t t h a t D A d V-3Y N s t r a i n c a n d a m a g e l i v e r s a n d k i d n e y s w h e n c h a l l e n g i n g t h e7-d a y s-o l d M u s c o v y d u c k s,s i m u l t a n e o u s l y,i t c a n a f f e c t t h e i mm u n e f u n c-t i o n o f M u s c o v y d u c k s b y c a u s i n g a p o p t o s i s o f c e l l s i n t h e b u r s a a n d t h e s p l e e n.K e y w o r d s:d u c k a d e n o v i r u s3;g e n e t i c c h a r a c t e r i s t i c s;p a t h o g e n i c i t y;i mm u n e f u n c t i o n*C o r r e s p o n d i n g a u t h o r s:Y A N L i p i n g,E-m a i l:y a n l i p i n g@n j a u.e d u.c n;S O N G S u q u a n,E-m a i l: s u q u a n.s o n g@n j a u.e d u.c n鸭腺病毒(d u c k a d e n o v i r u s,D A d V)被发现最早可以追溯到1977年法国番鸭场中爆发的一场大规模疾病之中,在疫病中被感染的番鸭体重下降,站立不稳,直到1982年,B o u q u e t等[1]通过中和试验,确认该病毒不同于之前所知的禽腺病毒属成员,是一种新型腺病毒㊂2011年,H a r r a c h等[2]提议将这种病毒命名为2型鸭腺病毒(d u c k a d e n o v i r u s2, D A d V-2),但是因为缺乏全株基因序列,该提议并没有被国际病毒委员会(T h e I n t e r n a t i o n a l C o m-m i t t e e o n T a x o n o m y o f V i r u s e s,I C T V)所采纳㊂2014年,奥地利科学家M a r e k等[3]成功获得D A d V-2全基因组序列㊂同年在我国广东,部分番鸭养殖场也出现了类似D A d V-2感染的症状,对所分离毒株进行全基因组测序发现,分离株不同于先前的D A d V-2G R株,被认为是3型鸭腺病毒(d u c k a d e n o v i r u s3,D A d V-3)的候选毒株[4-5]㊂根据I C-T V最新分类,D A d V-2和D A d V-3均属于禽腺病毒属成员㊂目前,国内多地流行的鸭腺病毒仍以D A d V-3为主[6],被感染番鸭主要表现为肝㊁肾肿胀出血和轻微心包积液㊂发病率在40%~55%之间,死亡率可达35%~43%,给各地养殖场带来极大的经济损失[6]㊂2021年7月,云南某番鸭养殖场内7日龄雏鸭纷纷发病,呈现典型D A d V-3的感染症状,本实验室在此批病料中分离获得1株D A d V-3,命名为D A d V-3Y N株㊂本研究拟通过分析毒株的4段主要结构蛋白基因,并感染7日龄番鸭观察分析其临床症状㊁脏器变化㊁脏器载毒量以及法氏囊内细胞凋亡相关基因转录水平,对D A d V-3的遗传特性和致病特征做出全面系统描述,以期为临床对D A d V-3的科学防控提供理论支持㊂1材料与方法1.1试剂材料T r e l i e f T M A n i m a l G e n o m i c D N A K i t购自擎科生物有限公司,2ˑH i e f f P C R M a s t e r M i x㊁H i f a i r Ⅱ1s t S t r a n d c D N A S y n t h e s i s K i t㊁H i e f f U N I C O N q P C R S Y B R G r e e n M a s t e r M i x购自翌胜生物, R N A i s o l a t e r T o t a l R N A E x t r a c t i o n R e a g e n t购自诺唯赞生物公司;D L600D N A M a r k e r㊁D L2000 D N A M a r k e r㊁p M D T M18-T V e c t o r C l o n i n g K i t购自T a k a R a宝日医生物公司㊂1.2样品处理与病原检测2021年7月,云南某番鸭养殖场内7日龄番鸭广泛发病,主要临床病变为肝肾肿胀出血㊂无菌采集番鸭肝组织冷藏运送至实验室进行检测㊂取适量肝组织置于E P管内,充分研磨后取组织悬液上清,按照说明书提取组织D N A和R N A㊂使用常见鸭源病毒引物进行检测,P C R阳性产物连接T载体后送往擎科生物有限公司进行测序验证,每样质粒送3份样品㊂1.3病毒扩增与纯化选取雄性莱昂鸡肝癌(L e g h o r n m a l e h e p a t o-m a,L MH)细胞按照文献中内容进行病毒扩增,当80%以上细胞出现病变后收取培养上清[7]㊂采取有限稀释法进行病毒纯化,3轮有限稀释法后用P C R 方法检测无外源病毒,随后使用蚀斑试验进一步纯化病毒株㊂1.4病毒T C I D50测定L MH细胞接种于96孔板,根据文献中方法接毒[8-9],采用R e e d-M u e n c h两氏法计算T C I D50为107.8㊃m L-1㊂收集细胞培养上清用于后续试验㊂1502畜牧兽医学报54卷1.5Y N株主要结构蛋白基因序列分析参照N C B I上已有D A d V-3G D MM10株(MH777398)的h e x o n㊁p e n t o n b a s e㊁f i b e r1和f i-b e r2基因序列,设计5对引物进行序列扩增,引物由擎科生物有限公司合成,相关信息见下表㊂按照各自退火温度进行P C R扩增,在1%琼脂糖凝胶上电泳,切下明亮条带连接T载体后送往擎科生物有限公司进行测序㊂所得测序结果使用D N AMA N 软件进行序列拼接并使用M E G A7进行序列比对分析㊂表1测序引物信息表T a b l e1T h e i n f o r m a t i o n o f s e q u e n c i n g p r i m e r s引物名称P r i m e r n a m e 引物序列(5'ң3')S e q u e n c e(5'ң3')片段长度/b pP r o d u c t l e n g t h退火温度/ħA n n e a l i n g T e m p e r a t u r eD-h e x o n-A F:A T C G C G T A G A C G A A T GR:T G G C A G G T A A T C A G C A 140660D-h e x o n-B F:T A A T A T C C C G G C T T C T AR:G C T G A C T G T C G G T G G T T 156460D-p e n t o n F:T A G C C A A T A A C T T A C C G CR:A T C C T A G A G C A C G A C C T T 168162D-f i b e r1F:A A G G C A G G A T T C A G A G GR:C A G A A C G G A T A T G T T A G G T C 151357D-f i b e r2F:C G T A C C T A G C G A A G A T T GR:T G C C A T G C G A G T A C A T T 160053F.上游引物序列;R.下游引物序列㊂下同F.F o r w a r d p r i m e r s e q u e n c e.R.R e v e r s e p r i m e r s e q u e n c e.T h e s a m e a s b e l o w1.6D A d V-3Y N株动物致病性试验1.6.1试验动物分组与攻毒设计1日龄番鸭(购自南京特给力种植有限公司)适应性饲养至7日龄,随机分为攻毒组与对照组㊂对照组包含12只番鸭,攻毒组分为观察组与剖检组,每组各10只㊂攻毒组番鸭腿部肌肉注射0.3m L病毒液(3ˑ106.8㊃m L-1 T C I D50),对照组相同部位注射0.3m L P B S㊂攻毒组与对照组番鸭在不同房间饲养,并由不同人员管理,其余条件相同,连续观察14d,记录观察组番鸭临床变化,攻毒后每间隔2d称量番鸭体重并采集泄殖腔拭子㊂剖检组与对照组番鸭在攻毒后第3与第7天随机剖检3只㊂攻毒后14d安乐死剩余攻毒组与对照组番鸭并进行剖检㊂1.6.2剖检观察与切片制作番鸭静脉采血后处死㊂对番鸭进行解剖,观察有无脏器病变㊂称取心㊁肝㊁肾重量并计算脏器系数,脏器系数的计算公式为:脏器重量(g)/体重(g)*100%㊂采集脏器保存于-80ħ冰箱准备后续检测病毒,固定攻毒后第7天番鸭相应脏器,送往武汉皮诺飞生物公司制作切片㊂1.6.3血清生化检测攻毒后第3㊁7和14天分别采集攻毒组与对照组血清,使用南京建成生物工程研究所检测试剂盒检测番鸭血清内丙氨酸氨基转移酶(a l a n i n e a m i n o t r a n s f e r a s e,A L T)㊁天冬氨酸氨基转移酶(a s p a r t a t e a m i n o t r a n s f e r a s e,A S T)和尿素氮(u r e a n i t r o g e n,B U N)三种酶含量,每个样本重复检测3次㊂参照说明书计算分析酶活性㊂1.6.4番鸭排毒量与脏器病毒载量测定攻毒后第3㊁7和14天分别采集攻毒组与对照组番鸭脏器,攻毒后每隔2d采集泄殖腔拭子㊂依照说明书步骤提取病毒D N A㊂以D A d V-3Y N株h e x o n基因序列为模板,使用P r i m e r5软件设计引物,引物信息见表2,引物由擎科生物有限公司合成㊂以实验室所构建T-h e x o n质粒为阳性模板,按照文献方法[10],10倍比稀释制作荧光定量标准曲线㊂q P C R检测脏器与泄殖腔拭子所含病毒,将攻毒组C t值数据带入标准曲线公式内计算拷贝数㊂每个样品重复3次㊂根据10c o p i e s病毒量为界限, 3个重复孔C t值大于35的判定为阴性,反之则判断为阳性㊂1.6.5法氏囊与脾凋亡基因m R N A转录水平测定 T R I z o l法提取法氏囊和脾总R N A并反转录成c D N A,S Y B R G r e e n q P C R进行检测,所得数据基于2-әәC t的方式进行计算,获得促凋亡基因25025期曹秀芸等:一株鸭腺病毒3型的分离㊁鉴定及致病性分析B a x,B a k-1,c a s p a s e-3和c a s p a s e-9以及抑凋亡基因B c l-2的转录水平㊂引物参考现有文献内序列,相关信息见表3,由擎科生物有限公司合成㊂表2D A d V-3病毒定量P C R引物信息T a b l e2P r i m e r i n f o r m a t i o n o f q u a n t i t a t i v e P C R d e t e c t i o n f o r D A d V-3引物名称P r i m e r n a m e 引物序列(5'ң3')S e q u e n c e(5'ң3')片段长度/b pP r o d u c t l e n g t hD A d V-3-F G T C T G C T C A G G T A C G C T T A A T T CD A d V-3-R T C T A C T G C C T G A T T C C A T A G T G C149表3引物信息表T a b l e3P r i m e r i n f o r m a t i o n引物名称P r i m e r n a m e 引物序列(5'ң3')S e q u e n c e(5'ң3')片段长度/b pP r o d u c t l e n g t hB a x[11]F:A A AC C A A G C G G C T C A G C G A G TR:G G C C C C A G T T G A A G G C T C C G T C C 162B a k-1[12]F:G G T G A GC C A G C G T T A G A A A GR:G C T C C T G T C A C C A T G T T C C T 135B c l-2[12]F:G G A G G GC T G A A A G A A A A A GR:T A T G A T G C G G C A C G A C T G 213c a s p a s e-3[12]F:C G G A C T G T C A T C T C G T T C A G G C A CR:G T C C T T C A T C G C C A T G G C T T A G C 200c a s p a s e-9[11]F:A T C C T G T C C C A C G G C T G T C AR:T C G G G T G A A T C G C A A T C C A C T 212β-a c t i n[12]F:A T G T C G C C C T G G A T T T C GR:C A C A G G A C T C C A T A C C C A A G A A1651.7数据分析本研究中使用G r a p h P a d P r i s m整理试验数据并绘图,数据均表示为 平均值ʃ标准误差(m e a nʃS E M) ,通过双因素方差分析(T w o-w a y A N O V A)对不同组数据之间的差异性进行统计学检验㊂*Pɤ0.05被认为具有显著性差异㊂2结果2.1病毒的分离番鸭样品经过检测发现禽流感病毒㊁减蛋综合征病毒㊁4型禽腺病毒等常见病原均为阴性,但D A d V-3呈强阳性,同时伴随着鸭瘟病毒(d u c k e n-t e r i t i s v i r u s,D E V)和番鸭细小病毒(M u s c o v y d u c k p a r v o v i r u s,M D P V)感染㊂P C R产物经过测序比对确认无误㊂选择L MH细胞进行病毒分离,病毒接种于L MH细胞24h后,细胞出现典型的细胞病变(图1A):细胞皱缩呈现葡萄串状,大量死细胞脱落漂浮于培养上清中,与腺病毒接毒后病变相似[13]㊂病毒在细胞上多次传代均可见一致的细胞病变㊂收取细胞培养上清,P C R结果显示培养上清中可扩增得到633b p的特异性条带(图1B)㊂2.2Y N株基因进化分析鸭腺病毒主要依据h e x o n与f i b e r等基因序列的同源性进行种属分类[6,14]㊂序列比对结果显示(图2),Y N株h e x o n,p e n t o n b a s e和f i b e r1基因与D A d V-3G D MM10株以及C H-G D-12-2014株高度同源(100%);f i b e r2在第1338个碱基处存在突变,由腺嘌呤(A)突变为胞嘧啶(C),翻译的氨基酸由异亮氨酸变为谷氨酰胺,与G D MM10等毒株相同源性99.93%㊂与禽腺病毒的一些血清型相比,Y N 株与G o o s e a d e n o v i r u s-4同源性更高,相比之下禽腺病毒虽然也能感染鸭,但与Y N株同源性相对较低㊂3502畜 牧 兽 医 学 报54卷A.接毒后L MH 细胞产生病变;B .D A d V -3P C R 后电泳结果:M.D L 2000D N A M a r k e r ;1.阳性对照;2.细胞培养上清;3.阴性对照A.C y t o p a t h i c e f f e c t (C P E )w a s p r o d u c e d i n L MH c e l l s p o s t -i n f e c t i o n o f t h e v i r a l i s o l a t e ;B .E l e c t r o ph o r e s i s r e s u l t s o f D A d V -3a f t e r P C R :M.D L 2000D N A M a r k e r ;1.P o s i t i v e ;2.C e l l c u l t u r e s u p e r n a t a n t ;3.N e ga t i v e c o n t r o l 图1 Y N 株接毒后细胞病变与P C R 检测F i g .1 C y t o pa t h i c e f f e c t d e t e c t e d i n L M H c e l l a n d P C R d e t e c t i o n o f Y N s t r a in A.h e x o n 基因进化树;B .p e n t o n b a s e 基因进化树;C .f i b e r 1基因进化树;D.f i b e r 2基因进化树㊂方框内为本研究中Y N 株A.G e n e t i c e v o l u t i o n a r y t r e e o f h e x o n g e n e ;B .G e n e t i c e v o l u t i o n a r y t r e e o f p e n t o n b a s e g e n e ;C .G e n e t i c e v o l u t i o n a r y tr e e o f f i b e r 1g e n e ;D.G e n e t i c e v o l u t i o n a r y t r e e o f f i b e r 2g e n e .T h e Y N s t r a i n w a s s h o w e d b y a bo x 图2 D A d V -3Y N 株基因进化树F i g .2 G e n e t i c e v o l u t i o n a r yt r e e o f D A d V -3Y N s t r a i n 2.3 攻毒后番鸭临床症状7日龄番鸭攻毒后出现精神沉郁,蹲卧好静等情况,未见死亡病例㊂对照组番鸭精神状态良好,生长发育正常㊂每隔2d 对番鸭进行称重(图3),结果显示,攻毒组番鸭体重在第7与第9天显著低于对照组(P <0.0001),攻毒后第11天攻毒组仍显著低于对照组(P <0.05)㊂直至攻毒后第13天,两组番鸭体重差异不显著㊂结果表明,7日龄番鸭攻毒后体重增长受到一定抑制㊂2.4 攻毒后番鸭脏器病变2.4.1 脏器解剖学病变 雏鸭通过腿部肌肉注射感染病毒后,在感染后第3㊁7和第14天进行剖检,发现攻毒组番鸭出现轻微心包积液(图4A ),心表观未见明显变化㊂在第3㊁7天肝组织略显肿大并45025期曹秀芸等:一株鸭腺病毒3型的分离㊁鉴定及致病性分析*.P <0.05;**.P <0.01;***.P <0.001;****.P <0.0001,下同*.P <0.05;**.P <0.01;***.P <0.001;****.P <0.0001.T h e s a m e a s b e l o w图3 攻毒后番鸭体重(n =5)F i g .3 B o d y w e i g h t o f M u s c o v y du c k s a f t e r i n f e c t i o n (n =5)存在出血点,第14天肝充血肿胀,边缘略显钝圆,存在明显出血点(图4B )㊂此外,攻毒组番鸭肾组织存在不同程度的肿胀,颜色加深(图4C )㊂脾淤血肿胀,边缘钝圆,颜色暗红(图4D )㊂2.4.2 脏器组织病理学变化 固定脏器相应部位后制作切片,显微镜观察未发现心肌细胞出现明显变化㊂攻毒组番鸭肝细胞变性,染色不均,肝细胞排列混乱,肝索结构消失㊂脾淤血,大量红细胞分布于脾细胞间㊂攻毒后番鸭肾组织内肾小球萎缩,与小囊间间隙增大且肾小囊内血细胞增多,肾小管上皮细胞变性㊁肿大突入管腔内导致管腔狭窄,小管结构不清(图5)㊂A.番鸭出现心包积液;B .番鸭肝组织病变;C .攻毒后番鸭肾组织病变;D.番鸭脾组织病变㊂心包内积液由黑色箭头指出,肝组织出血点由白色箭头指出㊂d pi 表示攻毒后天数A.P e r i c a r d i a l e f f u s i o n a f t e r i n f e c t i o n ;B .P a t h o l o g i c a l c h a n g e s o f l i v e r s ;C .P a t h o l o g i c a l c h a n g e s o f k i d n e y s ;D.P a t h o l o gi -c a l c h a n g e s o f s p l e e n s .P e r i c a r d i a l e f f u s i o n w a s s h o w e d b y b l a c k a r r o w s a n d b l e e d i n g p o i n t i n l i v e r s w a s s h o w e d b y w h i t e a r -r o w s .d p i m e a n s d a ys p o s t i n f e c t i o n 图4 攻毒后番鸭脏器病变F i g .4 O r g a n s p a t h o l o g i c a l c h a n g e s o f M u s c o v y du c k s a f t e r i n f e c t i o n 2.4.3 脏器系数变化 通过计算脏器系数,发现攻毒组与对照组番鸭心脏系数无明显差异,攻毒组番鸭的肝脏与肾脏系数在攻毒后均大于对照组,在攻毒后第7天存在显著差异(图6A ,P <0.01),提示攻毒后肝㊁肾存在一定肿胀㊂2.4.4 血清生化指标变化 检测血清A L T ,A S T 以及B U N 三种酶的含量㊂结果显示,血清内B U N 含量在攻毒后第3㊁7㊁14天都显著高于对照组(P <0.001)㊂A L T 在攻毒后第3㊁7与14天差异极显著(P <0.01,P <0.001)㊂攻毒组血清A S T5502畜 牧 兽 医 学 报54卷图5 不同脏器病理切片(400ˑ)F i g .5 P a t h o l o g i c a l s e c t i o n o f d i f f e r e n t o r ga n s (400ˑ)A.心脏系数;B .肝脏系数;C .肾脏系数;D.血清B U N 含量;E .血清A L T 含量;F .血清A S T 含量A.C a r d i a c c o e f f i c i e n t ;B .L i v e r c o e f f i c i e n t ;C .K i d n e y co e f f i c i e n t ;D.L e v e l o f B U N ;E .L e v e l o f A L T ;F .L e v e l o f A S T 图6 脏器系数与血清生化指标(n =3)F i g .6 O r ga n c o e f f i c i e n t a n d s e r u mb i oc h e m i c a l i nde x (n =3)含量在攻毒后第3天(P <0.01),第7天(P <0.001)和第14天(P <0.01)与对照组相比差异极显著(图6B )㊂结果提示攻毒后番鸭肝与肾均存在一定损伤㊂2.5 攻毒后番鸭排毒量与脏器载毒量使用荧光定量P C R 对所采集泄殖腔拭子以及不同组织脏器进行检测,结果显示,攻毒后番鸭排毒量持续在102~103c o pi e s ㊃m L -1,攻毒后第1天排毒量最高,直至试验结束仍可向环境中持续排毒(图7A )㊂攻毒后番鸭肝与心载毒量较高,在攻毒后第7和14天分别达105和104c o p i e s ㊃g -1,攻毒后第7与14天,肝载毒量逐渐升高,与其他脏器差异显著(P <0.01,P <0.001,P <0.0001)㊂攻毒后脾脏载毒量较其他脏器略低,约103~104c o p i e s ㊃g -1㊂试验过程中对照组番鸭的泄殖腔拭子与脏器载毒量检测均呈阴性㊂2.6 法氏囊与脾凋亡相关基因转录水平由结果可知(图8㊁9),攻毒后番鸭法氏囊与脾65027502 5期曹秀芸等:一株鸭腺病毒3型的分离㊁鉴定及致病性分析A.攻毒后试验组番鸭泄殖腔排毒情况;B.攻毒后3d脏器载毒量;C:攻毒后7d脏器载毒量;D.攻毒后14d脏器载毒量㊂数据分析采用双因素方差分析(n=3)㊂相同字母表示两组数据无显著差异,不同字母表示两组数据存在显著差异,肝与其他脏器差异性用*表示A.E x p e l l i n g o f t o x i n i n c l o a c a o f e x p e r i m e n t d u c k s a f t e r i n f e c t i o n;B.O r g a n v i r u s l o a d i n3d a y s p o s t-c h a l l e n g e;C.O r g a n v i r u s l o a d i n7d a y s p o s t-c h a l l e n g e;D.O r g a n v i r u s l o a d i n14d a y s p o s t-c h a l l e n g e.D a t a w e r e a n a l y z e d u s i n g t w o-w a y A N O-V A(n=3).T h e s a m e l e t t e r i n d i c a t e s n o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e t w o g r o u p s a n d t h e d i f f e r e n t l e t t e r s i n d i c a t e s i g-n i f i c a n t d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e t w o g r o u p s o f d a t a,t h e d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e l i v e r a n d o t h e r o r g a n s i s i n d i c a t e d b y*图7攻毒后试验组番鸭泄殖腔排毒量与脏器组织病毒载量F i g.7V i r a l l o a d o f c l o a c a l s w a b a n d v i s c e r a i n e x p e r i m e n t d u c k s a f t e r i n f e c t i o n图8法氏囊凋亡相关基因转录水平(n=3)F i g.8T r a n s c r i p t i o n l e v e l o f a p o p t o s i s-r e l a t e d g e n e s i n b u r s a(n=3)畜 牧 兽 医 学 报54卷图9 脾凋亡相关基因转录水平(n =3)F i g .9 T r a n s c r i p t i o n l e v e l o f a p o p t o s i s -r e l a t e d g e n e s i n s pl e e n (n =3)促凋亡基因转录水平出现不同程度升高㊂攻毒组番鸭在攻毒后第7天法氏囊内4种促凋亡基因B a x ㊁B a k -1㊁c a s p a s e -3和c a s pa s e -9转录水平显著高于对照组(P <0.0001),攻毒后第14天B a x (P <0.01)㊁B c l -2(P <0.001)㊁c a s pa s e -3(P <0.0001)和c a s pa s e -9(P <0.0001)也显著高于对照组㊂抑凋亡基因B c l -2则在攻毒后第7天(P <0.0001)和第14天(P <0.01)显著下降,B c l -2/B a x 比值也在攻毒后显著下降(P <0.001,P <0.0001)㊂结果表明攻毒后番鸭法氏囊内细胞凋亡水平上升㊂攻毒后第7天番鸭脾内凋亡相关基因转录水平均显著高于对照组(P <0.0001),抑凋亡基因转录水平显著下降(P <0.01,P <0.0001);攻毒后第14天B a x (P <0.01)㊁B a k -1(P <0.001)和c a s p a s e -3㊁c a s pa s e -9(P <0.0001)也显著升高㊂B c l -2/B a x 比值也在攻毒后第7与14天显著下降,以上数据提示攻毒后番鸭脾内细胞凋亡水平上升㊂3 讨 论2014年从广东番鸭体内分离到第一株D A d V -3后[15],国内报告D A d V -3临床感染的情况越来越多㊂2018年,S h i 等[14]自福建㊁浙江㊁安徽和广东分离得到4株鸭腺病毒㊂2016 2019年间,S h i 等[6]分离得到7株D A d V -3,全基因组测序发现O R F 67存在缺失,可能是新的突变株㊂2018 2020年间,广东㊁福建与广西三省番鸭养殖场发生多起D A d V -3感染病例,Y i n 等[16]从病料中分离获得12株D A d V -3㊂本实验室从来自云南的病料中分离得到1株D A d V -3Y N 株,序列比对后发现该毒株与目前在国内流行的C H -G D -12-2014株以及G D MM 10株等相应片段相似度为99.93%~100%㊂不同于现有突变株存在的O R F 67截断突变,Y N 株f i b e r 2蛋白长短未改变,也未见对盲肠存在明显致病效果[6]㊂目前对禽腺病毒的研究发现,毒株的致病能力强弱主要由h e x o n ,f i b e r 2蛋白决定[17-18],有研究表明,f i -b e r 2作为保护性抗原可针对病原感染提供免疫保护[19-20],也有学者认为,f i b e r 1在病毒侵染宿主过程中起到主要作用[21]㊂因此,研究4段主要结构蛋白的基因序列对预测分离株的毒力有一定的指导意义㊂之前的研究报道中,鸭腺病毒可以抑制受感染番鸭的生长发育[1,4],同属的禽腺病毒也存在相同的抑制作用[22]㊂本研究中感染番鸭精神状态不佳,体重增长受到显著抑制,与之前研究相一致㊂对攻毒后番鸭脏器进行检测发现各脏器均存在病毒扩增,在肝组织中拷贝量最高㊂番鸭感染D A d V -3后可向环境中持续排毒,这可能对同群番鸭造成感染风险㊂这也与之前对禽腺病毒的研究相符合:禽腺病毒可以通过口-粪传播途径造成水平传播[23]㊂85025期曹秀芸等:一株鸭腺病毒3型的分离㊁鉴定及致病性分析剖检结果显示,番鸭感染Y N株后肝㊁肾等脏器均出现一定病变,与之前C H-G D-12-2014株感染后病变相似[4]㊂相应脏器固定后切片染色,可观察到相对应的组织学病变,同之前S h i等[6]与Y i n等[16]所观察的D A d V-3导致的组织病理学变化相似㊂A L T㊁A S T和B U N分别在肝与肾细胞受到损伤时逸出到血液中[24],因此,本研究攻毒组番鸭血清A L T㊁A S T和B U N含量升高也从侧面证明了番鸭的肝与肾受损㊂B a x与B a k-1作为同一促凋亡家族蛋白,两者之间可形成二聚体激活c a s p a s e[11,25];c a s p a s e-9为凋亡初始阶段发生作用蛋白,c a s p a s e-3则为凋亡的 执行者 ,一旦被激活则使细胞发生不可逆的凋亡[26]㊂本研究中,攻毒组番鸭在感染后法氏囊与脾内B a x等促凋亡基因的表达量均显著上升,B c l-2/ B a x则在攻毒后显著降低,提示法氏囊与脾功能可能受到损害㊂法氏囊是禽类主要免疫器官,在体液免疫中起到重要作用,与宿主抵抗病毒时抗体水平息息相关[27]㊂一些疾病如传染性法氏囊损伤法氏囊后,宿主的免疫功能受到影响[28]㊂研究发现,当传染性法氏囊与禽腺病毒共同感染鸡时,可以导致宿主免疫反应降低以及死亡率增加[29]㊂脾是全身免疫的重要器官,与禽类的先天性免疫息息相关[30],在病毒侵入机体时积极响应[31]㊂已有研究发现,当一些病原感染机体后通过使脾坏死从而削弱宿主的免疫能力[32]㊂本研究中番鸭中枢免疫与外周免疫器官均受到一定影响,势必会增加其他病原的共感染风险㊂流行病学调查发现禽类养殖场内常存在腺病毒与其他病原混合感染的情况[33-35],亦有报道称D A d V-3与其他病原混合感染后可能会导致D A d V-3临床症状加剧[14,16]㊂本研究检测发现,D A d V-3Y N株存在与D E V㊁M D P V混合感染的情况,番鸭免疫机能受到影响,可能导致养殖场内番鸭在混合感染的情况下D A d V-3的临床症状加剧或者其他病原在番鸭体内致病能力增强,这也从侧面解释了实验室感染D A d V-3Y N株后致病能力弱于当地番鸭的临床感染㊂4结论本研究自云南番鸭养殖场分离得到1株鸭腺病毒,通过对分离株的主要基因序列进行分析证实该病毒为D A d V-3㊂致病性试验证实该病毒以较为温和的方式在番鸭群体中流行,感染番鸭后影响其生长性能,损害多个脏器,且导致番鸭持续向环境中排毒,还可以影响番鸭的免疫功能㊂因此,本研究对D A d V-3的分离鉴定和早期防控都具有重要意义㊂参考文献(R e f e r e n c e s):[1] B O U Q U E T J F,MO R E A U Y,M C F E R R A N J B,e ta l.I s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i s a t i o n o f a n a d e n o v i r u si s o l a t e d f r o m M u s c o v y d u c k s[J].A v i a n P a t h o l,1982,11(2):301-307.[2] HA R R A C H B,B E N KÖM,B O T H G W,e t a l.F a m i l ya d e n o v i r i d a e[M]//K I N G A M Q,A D AM S M J,C A R S T E N S E B,e t a l.V i r u s T a x o n o m y:C l a s s i f i c a t i o n a n d N o m e n c l a t u r e o f V i r u s e s:N i n t hR e p o r t o f t h e I n t e r n a t i o n a l C o mm i t t e e o n T a x o n o m yo f V i r u s e s.S a n D i e g o:E l s e v i e r,2011:125-141.[3] MA R E K A,K A JÁN G L,K O S I O L C,e t a l.C o m p l e t eg e n o m e s e q u e n c e s o f p i g e o n a d e n o v i r u s1a n d d u c ka d e n o v i r u s2e x t e n d t h e n u mb e r o f s p ec i e s w i t h i n t h eg e n u s A v i a d e n o v i r u s[J].V i r o l o g y,2014,462-463:107-114.[4] Z HA N G X H,Z HO N G Y J,Z HO U Z H,e t a l.M o l e c u l a r c h a r a c t e r i z a t i o n,p h y l o g e n y a n a l y s i s a n dp a t h o g e n i c i t y o f a M u s c o v y d u c k a d e n o v i r u s s t r a i ni s o l a t e d i n C h i n a i n2014[J].V i r o l o g y,2016,493:12-21.[5]张新珩,蔺文成,周振海,等.新型鸭Ⅲ型腺病毒的分离鉴定及遗传进化分析[J].中国兽医学报,2017,37(1):29-32.Z HA N G X H,L I N W C,Z HO U Z H,e t a l.I s o l a t i o n,i d e n t i f i c a t i o n a n d m o l e c u l a r e v o l u t i o n a n a l y s i s o f t h en e w d u c k a d e n o v i r u s t y p eⅢv i r u s[J].C h i n e s eJ o u r n a l o f V e t e r i n a r y S c i e n c e,2017,37(1):29-32.(i n C h i n e s e)[6] S H I X J,Z HA N G X Y,S U N H W,e t a l.I s o l a t i o n a n dp a t h o g e n i c c h a r a c t e r i z a t i o n o f d u c k a d e n o v i r u s3m u t a n t c i r c u l a t i n g i n C h i n a[J].P o u l t S c i,2022,101(1):101564.[7]武宁.L MH细胞感染禽腺病毒血清4型早期m i R N A s和m R N A s表达变化研究[D].杨凌:西北农林科技大学,2020.WU N.I n t e r a c t i o n s a m o n g e x p r e s s e d m i c r o R N A s a n dm R N A s i n t h e e a r l y s t a g e s o f f o w l a d e n o v i r u sa e r o t y p e4-i n f e c t e d l e g h o r n m a l e h e p a t o c e l l u l a r c e l l s[D].Y a n g l i n g:N o r t h w e s t A&F U n i v e r s i t y,2020.(i nC h i n e s e)[8]徐鑫.坦布苏病毒的遗传变异分析及弱毒疫苗对不同日龄雏鸭的免疫保护效果评价[D].泰安:山东农9502畜牧兽医学报54卷业大学,2020.X U X.G e n e t i c v a r i a t i o n a n a l y s i s o f t e m b u s u v i r u s a n de v a l u a t i o n of i m m u n e p r o t e c t i v e e f f e c t o f a t t e n u a t e dv a c c i n e o n d u c k l i n g s o f d i f f e r e n t a g e[D].T a i a n:S h a n d o n g A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y,2020.(i n C h i n e s e) [9]任斌斌.鸭坦布苏病毒感染雏鸭和小鼠的动物模型的研究[D].广州:华南农业大学,2019.R E N B B.P r e p a r a t i o n o f T e m b u s u v i r u s d u c k l i n g sa n d m i c e m o d e l s[D].G u a n g z h o u:S o u t h C h i n aA g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y,2019.(i n C h i n e s e)[10]陈雨晴.血清4型禽腺病毒J S株的分离鉴定及其h e x o n蛋白单克隆抗体的制备[D].南京:南京农业大学,2020.C H E N Y Q.I s o l a t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f s e r o t y p e4f o w l a d e n o v i r u s J S s t r a i n a n d p r e p a r a t i o n o fm o n o c l o n a l a n t i b o d y a g a i n s t h e x o n p r o t e i n[D].N a n j i n g:N a n j i n g A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y,2020.(i nC h i n e s e)[11] W E I Z J,N I E G H,Y A N G F,e t a l.I n h i b i t i o n o f R O S/N L R P3/C a s p a s e-1m e d i a t e d p y r o p t o s i s a t t e n u a t e sc ad m i u m-i n d u ce d a p o p t o s i s i n d u c k r e n a l t u b u l a re p i t h e l i a l c e l l s[J].E n v i r o n P o l l u t,2021,273:115919.[12] WA N G C,N I E G H,Y A N G F,e t a l.M o l y b d e n u ma n d c a d m i u m c o-i n d u c e o x i d a t i v e s t r e s s a n d a p o p t o s i st h r o u g h m i t o c h o n d r i a-m e d i a t e d p a t h w a y i n d u c k r e n a lt u b u l a r e p i t h e l i a l c e l l s[J].J H a z a r d M a t e r,2020,383:121157.[13] C H E N L,Y I N L J,P E N G P,e t a l.I s o l a t i o n a n dc h a r a c t e r i z a t i o n o f a n o v e l f o w l ade n o v i r u s s e r o t y p e8as t r a i n f r o m C h i n a[J].V i r o l S i n,2020,35(5):517-527.[14] S H I S H,L I U R C,WA N C H,e t a l.I s o l a t i o n a n dc h a r a c t e r i z a t i o n o fd u c k a de n o v i r u s3c i r c u l a t i n g i nC h i n a[J].A r c h V i r o l,2019,164(3):847-851.[15]周镇海.鸭腺病毒3型基因组序列分析及致病性研究[D].广州:华南农业大学,2016.Z HO U Z H.G e n o n m i c s e q u e n c e a n a l y s i s a n dp a t h o g e n e c i t y s t u d y o f d u c k a d e n o v i r u s3[D].G u a n g z h o u:S o u t h C h i n a A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y,2016.(i n C h i n e s e)[16] Y I N L J,Z HO U Q,MA I K,e t a l.E p i d e m i o l o g i c a li n v e s t i g a t i o n o f d u c k a d e n o v i r u s3i n s o u t h e r n C h i n a,d u r i n g2018-2020[J].A v i a n P a t h o l,2022,51(2):171-180.[17] Z HA N G Y,L I U A J,WA N G Y N,e t a l.A s i n g l ea m i n o a c i d a t r e s i d u e188o f t h e H e x o n p r o t e i n i sr e s p o n s i b l e f o r t h e p a t h o g e n i c i t y o f t h e e m e r g i n gn o v e l v i r u s f o w l a d e n o v i r u s4[J].J V i r o l,2021,95(17):e0060321.[18] X I E Q,WA N G W K,L I L Y,e t a l.D o m a i n i n F i b e r-2i n t e r a c t e d w i t h K P N A3/4s i g n i f i c a n t l y a f f e c t s t h er e p l i c a t i o n a n d p a t h o g e n i c i t y o f t h e h i g h l y p a t h o g e n i cF A d V-4[J].V i r u l e n c e,2021,12(1):754-765.[19] C H E N L,Y I N L J,Z HO U Q F,e t a l.I mm u n o g e n i c i t y a n d p r o t e c t i v e e f f i c a c y o fr e c o m b i n a n t f i b e r-2p r o t e i n i n p r o t e c t i n g S P Fc h i c k e n s a g a i n s t f o w l ade n o v i r u s4[J].V a c c i n e,2018,36(9):1203-1208.[20] Y I N L J,C H E N L,L U O Y Y,e t a l.R e c o m b i n a n tf i b e r-2p r o t e i n p r o t e c t s M u s c o v y d u c k s ag a i n s t d u c ka d e n o v i r u s3(D A d V-3)[J].V i r o l o g y,2019,526:99-104.[21] Z O U X H,R O N G Y J,G U O X J,e t a l.F i b e r1,b u tn o t f i b e r2,i s t h e e s s e n t i a l f i b e r g e n e f o r f o w la d e n o v i r u s4(F A d V-4)[J].J G e n V i r o l,2021,102:001559.[22] T A N G Z H,L I U M,G A O Z S,e t a l.P a t h o g e n i c i t ya n d v i r u s s h e d d i n g ab i l i t y o f f o w l a d e n o v i r u s s e r o t y p e4t o d u c k s[J].V e t M i c r o b i o l,2022,264:109302.[23] Z HA O J,Z HO N G Q,Z HA O Y,e t a l.P a t h o g e n i c i t ya n d c o m p l e t e g e n o m e c h a r a c t e r i z a t i o n o f f o w la d e n o v i r u s e s i s o l a t e d f r o m c h i c k e n s a s s o c i a t e d w i t hi n c l u s i o n b o d y h e p a t i t i s a n d h y d r o p e r i c a r d i u ms y n d r o m e i n C h i n a[J].P L o S O n e,2015,10(7):e0133073.[24] Y U X L,WA N G Z Z,C H E N H,e t a l.S e r o l o g i c a l a n dp a t h o g e n i c a n a l y s e s o f f o w l a d e n o v i r u s s e r o t y p e4(F A d V-4)s t r a i n i n M u s c o v y d u c k s[J].F r o n tM i c r o b i o l,2018,9:1163.[25] HU X Y,C H I Q R,L I U Q Q,e t a l.A t m o s p h e r i c H2St r i g g e r s i mm u n e d a m a g e b y a c t i v a t i n g t h e T L R-7/M y D88/N F-κB p a t h w a y a n d N L R P3i n f l a mm a s o m ei n b r o i l e r t h y m u s[J].C h e m o s p h e r e,2019,237:124427.[26] L A R S E N B D,R AM P A L L I S,B U R N S L E,e t a l.C a s p a s e3/c a s p a s e-a c t i v a t e dD N a s e p r o m o t e c e l ld i f fe r e n t i a t i o n b y i n d u c i n g D N A s t r a n d b r e a k s[J].P r o c N a t l A c a d S c i U S A,2010,107(9):4230-4235.[27] N I U Y J,S U N Q Q,S H I Y Y,e t a l.I mm u n o s u p p r e s s i v e p o t e n t i a l o f f o w l a d e n o v i r u ss e r o t y p e4[J].P o u l t S c i,2019,98(9):3514-3522.[28] S HA R MA J M,K I M I J,R A U T E N S C H L E I N S,e ta l.I n f e c t i o u sb u r s a l d i s e a s e v i r u s o fc h i c k e n s:p a t h o g e n e s i s a n d i mm u n o s u p p r e s s i o n[J].D e v C o m pI mm u n o l,2000,24(2-3):223-235.0602Copyright©博看网. 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2021—2022年我国部分地区Ⅰ群禽腺病毒的分离鉴定及Hexon基因序列分析刘兆洁;许芬芬;李雨泽;刘梦凡;苏镜文;李德钊;黄淑坚;梅堃【期刊名称】《中国家禽》【年(卷),期】2024(46)5【摘要】为了解2021—2022年我国禽类养殖场中Ⅰ群禽腺病毒(GroupⅠfowladenovirus,FAdVⅠ)分子流行情况,试验通过病毒分离、PCR鉴定、鸡胚致病性试验、Hexon基因测序等方法对采集自2021—2022年我国15个地区共计250份疑似感染禽腺病毒的组织病料进行病原分析。
结果显示:共分离出43株FAdVⅠ;Hexon基因扩增测序分析表明,其中36株与FAdV-C4型参考株核苷酸序列相似性在99.8%~100%,2株与FAdV-E8b型参考株核苷酸序列相似性达到93.8%~94.2%,1株与FAdV-A1型参考株核苷酸序列相似性达到99.5%,4株与FAdV-D11型参考株核苷酸序列相似性达到95.4%;FAdVⅠ感染在夏秋季节为高发期,阳性检出率较高的时间主要集中于4—10月。
研究表明,我国15个主要养禽地区禽群中FAdVⅠ流行情况较为复杂,存在交叉感染和病毒基因重组风险,需要进一步调查其流行病学特征及研究其致病性。
【总页数】8页(P38-45)【作者】刘兆洁;许芬芬;李雨泽;刘梦凡;苏镜文;李德钊;黄淑坚;梅堃【作者单位】广东省华晟生物技术有限公司;佛山科学技术学院【正文语种】中文【中图分类】S855.3【相关文献】1.9株Ⅰ群禽腺病毒的分离鉴定及hexon基因的遗传变异分析2.鸵鸟Ⅰ群禽腺病毒的分离鉴定、血清型鉴定以及Hexon蛋白基因序列分析3.Ⅰ群禽腺病毒山东株的分离鉴定及hexon基因的克隆与分析4.禽腺病毒4型云南株分离鉴定及Hexon 基因序列分析5.Ⅰ群禽腺病毒山东株的分离鉴定及hexon基因的克隆与分析因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
Chinese Journal of Veterinary Medicine中国兽医杂志2020年（第56卷）第3期37 2株I群禽腺病毒分离株的致病性1董振杰1,刘东2，魏建平3,余锐萍4［1.福喜（威海）农牧，山东威海452600；2.青岛易邦生物工程有限公司，山东青岛266000；3.大连成三牧业股份,辽大连116300；4.中国农业大学动物医学院,北京海淀100193］摘要:将从胶东地区疑似I群禽腺病毒(FAdV)感染的发病鸡的肝组织病料中分离鉴定出的FAdVTb(FXWHTb)株和FAdVT(FXWHT)株，通过腿部肌肉注射方式，以TCID so lO8。
0.2mL/羽的剂量，接种15日龄的SPF鸡，临床观察其发病情况及临床表现，研究其毒力和致病性。
临床观察和剖检结果显示:FXWHTb株和FXWHT株均能在24h弓|起试验鸡只发病，表现明显的临床症状和典型的剖检病理变化。
H.E.染色结果显示：2株分离株均在脑、胸腺、气管、心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、腺胃、胰腺、十二肠、空肠、盲肠和法氏囊有较明显的病理变化，但未内包％PCR: FXWHTb株攻毒后72h，FXWHT株攻毒后48h,在肝脏、肺脏、肾脏、腺胃、空肠和盲肠呈现100%的阳性率。
免疫组化结果显示:FXWHTb株和FXWHT株在在强阳性信号;FXWHT株在肾脏、十二指肠和空肠存在阳性信号。
表明FXWHTb株和FXWHT株均对15日龄SPF鸡有较强的致病性，可侵害多个组织和器官。
关键词：I群禽腺病毒；分离株；攻毒试验；致病性中图分类号：R5H.8文献标志码:A文章编号：0529—6005(2020)03—0037—04 Study on the Pathogeeicity of Two Fowl Adenovirus Isolates from Jiaodong AreaDONG Zhen-jia1，LIU Dong2，WEI Jian-ping3，SHE Rui-ping4[1.OSI(weihai)Poulte Development Co.，Lth，Weihai452600，China；2.YibioBioeogicaeEngineeeingCo.，Led，Qingdao266000，China；3.Daeian Chengsan AnimaeHusbandeyCo.，Led，Daeian116300，China；4.Colleye of Veterinary Medicine，China Agriculture University，Beijing100093，China)+AbstracC:FAdV-8b strain and FAdVT strain which were named as FXWHTb strain and FXWHT strain respectively，were separated and identified from Shandong area.We administered the viruses to15-day-oiy SPF birds by muscular injection in the leg，and observed the clinical signs.Results showed that both FXWHTb and FXWHT infection caused diseases in the birds，with obvious clinical signs and pathologic changes.Both strains caused significant pathologic problem in brain，trachea，heart，liver，spleen，lung，kidney，proventriculus，pancreas，duodenum，jejunum，ceca and bursa by H.E.staining.However，we did not find intranuclear inclusion body.Both strains replicated very fast in various oryans gter chdlenoe，and we found100%virus recovery from liver，lung，kidney，proventriculus，jejunum and ceca72hours post chdlenoe for FXWHTb，and48hours for FXWHT.Immunohistochemistry showed that FXWHTb strain and FXWHT strain replicated mainly in liver，while FXWHT is also replicated in liver，kidney，duodenum and jejunum.These data indicate that both FXWHTb and FXWHT have higher pathogenicity to15-day-old SPF chickens，and coued damageman0ei s uesand oegans.Key words:adenovirus；isolate strain；challenge test；pathogenicityCobesponding author:SHE Rui-ping，E-mail:******************I群禽腺病毒！Fowl ddoKoirus,FAdV）属于禽腺病毒腺病毒属，有12型，其中FAdV 8b血清型可引起鸡包涵体肝炎（IBH），FAdV-4血收稿日期：2018—09—18作介:董振杰（1976-"，女，博士，研究方向为预防兽医学，E-mail:zhenjie.dong@通讯作者:余锐萍,E-mail:sherubbg@ 清型可引起鸡心包积水综合征（HHS）［1］。
