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第４章家蚕Ｂｍｔｄｈ基因的克隆和序列分析４．１Ｂｍｔｄｈ基因的电子克隆以家猪（ｓｓｃｒｏｆａ）苏氨酸脱氢酶基因的氨基酸序列作为质询序列，用ＴＢＬＡＳ‘ｒＮ程序检索ＮＣＢＩ的家蚕ＥＳＴ库进行电子延伸，最终得到一条长１２４６ｎｔ的重叠群（ｃｏｎｔｉｇ），该重叠群由２１条家蚕同源ＥＳＴ（Ｅ＜＝ｌｅ一３０）拼接而成，包含一个长１０２６ｎｔ的完整ＯＲＦ，见图４－１。
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家蚕丝腺特异高量表达丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究的开题报告题目：家蚕丝腺特异高量表达丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究研究背景：家蚕丝腺是家蚕产丝的重要器官，其中包含大量的丝素蛋白，需要通过蛋白酶的作用来将其加工成丝素纤维，在丝腺中引入大量的蛋白酶会加速丝素蛋白被加工成纤维的速度，从而提高丝的生产率。
然而，也存在一些丝素蛋白在蛋白酶的作用下被加工成不利于纺丝的短纤维，降低丝的质量和产量。
因此，研究对丝素蛋白加工具有抑制作用的蛋白酶抑制剂，对提高丝的质量和产量具有重要意义。
研究内容：本研究拟通过家蚕丝腺特异高量表达丝氨酸蛋白酶抑制剂的方式，探究其对蛋白酶加工丝素蛋白的影响。
具体研究内容包括：1. 设计丝氨酸蛋白酶抑制剂的序列，并在家蚕丝腺中进行高量表达。
2. 制备家蚕丝腺摘取液及其制备的酵素体系，通过酵素活性分析，探究丝氨酸蛋白酶抑制剂对蛋白酶活性的抑制作用。
3. 制备丝素蛋白，研究丝氨酸蛋白酶抑制剂对其加工成纤维的影响。
研究意义：本研究将通过表达丝氨酸蛋白酶抑制剂的方式，探究其对家蚕丝腺中蛋白酶加工丝素蛋白的影响，进一步了解丝素蛋白产量和质量的关系，为提高丝的质量和产量提供理论基础。
参考文献：1. Craig, C. L., Singh, S., & Tomer, K. B. (2009). Silk fibroin nanoparticle as a potential oral drug delivery vehicle. Nanotechnology Reviews, 2(1), 37-45.2. Kundu, B., Rajkhowa, R., Kundu, S. C., & Wang, X. (2013). Silk fibroin biomaterials for tissue regenerations. Advanced drug delivery reviews, 65(4), 457-470.3. Zhang, Y., Omenetto, F. G., Kaplan, D. L., Audi, J., & Galant, N. J. (2012). Sericin-derived proteinaceous films and capsules. Biomacromolecules, 13(11), 3618-3628.。
蚕丝合成相关基因的克隆与表达分析近年来，世界各地都有着蚕丝生产和相关技术的研究。
随着人们对突破蚕丝生产领域的渴望的增加，基因克隆和表达分析的研究也越来越成为关注焦点。
蚕丝的产生与合成蚕丝纤维是一种天然的纤维，通常来自于家蚕的茧。
蚕丝是由蛋白质组成的，含有大量的谷氨酸和丝氨酸。
产生蚕丝的主要器官是蚕茧腺，该器官位于家蚕的头部发育器官附近。
当家蚕开始缠绕茧时，茧腺开始分泌蚕丝蛋白并卷曲成茧。
由于家蚕缺乏活性异肽酶，因此茧腺分泌的蛋白质以单一的方式排列，形成均一的纤维。
蚕丝合成相关基因的克隆蚕丝蛋白是构成蚕丝的主要成分，因此研究蚕丝合成相关的基因对于理解蚕丝形成机制具有重要意义。
目前已经通过测序技术鉴定出了许多家蚕蚕丝蛋白基因，这些基因编码的蛋白质具有多样性和复杂性。
其中，家蚕的蚕丝蛋白家族分为A、B、C三个亚家族。
每个亚家族都有多个基因，不同基因之间在基因结构以及编码的蛋白质序列上都有差异。
在克隆家蚕蚕丝蛋白基因的过程中，常常采用RT-PCR和RACE等技术。
基于已有的基因序列，可以通过NCBI数据库等资源获取基因的信息，从而为克隆工作提供有用的参考。
在克隆过程中，需要特别注意不同基因之间的共同点和差异点，避免误操作和病毒污染等问题。
此外，还需要保证所得到的基因与自然界中的蚕种具有同源性，以确保实验结果的可重复性和可靠性。
蚕丝合成相关基因的表达分析蚕丝蛋白基因的表达与调控是蚕丝合成过程的关键。
表达分析研究可以揭示不同组织器官和生长阶段蚕丝蛋白基因的表达模式，为优化蚕丝生产流程提供科学依据。
目前，常用的基因表达分析技术有Northern blot、RT-PCR、实时荧光定量PCR等。
基于实时荧光定量PCR的表达分析技术具有灵敏度高、特异性强、数据准确、通量大的优点。
在使用该技术时，需要先设计合适的引物和探针，遵循实验操作规范，并对实验结果进行质量控制和统计分析。
根据表达分析结果，可以通过基因转表达等手段调控蚕丝膜生产的重要基因，从而提高蚕丝的产量和质量。
蚕丝基因组的测序与分析蚕丝是人类历史上的重要发明之一。
蚕丝是由蚕茧中提取出来的，具有柔软、光泽和抗菌等特点。
蚕茧的来源是昆虫蚕，在食用叶类植物后，通过产生蛋白质来建造自己的蚕茧。
为了更好地理解蚕茧的形成和蚕的生理机制，科学家们开始了蚕丝基因组测序的工作。
首先，科学家们必须收集足够多的蚕丝样本以便对其基因进行测序。
这项工作需要收集大量的蚕茧和蚕宝宝样本，并对其进行基因提取和纯化。
以往，这项工作可能需要手动进行，非常耗时且需要大量的劳力。
但是现在，随着以人工智能为代表的新技术的快速发展，这项工作可以被自动化。
在这种情况下，科学家们可以使用自动化设备来控制自动收集蚕丝样本与数据。
这项工作非常具有挑战性，但是随着技术的不断发展，测序成本也将会大大降低。
其次，对于蚕丝基因组的测序，科学家们在运用基因组学方面的技术。
这项工作意味着他们需要分解蚕丝基因组中的蛋白质，以便对其进行基因测序。
因为蚕丝基因组是由基因序列组成的，所以对其进行测序就需要对其基因的组成和基因的运作进行详细的了解。
目前，使用高通量测序技术意味着可以同时读取数万个基因片段，因此可以在短时间内测定全部基因组的序列，并快速地对结果进行分析和解释。
这样，科学家们就可以更好地了解蚕丝的生理机制和蚕茧它律，为新型蚕茧材料的研制开发提供了坚实的基础。
值得注意的是，蚕丝基因组测序与分析需要大量的计算和存储资源。
在高通量测序技术发展的背景下，科学家们将需要对测序所产生的数据进行快速、准确的处理。
这种处理需要大量的计算资源，但同时，也需要存储空间和计算中网。
因此，对于蚕丝基因组测序与分析的挑战，科学家们必须不断以新技术和新思路进行探索，并处理好计算、存储和分析中的相关问题。
这些技术有很大的可能性将会为人类带来更好的蚕丝纤维材料。
总的来说，蚕丝基因组的测序和分析将为人们提供对古老历史时期的了解，这种材料一直都是人们的最佳选择之一。
但是，这项工作需要多方面的资源投入并且还需要进行深入的研究。
家蚕变态发育的基因表达谱及microRNA的调控研
究的开题报告
摘要：
家蚕是重要的经济昆虫，其变态发育是其生命周期中最为重要的生理过程之一。
本文计划通过基因表达谱和microRNA的调控等方面探究家蚕变态发育过程中的分子机制，以期深入了解家蚕的生命周期和其生理调控机制。
研究内容：
1. 基因表达谱分析
利用RNA-Seq技术测序家蚕的不同发育阶段，包括卵、幼虫、蛹和成虫阶段，获取家蚕变态发育过程中的基因表达谱。
通过基因表达量的统计和差异表达基因的筛选，筛选出具有生物学意义的基因，进一步分析它们在家蚕变态发育过程中的调控作用。
2. microRNA调控分析
基于RNA-Seq测序结果，探究家蚕变态发育过程中microRNA的表达谱，并使用生物信息学分析工具对这些microRNA的靶基因进行预测。
通过分析microRNA与其靶基因之间的调控关系，以及这些关系在家蚕变态发育过程中的动态变化，揭示microRNA对家蚕变态发育过程的精细调控作用。
3. 数据整合与分析
将基因表达谱和microRNA的调控结果进行整合，通过生物信息学方法对其进行生物学意义上的分析及可视化，展示家蚕变态发育过程中的分子机制，并探究家蚕整个生命周期的调控机制。
预期结果：
本研究可望深入了解家蚕变态发育过程中的分子机制及其调控，为
家蚕的农业生产、疾病预防和治疗等方面提供重要的参考价值。
同时，
本研究也可为其他昆虫的变态发育及其分子机制的研究提供参考和启示。
几个家蚕丝蛋白合成关键基因的表达调控的开题报告
一、研究背景及意义
家蚕丝蛋白是蚕丝制品的主要原料，具有良好的机械强度和抗菌性，因此在纺织品、医疗、食品等领域有广泛的应用。
家蚕丝蛋白的生产主要来自于蚕丝腺细胞，而且其合成受到多种因素的调控。
近年来，研究家蚕丝蛋白合成调控的关键基因，对于提高丝蛋白产量、改善丝蛋白品质、提高生产效率和降低成本具有重要的意义。
二、研究内容
本研究将探究几个家蚕丝蛋白合成关键基因的表达调控机制。
具体包括以下几个方面：
1. 家蚕丝蛋白合成基因的克隆与序列分析。
选取已知的家蚕丝蛋白基因为参照，使用RT-PCR等方法克隆目标基因并进行测序和分析，确定其与家蚕丝蛋白合成相关的功能区域和保守性序列。
2. 基因表达调控的研究。
利用实时荧光定量PCR等技术，研究各个家蚕丝蛋白合成基因在不同组织、不同发育阶段、不同激素等不同条件下的表达模式，并探究其与丝蛋白生产水平的关系。
3. 转录因子的筛选与鉴定。
通过对已知转录因子进行筛选和鉴定，验证其是否参与调控家蚕丝蛋白合成基因的表达，确定其调控机制。
4. 生物信息学分析。
利用生物信息学方法，比较不同物种、不同组织、不同发育阶段等样品中家蚕丝蛋白合成基因的表达谱，探究其相互关系，预测可能的信号转导途径和调控网络。
三、研究意义
本研究可为解决家蚕丝蛋白合成过程中的一系列问题提供参考。
在提高丝蛋白产量、改善丝蛋白品质、提高生产效率和降低成本等方面，具有实际应用价值。
另外，本研究也有助于进一步理解丝蛋白合成的分子机制，并为与家蚕丝蛋白生产相关的其他蚕科昆虫产丝研究提供思路和方法。
家蚕中转录因子基因家族的鉴定与表达分析研究转录因子是调控基因表达的重要因素，它们通过与DNA上启动子区域结合，促进或抑制基因的转录，从而影响基因表达和功能。
家蚕（Bombyx mori）是由于其重要的经济学地位在昆虫界中被广泛研究的模式生物之一，而转录因子也在家蚕发育、生长和代谢过程中扮演着重要的角色。
因此，对家蚕中转录因子基因家族的研究具有重要的理论和应用意义。
本文将对家蚕中转录因子基因家族的鉴定与表达分析研究进行讨论。
一、家蚕转录因子基因家族的鉴定家蚕基因组计划的完成为研究家蚕转录因子家族提供了必要的基础数据。
目前，已经对家蚕中的转录因子进行了全基因组预测和鉴定，预测共含有约3,500个转录因子基因，占家蚕基因组总基因数的10%左右。
其中包括作为转录因子家族的重要组分的C2H2类锌指蛋白、家族类转录因子、Myb蛋白、NAC类转录因子、bHLH蛋白、C3H家族转录因子和WRKY家族转录因子等。
家蚕中的转录因子基因数量远远多于果蝇，但少于蜜蜂和蚜虫，这表明家蚕转录因子的表达调控网络更为复杂。
二、家蚕转录因子基因家族的表达分析转录因子的表达具有时空特异性，对于揭示转录因子的功能和调控网络具有重要意义。
目前，通过转录组学、蛋白质组学和基因表达分析等方法，对家蚕中多种转录因子基因的表达模式和功能进行了研究。
1. C2H2类锌指蛋白C2H2类锌指蛋白是家蚕转录因子家族中最大的类别，占家蚕转录因子总数的50%以上。
这些基因具有广泛的生物学功能，如参与发育、代谢和应激反应。
研究发现，家蚕C2H2类锌指蛋白基因在幼虫期特异表达，随着生长发育逐渐降低，而在成虫期恢复表达。
同时，不同家蚕品系和生长环境下的C2H2类锌指蛋白基因表达水平存在差异。
2. bHLH蛋白bHLH蛋白是一类重要的转录因子，参与多种生理过程，如细胞分化、生长、细胞死亡、代谢、内分泌调节等。
研究发现，家蚕bHLH蛋白基因的表达同样具有时空特异性，如BmTai-1参与雌性同恒性确定，BmBeta-1参与眼色素生物合成、BmP0参与生长和发育。
不同品系家蚕丝基因表达差异的分析家蚕丝素作为一种高级纤维素材料，被广泛用于高档服装、床上用品、饰品等领域。
而对于家蚕丝素的产生，其基因调控机理一直是研究者关注的焦点。
事实上，不同品系家蚕的丝腺基因表达差异是导致丝素产量和质量不同的重要原因。
因此，对不同品系家蚕丝基因表达差异的分析有助于指导家蚕丝素产业的发展，从而提高丝素产业的效益。
本文将对不同品系家蚕丝基因表达差异的分析进行探讨。
1.品系选择家蚕的品系分类主要有中华、欧洲和日本系等。
以中华系和欧洲系家蚕为例，中华系家蚕纤维较细而且有光泽，可以制作出高贵的家纺用品，而欧洲系家蚕纤维较粗，适合制作帆布、绸缎等较为耐磨的织物。
这说明不同品系家蚕在纤维质量方面存在着差异。
因此，选择适宜品系进行丝基因表达差异的分析非常重要。
2.基因芯片技术在进行家蚕丝基因表达差异分析时，常用的分析技术是基因芯片技术。
它是一种能够同时检测成千上万个基因表达情况的高通量技术，在生物学领域得到了广泛应用。
这种技术可以帮助研究人员了解家蚕纤维合成功能的调节机理和丝质的合成相关基因。
3.基因表达分析通过基因芯片技术，研究者可以获得大量基因表达的数据，进而进行基因表达分析。
研究发现，不同品系家蚕纤维素基因表达存在着显著差异。
以中华系和欧洲系家蚕为例，中华系家蚕在丝素基因调控方面表现出更为活跃的基因表达模式，较高的基因表达量有利于促进丝素合成。
而欧洲系家蚕则表现出更为稳定的基因表达模式，其某些基因的表达量较高，可能会影响丝素合成的效率。
4.调节因素分析基因表达的差异往往并不是单一因素导致的。
家蚕丝素合成过程中，还涉及到RNA交互作用、剪切修饰、转录后修饰等多个层面的调节因素。
因此，在研究不同品系家蚕丝基因表达差异的同时，还需要分析和研究这些调节因素。
5.应用前景通过对不同品系家蚕丝基因表达差异的分析，可以为产业的发展提供很好的指导。
例如，对于欧洲系家蚕而言，其虽然丝素产生却相对较少，但其强韧的纤维却使得它更适合应用于制作耐磨的织物等领域。
家蚕Notch信号通路基因的表达研究李丹丹;黄蕾;王立方;刘宗才【摘要】[目的]研究家蚕Notch信号通路基因的表达情况.[方法]在实验室前期工作的基础上,用特异引物对家蚕的Notch信号通路上下游基因进行克隆,并对这些基因在家蚕5龄幼虫不同组织部位的表达进行研究.[结果]这些基因在各组织的表达量不同,其中fringe和groucho在家蚕头部表达量较多,在丝腺、精巢、卵巢中的表达量较少；notch在家蚕尾部表达量较少,在其他组织中表达量无明显差别.[结论]该研究为进一步研究家蚕Notch信号通路奠定了基础.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2013(041)019【总页数】2页(P8447-8448)【关键词】家蚕;Notch信号通路;基因;表达谱【作者】李丹丹;黄蕾;王立方;刘宗才【作者单位】中英·南阳洛桑昆虫生物学联合实验室,河南南阳473061;中英·南阳洛桑昆虫生物学联合实验室,河南南阳473061;中英·南阳洛桑昆虫生物学联合实验室,河南南阳473061;中英·南阳洛桑昆虫生物学联合实验室,河南南阳473061【正文语种】中文【中图分类】S188Notch信号通路广泛存在于从果蝇、线虫到脊椎动物的各种生物体中，在进化上高度保守，一个完整的Notch信号通路由Notch受体、Notch配体、CSL DNA结合蛋白及其他的效应物和Notch的调节分子组成。
Notch信号转导过程包括Notch受体与配体的结合、Notch受体的酶切活化、可溶性NICD转移至细胞核并与CSL DNA结合蛋白相互作用等过程。
Notch信号途径调控多种细胞的发育、增殖、分化和凋亡。
在果蝇和线虫中，Notch信号通路精确调控细胞分化起始过程，对胚胎发育中器官发生和形态建成起重要作用［1］。
研究表明，活化Notch 信号通路可抑制或延迟发育过程中的分化，并通过侧向抑制阻止邻近细胞采取同样的分化程序。
蚕丝蛋白基因家族的进化和功能分析蚕丝蛋白是家蚕（Bombyx mori）丝腺分泌的一种特殊蛋白质，它们是由多个编码蛋白质的基因家族组成的。
随着基因组测序技术的发展，越来越多的关于家蚕蚕丝蛋白基因家族的信息被揭示。
在本文中，我们将探讨这些基因家族的进化和功能，以期对蚕丝蛋白及其应用有更深入的了解。
一、基因家族的进化蚕丝蛋白基因家族包括多个不同的基因，并且这些基因的序列相似度较高。
这表明它们很可能是由复制和来自同一个祖先基因的模拟进化过程所产生的。
据估计，该家族最早的成员大约可以追溯到1.75亿年前的显生宙。
这个家族经历了复杂的进化历程，包括基因扩增、基因水平转移、外源基因的捕获和进化选局等。
尽管某些基因家族的成员已被失活，但大多数成员仍在家蚕的基因组中存在着。
这些基因成员在其不同的剪接变体中表达并编码对蚕丝蛋白组装和作用至关重要的多种多样的多肽链。
二、基因家族的功能由于家蚕是制造蚕丝的原料，因此蚕丝蛋白基因家族研究有助于我们理解蚕丝的生产和质量控制。
在基因家族成员的精细化调节和表达方式的研究中，我们可以利用这些知识开发更好的生产系统，使蚕丝更具竞争力和质量保障。
另一方面，蚕丝蛋白基因家族的功能不仅仅局限于生产纺织原料。
由于家蚕已被广泛用于实验动物，因此蚕丝蛋白也被视为生物技术应用的热门素材之一。
此外，蚕丝蛋白还具有许多生物学和医学应用。
三、基因家族的创新应用近年来，蚕丝蛋白基因家族正在被应用于一系列新兴领域，这些应用包括生物传感器、组织工程、医疗设备和制药等。
这些创新应用利用蚕丝蛋白表现出的特殊性质，例如其生物可降解性、良好的生物相容性和高度的可调控性。
此外，这些应用还利用了一些基于基因工程的策略，包括利用聚合酶链式反应（PCR）技术构建蚕丝蛋白变体，以及利用Crispr/Cas9工具进行基因编辑和功能改造，以期开发出新型的蚕丝蛋白类似物或改造蚕丝蛋白的性能和功能。
总结：蚕丝蛋白基因家族的研究为我们理解蚕丝生产和质量控制打开了一扇窗户，同时也为我们开发新型的生物技术应用提供了理论和实践基础。
家蚕丝腺生物反应器表达hGM-CSF转基因载体的构建及应用研究的开题报告本研究旨在构建一种家蚕丝腺生物反应器，用于表达人类粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子（hGM-CSF）转基因载体，并探讨其在治疗相关疾病中的应用。
一、研究背景hGM-CSF是一种免疫调节因子，可促进白细胞分化、增殖和巨噬细胞活性，对治疗骨髓抑制、恶性肿瘤、移植术后免疫抑制等具有重要意义。
传统的生产hGM-CSF的方法为重组蛋白制备，但成本高、生产周期长，难以满足大规模临床需求。
此外，hGM-CSF重组蛋白具有高度异质性、复杂性和生物活性不稳定等问题，限制了其在临床应用中的进展。
家蚕表达系统具有可持续、高效和经济的优势，在生物制药研究中得到广泛应用。
因此，利用家蚕表达系统来表达hGM-CSF具有很高的潜力。
二、研究内容和方法本研究将构建一种家蚕丝腺生物反应器，利用网格线蚕作为宿主，构建hGM-CSF转基因载体并在家蚕丝腺合成表达。
具体内容和方法如下：1. 宿主选择：选用网格线蚕作为宿主，通过人工控制环境、营养和生长周期等条件，获得高产出的丝腺组织。
2. 转基因载体构建：构建包含hGM-CSF基因的转基因载体，采用基因克隆技术和CRISPR-Cas9基因编辑技术。
通过果蝇P元素转座子系统将转基因载体植入宿主基因组。
3. 基因表达：通过PCR、Western blot和ELISA等技术手段验证hGM-CSF在家蚕体内表达情况，并优化表达系统。
4. 应用研究：对获得的hGM-CSF生物制品进行研究和开发。
探讨其在治疗骨髓抑制、恶性肿瘤、移植术后免疫抑制等方面的应用价值。
三、预期结果本研究将通过构建家蚕丝腺生物反应器，成功表达hGM-CSF转基因载体，并获得高产出的生物制品。
同时，将探讨其在治疗相关疾病中的应用价值，为生物制药研究提供新途径和思路。
家蚕丝素基因表达水平的定量分析孙霞;朱晨;汪生鹏;沈小绢;郭锡杰【期刊名称】《蚕业科学》【年(卷),期】2009(35)1【摘要】采用实时定量RT-PCR方法,对丝素轻链基因(fib-L)、丝素重链基因(fib-H)、P25基因在家蚕幼虫不同组织和不同发育时期的表达进行了定量分析。
结果发现3种丝素基因除主要在5龄幼虫的后部丝腺中表达外,在其它组织如脂肪体和中部丝腺中也有一定程度的表达;在4龄眠期的后部丝腺中3种丝素基因也有一定的表达水平,其中fib-L在这一时期的表达量较高。
同时发现在5龄第3天和第5天的后部丝腺中,fib-H、fib-L与P25在mR-NA水平上的摩尔比分别为9∶18∶1和19∶32∶1,推测丝素基因的表达可能具有转录后调控,此结果说明家蚕丝素基因的表达可能具有更加精细的调控机制。
【总页数】6页(P30-35)【关键词】家蚕;丝素基因;表达;实时定量RT-PCR;组织;发育时期【作者】孙霞;朱晨;汪生鹏;沈小绢;郭锡杰【作者单位】江苏科技大学生物与环境工程学院,江苏镇江212018;中国农业科学院蚕业研究所,农业部蚕桑遗传改良重点开放实验室,江苏镇江212018【正文语种】中文【中图分类】S881.3;Q78【相关文献】1.天蚕丝素基因向家蚕的转移及表达 [J], 范久戈;李振刚2.Bmo-miR-375-3p对家蚕丝素蛋白轻链基因BmFib-L表达的调控作用 [J], 范洋洋;钱平;沈兴家;王欣;蒋涛;唐顺明3.YAG介导的天蚕丝素基因向家蚕的转移——天蚕丝素基因—YAC克隆在家蚕的表达 [J], 李振刚;范久戈4.家蚕bmo-miR-0031-3p体内下调丝素轻链基因BmFib-L的表达 [J], 陈艳花;蒋涛;王雪珍;钱平;唐顺明;沈兴家5.家蚕微孢子虫感染对家蚕海龟蛋白(Bmtutl)基因表达水平的影响 [J], 朱峰;高建华;张永红;肖圣燕;邵榆岚;唐芬芬;白兴荣因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
利用家蚕丝腺生物反应器表达人干扰素-ω的研究的开题报
告
一、选题背景
干扰素（IFN）是单链多肽蛋白质，广泛应用于医疗领域，特别是治疗肝炎、乙型肝炎、艾滋病、肺癌等疾病。
干扰素的制备与应用已成为目前世界生物技术、医药制造领域的研究热点之一。
目前，大多数工业化的干扰素制备方法采用外源表达TG1大肠杆菌和CHO细胞，但这些方法具有产量低、生物活性差和复杂操作等诸多弊端。
家蚕丝腺是昆虫生物体内生产大量丝蛋白的重要腺体，因其细胞内含有许多蛋白质翻译机器，且有较高的蛋白质折叠机制和后翻译修饰的能力，能够承载并高效表达异源蛋白。
因此，采用家蚕丝腺作为干扰素的表达宿主有望提高干扰素的产量和生物活性。
二、研究目的
本研究旨在利用家蚕丝腺生物反应器，高效表达并纯化人干扰素-ω，并对表达产物进行生物学特性分析，为干扰素的制备与应用提供新思路和实验依据。
三、研究内容
1. 构建家蚕丝腺干扰素表达体系，对表达条件进行优化。
2. 通过荧光显微镜、Western blot等技术对表达产物进行定位、鉴定与分析。
3. 利用分子筛分离技术对表达产物进行纯化与提纯。
4. 采用MTT法、细胞流式分析法等技术对表达产物的生物活性进行评价。
四、研究意义
本研究利用家蚕丝腺作为表达宿主，尝试高效表达人干扰素-ω，并对表达产物进行生物学特性的分析。
通过开展本研究，可探索家蚕丝腺作为干扰素的表达宿主的适用性和优越性，拓宽干扰素的制备渠道，为相关医药的研究与开发提供新思路和实验依据。
同时，本研究对于家蚕丝腺的科学研究，也将推进家蚕丝腺在生物制药及相关领域的应用和发展。
中国科学技术大学
硕士学位论文
家蚕丝腺表达谱的分析及相关基因的表达研究
姓名：唐杰
申请学位级别：硕士
专业：生物化学与分子生物学
指导教师：周丛照
20070601
中国科学技术丈学硕ｔｚ论文第一章
第一章文献综述
第一节家蚕研究历史概述
家蚕是蚕蛾的幼虫（Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒｔ），属节肢动物门、昆虫纲、鳞翅目、蚕蛾科、家蚕属。
家蚕一个世代中，其个体发育需经历受精卵、幼虫、蛹、成虫的四个发育阶段，属完全变态。
家蚕只在幼虫时期取食桑叶，期阔一般蜕皮（ｍｏｌｔ）４次，在蜕皮过程中停止摄食的现象称为眠，眠是划分蚕龄（ｉｎｓｔａｒ）的界限。
第４次眠后的５龄蚕可以分泌蚕丝结茧，蚕丝（ｓｉｌｋｆｉｂｅｒ）是丝绸原料的主要来源，在人类经济生活中有着重要作用。
约在４。
Ｏ∞多年前中国已有文献记载，至少在３．０００年前中国人民已经开始人工养蚕。
家蚕分布全国。
由于蚕丝柔软、光滑、强韧、洁白，中国人民很早就懂得利用它来织造出质地精美的丝绸，并远销国外，开辟了约有２。
０００年历史的“丝绸之路”时代，对早期的全球化作出了贡献。
图１．１５龄期末期家蚕
Ｆｉ９１．１５ｔｈｉｎｓｔａｒｓｉｌｋｗｏｒｍ
家蚕不仅在养殖业和纺织业具有重大的经济价值，而且作为唯一真正的人工饲养的昆虫，家蚕的生长和繁殖完全依靠人类，故拥有其为数众多的突变和不育品系。
据不完全统计，目前最大的突变品系库在中国江苏科技大学，约７００种遗传种类；西南大学拥有约６００多种突变种类；日本京都大学和日本国立农业生物科学研究所各拥有４００多和４５０多种突变种类；韩国农业发展厅（ＲＤＡ，水源市）约拥有３５０多种。
所以早在十九世纪初，即近代生物学的开端，家蚕就已经成为微生物学、生理学和遗传学研究的模式生物。
４
中国科学技术大学硕士论文第一章
５５４个来自其他鳞翅目昆虫的已知基因的８２．７％．总共大小是４２８．７百万碱基对，分布在２８个染色体上。
小于当初ＣｏＴ分析预期的５３０百万碱基对，使得家蚕成为继黑腹果蝇、冈比亚按蚊后的第三种被测序的昆虫。
据最新的资料表明，综合两个独立研究组的家蚕基因组数据，覆盖度己达到９５％左右，重复度高达９倍。
随着家蚕基因组框架图的完成，国际鳞翅目基因组研究人员开始着手对全基因组序列中所包含的可能的基因的结构和位置进行鉴定。
目前依靠计算机预测软件，并结合基因结构的普遍规律和家蚕基因组的特殊性，中国的西南大学和中科院基因所联合小组最终预测了１８．５１０个家蚕基因。
同时国际上的家蚕全长ｃＤＮＡ文库的构建计划也在顺利的开展中（目前己达到２万余条）。
第二节家蚕丝腺研究背景
图１．２家蚕丝腺
Ｆｉｇ．１．２Ｓｉｌｋｗｏｒｍｓ¨ｋｇｌａｎｄ
家蚕左右两侧各有一个管状的丝腺（ｓｉｌｋｇｌａｎｄ），在纺丝管舍一。
丝腺是合成茧丝蛋白质和分泌蚕丝的重要生物器官，具有强大地合成和分泌蚕丝蛋白的能力。
一只家蚕一般经过２５天左右的生长发育，在幼虫期食下鲜桑叶约２２克，即可合成并分泌０．５～１克的丝蛋白。
丝腺从形态和机能上可分为前部丝腺
（ＡＳＧ，ａｎｔｅｒｉｏｒｓｉｌｋｇｌａｎｄ）、中部丝腺（ＭＳＧ，ｍｉｄｄｌｅｓｉｌｋｇｌａｎｄ）和后部丝腺（ＰＳＧ，ｐｏｓｔｅｒｉｏｒｓｉｌｋｇｌａｎｄ），其中前部丝腺没有合成和分泌的作用，是丝物质流经的导管；中部丝腺是整个丝腺中最粗大的部分，从形态上又可分为前区、中区和后区３个部分，其合成分泌的丝胶蛋白占蚕丝蛋白总量的２０～２５％；家蚕后部丝腺是合成和分泌占蚕丝总量７５％～８０％的丝心蛋白的器官。
家蚕丝腺起源于外胚层，在胚胎发育的第１７～１８期两侧体节出现丝腺基板，
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中国科学技术大学硕士论文第一章
期性地干扰１３折叠层结构，这可能就是丝纤维有弹性的原因。
实际上，不同品种蚕丝产生不同量的这种非折叠层结构，因而弹性也有差别。
丝心蛋白是提供蚕茧的强韧又有弹性的优质蛋白质纤维。
３．１丝心蛋白重链
丝心蛋白是蚕丝的主要成分，约占蚕丝（茧丝）的７５～８０％。
丝，Ｉｆ，蛋白主要由丝心蛋白重链Ｈ链（ｆｌｂｍｉｎｈｅａｖｙｃｈａｉｎ，ｆｌｂ－Ｈ）、轻链Ｌ链（ｆｉｂｒｏｉｎｌｉｇｈｔｃｈａｉｎ，ｆ．ｂ．Ｌ）及糖蛋白Ｐ２５（Ｆｉｂｒｏｈｅｘａｍｅｄｎ）组成，以下主要介绍各自的结构特征以及它们如何组成丝心蛋白基本单位（ｅｌｅｍｅｎｔａｒｙｕｎｉｔ）。
丝心蛋白Ｈ链基因在蚕基因组中是单拷贝的。
它由２个外显子（ｅｘｏｎ）和一个内含子（ｉｎｔｒｏｎ）构成。
外显子ｅ１长６７ｂｐ（其中＋１～＋２５位为非翻译序列，＋２６～＋６７位为１４个信号肽氨基酸编码区），起始位点＋１。
内含子９７１ｂｐ（＋６８～＋１，０３８）。
外显子ｅ２长１５，７５０ｂｐ（＋１，０３９～＋１６，７８８）。
终止密码弘Ａ。
图１．３家蚕丝心蛋白重链重复区的构成（Ｚｈｏｕ，Ｃ．２０００）Ｆｉｇ。
１．３ＦｉｎｅｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎｏｆｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅｄｏｍａｉｎｓｏｆＢｏｍｂｙｘｍｏｒ／Ｆｉｂｒｏｉｎｈｅａｖｙｃｈａｉｎ
Ｈ链基因编码区域全长１５．７９２ｂｐ，为大约５，２６３个氨基酸编码，蛋白质分子量３９１，３６７ｋＤ。
１～１５１位氨基酸为Ｎ端非重复区域，其余Ｈ链核心区域“１，４４９～＋１６，６１１位）由１２个重复区段（ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅｄｏｍａｉｎ，Ｒ０１～Ｒ１２）和１１个中介序列（无定形区域，ａｍｏｒｐｈｏｕｓｄｏｍａｉｎ，Ａ０１～Ａ１１）相间排列构成，ＧＣ含量约６３％。
终止密码上游约１，９００ｂｐ～４００ｂｐ区段在不同的蚕品种间有差异，可能是多态性表现。
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中国科学技术大学硕士论文第二章
本实验着重关心在５龄期丝腺特异表达的基因，即在５龄期中部丝腺和后部丝腺表达克隆数的总和大于所有文库表达量平均值２倍以上的目的基因（数据来自日本的ＳｉｌｋＢａｓｅ项目和中国的ＳｉｌｋＤＢ项目）。
同时将这些目的基因按照各自的代谢途径和信号级联反应归类分析，讨论这些途径与丝线的合成、包装、分泌可能的作用方式。
３．２家蚕丝腺表达谱的特点
在分析比较中部丝腺和后部丝腺的表达差异时，我们发现后部丝腺表达的基因种类明显少于中部丝腺表达的基因的种类，大多数后部丝腺表达的基因集中在与丝心蛋白合成和转运相关的途径，而且大多数的同一基因在后部丝腺所表达的丰度要明显高于中部丝腺的表达量。
这在一定程度上说明，后部丝腺是为了分泌占蚕丝蛋白７５％以上的丝心蛋白，相对于中部丝腺进一步在功能上发生了相应的特化。
图２．１家蚕中部丝腺和后部丝腺基因表达丰度及功能分组的对比我们将中部丝腺和后部丝腺表达的基因按功能分组，并比较各组表达丰度。
表达数据来自于日本ＳｉｌｋＢａｓｅ研究项目的５龄期中部丝腺和后部丝腺的ＥＳＴ文库（分别由６５０条和７２９条克隆构成）
Ｆｉｇ．１．ＤｉｆｆｅｒｅｎｃｅｏｆｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｒｏｕｐａｂｕｎｄａｎｃｅｓｏｆｇｅｎｅｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｉｎＭＳＧａｎｄＰＳＧ．Ｗｅｃｌａｓｓｉｆｙｔｈｅｓｅｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｔｏｓｅｖｅｒａｌｇｒｏｕｐｓａｎｄｄｅｐｉｃｔｔｈｅｉｒ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
由６５０和７２９克隆组成），表达丰度最高的是蛋白合成装置（ｐｒｏｔｅｉｎｓｙｎｔｈｅｓｉｓｍａｃｈｉｎｅｒｙ）。
其中核蓿体蛋白（ｒｉｂｏｓｏｍｅｐｒｏｔｅｉｎｓ）的表达数为后部丝腺文库的３８．７６％（２０２条克隆），而只占中部丝腺的１４．１５％（９２条克隆）；然而翻译因子（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓ）的表达丰度则在两个文库比较接近。
在后部丝腺和中部丝腺分别为５．４９％（４０克隆）和５．３８％（３５克隆）．因此在后部丝腺，蛋白质合成对翻译因子的利用效率要更高一些。
此外，我们还发现一些氨基酸合成途径，尤其是丝氨酸合成途径的酶类，在中部丝腺和后部丝腺表达的差异较大，分别为１．０８％（７个克隆）和３．５７％（２６个克隆）。
这些数据也在一定程度上间接证实了家蚕后部丝腺的甘氨酸和丝氨酸间可以积极的合成和代谢，而不是仅仅依赖于血淋巴的供给。
我们从挑选了有丝分裂相关的信号蛋白和细胞自噬蛋白，分别设计特异性引物和简并性引物，利用ＲＴ－ＰＣＲ来检测在丝腺体内的表达情况。
考虑到不同表达丰度的转录本可能对不同检测方法的灵敏度不同，我们同时也选取一些在之前ＥＳＴ文库构建没有检测到表达的，但是丝腺应该表达的管家基因来试图说明这些检测表达技术，包括ＥＳＴ都是有其局限性的。
下图是我们检测后期促进复合物（ａｎａｐｈａｓｅ—ｐｒｏｍｏｔｉｎｇｃｏｍｐｌｅｘ，ＡＰＣ）。
ＡＴＧ４和一些氨酰．转运核糖核酸（ｔＲＮＡ）合成酶在丝腺的表达。
