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实验五叶绿体的分离与荧光观察叶绿体是植物细胞所特有的能量转换细胞器，光合作用就是在叶绿体中进行的。
由于具有这一重要功能，所以它一直是细胞生物学、遗传学和分子生物学的重要研究对象。
叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，利用低速离心即可分离集中进行各种研究。
实验目的一、通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。
二、观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。
实验原理将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。
一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。
在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。
依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。
叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35 mol／L氯化钠或0.4 mol／L蔗糖溶液)中进行．以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。
将匀浆液在1000 r／min的条件下离心2min，以去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞。
然后，在3000 r／min的条件下离心5min，即可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）。
分离过程最好在0～5℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。
荧光显微术是利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行观测的一种技术。
某些物质在一定短波长的光(如紫外光)的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光(如可见光)，这种光就称为荧光。
若停止供能荧光现象立即停止。
有些生物体内的物质受激发光照射后可直接发出荧光，称为自发荧光(或直接荧光)，如叶绿素的火红色荧光和木质素的黄色荧光等。
有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光．这种荧光称为次生荧光(或间接荧光)，如叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光。
细胞生物学实验报告叶绿体的分离与荧光观察1.实验目的：通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。
观察叶绿体自发荧光和次生荧光，熟悉荧光显微镜的使用方法。
2.实验用品：（1）仪器及器材：显微镜、荧光显微镜、载玻片、盖玻片、胶头滴管、离心管、离心机、组织捣碎机、（2）实验药品：NaCl溶液、吖定橙染液（3）实验材料：菠菜3.实验原理：（1）将组织匀浆悬浮在等渗介质中进行差速离心是分离细胞器的常用方法。
差速离心是指将组织悬液放在离心机中，依次增加离心场力、离心时间，以达到分离的目的。
一个颗粒在离心场中的沉降速率取决与颗粒的大小、形状和密度，也与离心力以及悬浮介质的黏度有关。
在一给定的离心场中，同一时间，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。
依次增加离心力和离心时间，就能使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批称将在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。
对于植物细胞而言，分离过程最好在0-5℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。
动物细胞应冷冻离心。
（2）荧光显微术是利用荧光显微镜对可发荧光物质进行观测的一种技术。
其原理基于光致发光。
光致发光是指某种物质被一定的波长照射时，吸收一定的光能进入激发态，从激发态回到基态时，就会以电离辐射的形式释放能量的现象。
如果其释放的激发光的波长比照射光的波长长，且时间小于10-8s以内，这种激发光即可成为荧光。
（3）荧光显微镜比普通显微镜多出的结构是阻断滤片、双色镜和激发滤片。
荧光显微镜有两个光源，一个是激发光源，一般是高压汞灯（发射光的波长在500nm左右）和氙灯；另一个是普通光源，一般采用卤灯泡（发射光的波长在500-600nm左右）。
（4）本实验采用的染料是吖定橙染液。
吖定橙染液是一种核酸染料。
当调节激发光波长为488nm时，吖定橙染液结合于DNA中，其发射波长为540nm，呈绿色；结合于RNA中，发射波长为610nm，呈红色。
当用吖定橙染液对细胞染色后并置于共聚焦显微镜下观察，即可观察到细胞核呈绿色，而细胞质呈红色。
叶绿体的分离纯化及荧光观察叶绿体是植物细胞中的一种细胞器，它是进行光合作用的主要场所。
叶绿体具有一定的自复制能力，可以独立分离出来，纯化叶绿体样品可以方便地进行进一步的实验研究。
本文将详细介绍叶绿体的分离、纯化以及荧光观察的方法。
一、叶绿体的分离1.实验材料准备为了分离叶绿体，我们需要充足的植物组织样品。
可以选择新鲜的叶片或者细胞培养物作为实验材料。
同时，需要准备好一系列试剂，例如缓冲液、葡萄糖、EDTA、PEG等。
2.组织破碎和提取液的准备首先，将植物组织样品冷冻在液态氮中，然后用超声波处理器将样品破碎。
接下来，将破碎的样品用缓冲液溶解，加入适量的葡萄糖和EDTA。
将溶解后的样品在低温条件下离心，然后取出上清液。
3.叶绿体的沉淀将提取液中的上清液用PEG逐渐沉淀叶绿体。
首先加入PEG溶液，并轻轻搅拌。
然后，将样品在低温条件下离心，离心后会出现一个绿色的沉淀。
这个沉淀就是叶绿体。
4.叶绿体的洗涤和纯化将叶绿体的沉淀用缓冲液洗涤数次，然后用离心将叶绿体沉淀下来。
最后，将沉淀的叶绿体用缓冲液悬浮，即可得到纯化的叶绿体样品。
二、叶绿体的荧光观察1.荧光探针的准备为了观察叶绿体的荧光，我们需要准备好合适的荧光探针。
通常使用的探针有二苯基苯酚（DPBF）和二聚(4-乙基-5-（4-甲基吡啶氧基）-2-溴脱氧葡萄糖（DAB）等。
2.荧光探针的添加将纯化的叶绿体置于含有荧光探针的溶液中，静置一段时间。
荧光探针会与叶绿体中的一些分子发生作用，从而产生荧光。
3.荧光观察使用荧光显微镜观察叶绿体的荧光。
将样品放置于荧光显微镜下，设置合适的激发波长和观察波长。
然后观察荧光显微镜中的图像，即可看到叶绿体的荧光。
4.结果分析通过观察叶绿体的荧光，可以得到关于叶绿体活性和光合作用效率的信息。
例如，如果观察到荧光强度较高，可以推测叶绿体的光合作用效率较低。
总结：叶绿体的分离、纯化及荧光观察是研究植物生物学和光合作用的重要方法之一、通过正确的操作流程和合适的实验材料，可以得到纯化的叶绿体样品，并通过荧光观察了解叶绿体的活性和光合作用效率。
姓名班级 13级生命基地班学号同组者：科目细胞生物学实验实验题目叶绿体的分离与荧光观察【实验题目】叶绿体的分离与荧光观察【实验目的】1、通过对植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。
2、观察叶绿体的自发荧光和次生荧光3、熟悉荧光显微镜的使用方法。
【实验材料与用品】1. 器材：离心机、组织捣碎机、天平、荧光显微镜、烧杯、量筒、胶头滴管、刻度离心管六层纱布，载玻片、盖玻片等2. 材料：新鲜菠菜3. 试剂：0.35 mol/L氯化钠溶液，0.01％吖啶橙(acridine orange)【实验原理】I.叶绿体分离的原理匀浆破碎细胞：利用差速离心方法分离等渗介质中的悬浮颗粒，收集类叶绿体大小的颗粒，得到叶绿体。
差速离心:颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的黏度有关。
在一给定的离心场中，同一时间内，密度和颗粒大小不同的颗粒其沉降速度也不同。
依次增加离心力和离心时间，就能使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。
叶绿体的分离应在等渗溶液中进行（0.35mol/L氯化钠溶液或0.4mol/L蔗糖溶液），以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。
分离过程最好在0-5℃条件下进行：如果在室温下，要姓名班级 13级生命基地班学号同组者：科目细胞生物学实验实验题目叶绿体的分离与荧光观察迅速分离和观察。
II.差速离心特点：介质密度均一，速度由高到低，逐级离心；用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器；沉降顺序：核---线粒体---溶酶体和过氧化物酶体---内质网与高尔基体---核蛋白体，可将细胞器初步分离，常需要进一步通过密度梯度离心再进行分离纯化。
III.①荧光的概念光致发光：某些物质在照射下，吸收光能进入激发态，当从激发态回到基态时，可以以电磁辐射的形式释放出吸收的光能，这种现象称为“光致发光”。
紫外辐射、可见光以及红外辐射均可引起光致发光，如磷光和荧光。
叶绿体的分离及荧光观察XXX,YYY,ZZZ一、实验目的：1通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法2观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法二、实验原理：将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。
一个颗粒在离心场中的沉降速度取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的黏度有关。
在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。
以此增加离心力和离心时间，就能使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。
叶绿体分离应在等渗溶液中进行，以免渗透压改变使叶绿体损伤。
将匀浆在1000r/min 的条件下离心2分钟，以除去其中的组织残渣和未被破碎的完整细胞。
然后，在3000r/min 的条件下离心5min，即可获得沉淀的叶绿体。
分离过程最好在0~5℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。
利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行检测时，受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。
因此在荧光观察时应抓紧时间，有必要时立即拍照，；另外，在制作荧光显微镜标本时最好使用无荧光载玻片、盖玻片和无荧光油。
三、实验用品：1、材料：新鲜菠菜2、试剂：0.35mol/L氯化钠溶液、0.01％吖啶橙。
3、器材：离心机、组织捣碎机、粗天平、荧光显微镜、盖玻片、载玻片、烧杯等四、实验步骤：1、叶绿体的分离与观察：（1）取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗，称30g于150mL0.35mol/L NaCl溶液中，装入组织捣碎机。
（2）利用组织捣碎机低速（5000r/min）匀浆3~5分钟。
（3）将匀浆用六层纱布过滤于500mL烧杯中。
（4）取滤液4ml在1000r/min下离心2分钟。
弃去沉淀。
（5）将上清液在3000r/min下离心5min。
弃去上清液，沉淀即为叶绿体（混有部分细胞核）。
（6）将沉淀用0.35mol/L氯化钠溶液悬浮。
叶绿体分离与荧光染色观察日姓名系年级组别同组者科目细胞生物学实验题目叶绿体分离与荧光染色观察学号叶绿体分离与荧光染色观察一．实验目的1．通过植物细胞叶绿体的分离与纯化，了解细胞器分离与纯化的原理和方法。
2．熟悉荧光显微镜的使用方法，观察叶绿体的自发荧光和次生荧光。
二．实验原理1．叶绿体分离的原理匀浆破碎细胞，利用差速离心方法分离等渗介质中的悬浮颗粒，收集类叶绿体大小的颗粒，得到叶绿体。
差速离心：颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。
在一给定的离心场中，同一日姓名系年级组别同组者科目细胞生物学实验题目叶绿体分离与荧光染色观察学号时间内，密度和颗粒大小不同的颗粒其沉降速率不同。
依次增加离心力和离心时间，就能使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。
叶绿体的分离应在等渗溶液（0.35mol/L的氯化钠或0.4mol/L的蔗糖溶液）中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。
分离过程最好在0-5℃的条件下进行，如果在室温下，要迅速分离和观察。
2．差速离心特点：介质密度均一，速度由高到低，逐级离心；日姓名系年级组别同组者科目细胞生物学实验题目叶绿体分离与荧光染色观察学号用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器；沉降顺序：核----线粒体----溶酶体与过氧化物酶体----内质网与高尔基体---核蛋白体，可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯度离心再行分离纯化。
3．荧光的概念光致发光：某些物质在照射下，吸收光能进入激发态，当从激发态回到基态时，可以以电磁辐射的形式释放出吸收的光能，这种现象称为“光致发光”。
紫外辐射、可见光及红外辐射均可引起光致发光，如磷光与荧光。
荧光：在光致发光中，如果一定波长的短波光（如紫外光）照射某种物质，这种物质吸收光能后进入激发态，并且立即退激发在极短的时间日姓名系年级组别同组者科目细胞生物学实验题目叶绿体分离与荧光染色观察学号内能发射出比照射光波更长的光（如可见光），这种光就称为荧光。
一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。
荧光分为自发荧光或诱发荧光（次生荧光、续发荧光、间接荧光）。
某些物质受激发光照射后可直接发出荧光，如叶绿素、血红素的火红色荧光或木质素的黄色荧光的等，称为自发荧光（直接荧光）某些物质本身不发荧光，但它经荧光染料染色后，再通过紫外线照射同样也能发出荧光，这样荧光称为诱发荧光，如叶绿体被咩啶橙染色后可发桔红色荧光。
4．荧光显微镜的操作及注意事项（1）接通电源，打开启动装置开关；（2）按starter按钮3-5秒以启动激发光源。
注意starter键不能超过5秒。
启动2-3分钟后日姓名系年级组别同组者科目细胞生物学实验题目叶绿体分离与荧光染色观察学号方可稳定，启动15分钟内不得关闭电源，一旦关闭汞灯，3分钟内不得重启，用完后关闭main switch；（3）选择相对应的激发虑片、阻断虑片和双色镜。
放置样品，先在普通光镜下选择好要观察的视野；（4）关闭普通光源后，撤开UV挡板，即可观察到样品的萤光情况，需要照相时，要及时拍照，否则可能拍不到萤光照片；（5）观察结束后，关闭main switch，切断电源。
三．实验材料1．材料新鲜菠菜。
日姓名系年级组别同组者科目细胞生物学实验题目叶绿体分离与荧光染色观察学号2．试剂（1）0.35mol/L的NaCl等渗溶液；（2）0.01%吖啶橙（acridine orange）称取0.1g吖啶橙加蒸馏水100ml做母液，储存于棕色瓶，置4℃冰箱保存。
临用前取1mL母液加1/15mol/L磷酸缓冲液（pH4.8）9mL。
3．器材普通或高速离心机（九阳豆浆机）、荧光显微镜、研钵、滴管、漏斗、离心管，天平，量筒，纱布。
四．实验步骤1．选取新鲜嫩绿的菠菜叶，去叶梗及其粗脉，洗净擦干，称取30g放于150ml0.35M.的NaCl 溶液中；日姓名系年级组别同组者科目细胞生物学实验题目叶绿体分离与荧光染色观察学号2．将叶和液体同时装入组织捣碎机中（豆浆机中），匀浆3-5min，转速5000r/min；3．将匀浆用纱布（6层）过滤于500ml烧杯中；4．将滤液4ml在1000r/min下离心2min；5．取上清液在3000r/min下离心5min（沉淀为叶绿体和细胞核混合物）；6．将沉淀用2-3ml0.35M.的NaCl液悬浮；7．取一滴悬液滴片，加盖玻片后显微镜下观察；8．另外取一滴悬液滴片，再加一滴0.01%的吖啶橙染料混匀，盖上盖玻片，在荧光显微镜下观察。
五．实验结果1．实验结果如下图所示：日姓名系年级组别同组者科目细胞生物学实验题目叶绿体分离与荧光染色观察学号图中圆形或椭图1普通光镜下叶绿体形态（10×40）日姓名系年级组别同组者科目细胞生物学实验题目叶绿体分离与荧光染色观察学号图2荧光显微镜下叶绿体的自发荧光日姓名系年级组别同组者科目细胞生物学实验题目叶绿体分离与荧光染色观察学号图3（1）荧光显微镜下叶绿体的次生荧光日姓名系年级组别同组者科目细胞生物学实验题目叶绿体分离与荧光染色观察学号图3（2）荧光显微镜下叶绿体的次生荧光叶绿体在荧光显微镜下观察到的图样，图2为叶绿体的自发荧光，为火红色；图3（1）、（2）为叶绿体的次生荧光，为橘红色。
2．实验结果分析日姓名系年级组别同组者科目细胞生物学实验题目叶绿体分离与荧光染色观察学号表1叶绿体普通观察与荧光染色结果对比观察方式普通光学显微镜荧光显微镜染色后荧光观察观察结果普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的叶绿体自发荧光为火红色，呈斑状分布，其他部分为黑色间接荧光为橘红色，占很少一部分，其他大部分为绿色日姓名系年级组别同组者科目细胞生物学实验题目叶绿体分离与荧光染色观察学号绿色小颗粒，即基粒。
另外还有一些其他组织碎片结果分析普通光学显微镜下观察到叶绿体的正常结构。
离心不纯导致混有其他组织碎片叶绿体经激发光波照射后，自发荧光呈现火红色，因叶绿体在其悬液中呈现点状均匀分布，且悬液其他组分无自发荧光反应，故观察到斑状分布的叶绿体次生荧光的来由，橘红色为叶绿体的荧光效果，叶绿体的悬液中混有的细胞核碎片中的核酸经丫啶橙染色荧光反日姓名系年级组别同组者科目细胞生物学实验题目叶绿体分离与荧光染色观察学号火红色荧光效应呈现绿色果六．思考与讨论1．注意事项（1）要得到完整的、有活性的叶绿体，须在低温下迅速提取，涂片后立即观察，注意离心时的时间及强度。
（2）利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行观察室，会收到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。
因此在进行荧光观察时应抓紧时间，必要时应立即拍照。
（3）在制作荧光显微标本时最好使用物荧光载玻片、无荧光盖玻片香柏油。
2．思考题日姓名系年级组别同组者科目细胞生物学实验题目叶绿体分离与荧光染色观察学号（1）在荧光显微镜下观察叶绿体的自发荧光时，更换滤片系统，叶绿体的颜色是否有变化？有变化。
因为叶绿体的颜色取决于发出荧光能量的高低，更换不同的滤片，激发光会不同，叶绿体得到和辐射的能量就会不同，颜色也就会不一样（2）游离的叶绿体和完整细胞内的叶绿体，在荧光显微镜下，颜色和荧光强度有无区别，为什么？有区别。
因为完整细胞内的叶绿体还要进行光合作用，这会消耗掉一部分所吸收的光，所以最后释放的荧光能量就会比游离核糖体所释放的小，颜色和荧光强度就会有差别。
（3）根据观察到的实验现象，简述自发荧光和日姓名系年级组别同组者科目细胞生物学实验题目叶绿体分离与荧光染色观察学号次生荧光的区别？自发荧光指不需染色，只需在激发光照射下即可发荧光的现象，而次生荧光需要染色。
因为发光机制不同，所用的滤光片也会不同，最后发出的荧光颜色也会不同。
（4）叶绿体分离的原理是什么？操作过程应注意什么？采用的方法是差速离心法，利用不同颗粒大小、形状不同导致沉降速率不同，把叶绿体大小的颗粒沉降出来。
叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L 氯化钠或0.4mol/L 蔗糖溶液)中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤；分离过程最好在0～4℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观日姓名系年级组别同组者科目细胞生物学实验题目叶绿体分离与荧光染色观察学号察。
3．实验小结通过本次实验，我们学习了植物细胞叶绿体的分离与纯化的原理和方法，并且学习了荧光显微镜的使用方法，观察了叶绿体的自发荧光和次生荧光。
此外，通过实验课上理论知识的学习，对叶绿体荧光染色以及荧光等理论知识有了一定的了解，并观察了叶绿体在光学显微镜下以及荧光显微镜下自发荧光和次生荧光的结果，收获较大。
