抗药性突变株的获取和突变率测定

实验十用梯度平板法筛选大肠杆菌抗药性突变株【实验目的】：了解并熟悉抗药性突变株的筛选原理和方法【实验原理】：经诱变处理后的微生物群体中，虽然突变的数目大大增加，但所占的比例仍然是整个群体中的极少数。

为了快速、准确地得到所需的突变体，必须设计一个合理的筛选方法，以杀死大量的未发生突变的野生型，而保留极少数的突变型。

梯度平板法是筛选抗药性突变型的一种有效简便方法，其操作要点是：先加入不含药物的培养基，立即吧培养皿斜放，待培养基凝固后形成一个斜面，再将培养皿平放，倒入含一定浓度药物的培养基，这样就形成一个药物浓度梯度由浓到稀的梯度培养基，然后再将大量的菌液涂布于平板表明上。

经培养后，在高浓度药物处出现的菌落就是抗药性突变型菌株。

【材料和器皿】：（1）菌种：大肠埃希氏菌（2）培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，2×（2倍浓度）牛肉膏蛋白胨培养液（分装于小三角瓶中，每瓶装20ml），生理盐水。

（3）器皿：培养皿，涂布棒，移液管，滴管，离心机【方法和步骤】：1 制备菌液从已活化的斜面菌种上挑一环大肠埃希氏菌于装有5ml牛肉膏蛋白胨培养液的无菌离心管中（接2支离心管），置37℃条件下培养16h左右，离心（3500r/min，10min），弃去上清液后再生理盐水洗涤2次，弃去上清液，重新悬浮于5ml的生理盐水中。

并且将2支离心管的菌液一并倒入装有玻璃珠的三角瓶中，充分振动以分散细胞，制成108/ml的菌液。

然后吸3ml菌液于装有磁力搅拌棒的培养皿中。

2 紫外线照射（1）预热紫外灯：紫外灯功率为15W，照射距离30cm。

照射前先开灯预热30min。

（2）照射：将培养皿放在磁力搅拌器上，先照射1min后再打开皿盖并计时，当照射达2Min 后，立即盖上皿盖，关闭紫外灯。

3 增殖培养（在暗室红灯下操作）照射完毕，用无菌滴管将全部菌液吸到含有3ml 2×牛肉膏蛋白胨培养液的小三角瓶中，混匀后用黑纸包裹严密，置37℃培养过夜。

大肠杆菌紫外线诱变及抗药性菌株筛选0740063 阿噟兰1.前言抗生素能破坏细菌细胞壁的结构，使细菌的繁殖和生长受到抑制。

但某些细菌对抗生素表现出抗性，原因是其基因发生了改变，产生能抵抗抗生素的性状。

在自然情况下，细菌的基因突变率很低，而且突变是不定向的，因此在自然条件下，想要获得有抗性的细菌是很困难的。

当给与适当的物理条件时，其突变率会大大增加。

如当用α射线、β射线、γ射线、Χ射线、中子和其他粒子、紫外线、微波等物理因素辐射时，能够促进遗传物质突变。

DNA 对紫外线（UV）有强烈的吸收作用，尤其是碱基中的嘧啶，它比嘌呤更为敏感。

紫外线引起DNA 结构变化的形式有DNA 链断裂、碱基破坏、胸腺嘧啶二聚体等。

因此，紫外线通常作为诱变剂，用于微生物菌种选育。

一般细胞分裂越旺盛，诱变剂量越大，突变率高，诱变最有效的波长253~265 nm。

选择合适的诱变剂量对于获得较高突变率十分关键，过高或过低的辐射剂量会导致菌株死亡或诱变不充分而降低诱变效果。

在紫外线诱变下，菌株发生不定向的突变，想要得到需要的特向变异必须对诱变后的菌株做筛选。

本实验想要得到的是能够抵抗抗生素的菌株，因此可以用抗生素培养基作为筛选培养基对菌种进行筛选。

若菌株没有发生定向突变，则该菌株不能在抗性培养基上正常生长，只有发生了定向突变才可能在筛选培养基上正常生长。

紫外线对于菌株有诱变作用外，对菌株还有较强的致死作用，因为紫外线改变了菌株的基因结构导致菌株无法正常生长繁殖。

因此，通过本实验的操作，在合适的照射剂量的设置下，比较不同不同照射剂量下的致死效果和突变率，并初步分析两者的相关性。

在分析死亡曲线和诱变率曲线的基础上，能了解诱变育种的机理和方法，为做进一步的诱变实验做准备。

2.材料和方法2.1实验材料、仪器和试剂菌种：大肠杆菌仪器：超净台、离心机、高压灭菌锅、培养箱、磁力搅拌器、培养皿、涂布器、移液管、移液器试剂：牛肉膏蛋白胨培养基相关试剂、硫酸卡那霉素水溶液（50mg/ml）、生理盐水2.2实验方法2.2.1制备培养基普通培养基——牛肉膏蛋白胨培养基（400ml）：牛肉膏5g 蛋白胨10g Nacl 5g 琼脂20g 蒸馏水1000ml Ph7.0按配方配制好培养基后置于灭菌锅中115℃15min，倒平板，4皿*15ml*5组+2皿*15ml=22皿*15ml=330ml筛选培养基(200ml)：含抗生素50mg/L。

紫外诱变技术及抗药性突变菌株的筛选紫外诱变技术及抗药性突变菌株的筛选姓名：张鑫淼班级：生工1301一．实验目的以紫外线处理细菌细胞为例，学习微生物诱变育种的基本技术。

了解细菌抗药性突变株的筛选方法二．实验材料菌株：大肠杆菌（Escherichia coli）培养基：营养肉汤（nutrient broth）固体和液体培养基试剂：2mg/ml链霉素，（Str）母液，无菌生理盐水。

仪器：1ml的移液管17个，10ml移液管11个，无菌试管9个，无菌培养皿15个，无菌三角瓶7个（其中一个内有无菌的玻璃珠20~40粒），无菌漏斗（内有两层擦镜纸），无菌离心管1个，离心机，紫外诱变箱等营养肉汤蛋白胨10g牛肉膏3g氯化钠5g蒸馏水1000mLpH 7.4 营养琼脂蛋白胨10g牛肉膏3g氯化钠5g琼脂15～20g蒸馏水1000mL三．实验原理以微生物的自然变易作为基础的筛选菌种的机率并不很高。

因为自发突变率小，一个基因的自发突变率仅为10-6~10-10左右。

为了加大突变频率，可采用物理或化学的因素进行诱发突变。

物理因素中目前使用得最方便且十分有效是UV，UV诱变一般采用15w 的紫外灭菌灯，其光谱比较集中在253.7nm处，这与DNA的吸收波长一致，可引起DNA 分子结构发生变化，特别是嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体，从而引起菌种的遗传特性发生变易。

在生产和科研中可利用此法获得突变株。

链霉素属氮基糖昔类抗生素，其杀菌机理是作用于核糖体小亚基，使其不能与大亚基结合组成有活性的核糖体，从而阻断细菌蛋白质的合成。

细菌对链霉素产生抗药性的作用机理一般是由于编码核糖体蛋白S12的rpsL基因或其他基因发生突变，导致相应的核糖体蛋白发生改变，是蛋白质合成不再受链霉素抑制。

四．实验内容与操作步骤（一）出发菌株菌悬液的制备1. 出发菌株移接新鲜斜面培养基，37℃培养16~24h；2. 将活化后的菌株接种于液体培养基，37℃ 110rpm振荡培养过夜（约16h），第二天，以20~30%接种量转接新鲜的营养肉汤培养基，继续培养2~4h；3. 取1ml培养液与1.5ml离心管中，10000rpm离心3~5min，弃去上清液，加1ml无菌生理盐水，重新悬浮菌体，再离心，弃去上清，重复上述步骤用生理盐水恢复成菌悬液；4. 将上述菌悬液倒入装有小玻璃珠的无菌三角瓶内（预先加入9ml无菌生理盐水），振荡20~30min，以打散细胞；5. 取诱变前的0.5ml 菌悬液进行适当稀释分离，取三个合适的稀释度倾注营养琼脂平板，每一梯度倾注两皿，每皿加1ml菌液，37℃倒置培养24~36h，进行平板菌落计数。

2022年福建技术师范学院食品科学与工程专业《微生物学》期末试卷B(有答案）一、填空题1、细胞壁的主要功能，一是______，二是______，并具有______、______以及______。

2、T4噬菌体由______、______和______三部分组成。

3、耐氧菌之所以能在有氧的环境中生存，而不被超氧阴离子自由基所毒害，原因是其细胞内存在______和______两种酶。

4、放线菌为7.5～8.@5、酵母菌菌为3.8～6.@0、霉菌为4.0～5.@8、藻类为6.0～7.@0、原生动物为6.0～8.0。

@43、培养基按所含成分可分为______、______和______；按物理状态可分为______、______、______和______；按用途可分为______和______。

5、真菌是不含有______素、______营养，以______进行繁殖的真核微生物。

6、微生物包括的主要类群有______、______和______。

7、1971年，McCord和Fridovich提出了一个关于厌氧菌氧毒害机制的______学说。

其根据是厌氧菌缺乏______酶，一般也缺乏______酶，因此易受______等的毒害。

8、微生物将空气中的N2还原为NH3的过程称为______。

该过程中根据微生物和其他生物之间相互的关系，固氮体系可以分为______、______ 和______3种。

9、线粒体的核糖体在大小上类似于原核生物的核糖体，线粒体与细菌之间的近缘关系，支持真核的细胞器（线粒体、叶绿体）是由______演化出来的假设。

10、具有免疫原性和反应原性的抗原称为______，具有______而没有______的抗原称为半抗原。

二、判断题11、放线菌是一类陆生性较强的原核生物，它们产生的孢子都是不长鞭毛的。

（）12、只有能利用无机氮化物合成氨基酸的微生物，才属于氨基酸自养微生物。

（）13、肽聚糖合成过程中的一个重要中间产物称作“Park”核苷酸，就是UDP-N-乙酰胞壁酸四肽。

关于生物抗药性的两个经典实验关于生物抗药性的两个经典实验生物都具有不同程度的抗药性，抗药性的出现是突变的结果，是不定向。

通过一系列的实验可以证明这个结论。

在实验题中常出现两个经典的实验：1 果蝇抗药性的实验为了证实突变和自然选择学说，实验者曾把混合群体中的果蝇成对分开，繁殖为若干家系。

把每一家系分装两瓶，让其中一瓶作DDT 的抗性鉴定，也就是把涂有一定剂量DDT的玻片放入各个家系供鉴定的果蝇瓶中。

如果鉴定结果某一家系存活率最高，就把该家系另一瓶未放DDT玻片的果蝇选留，再一对对分开繁殖为若干家系。

每一家系同样分装两瓶，让其中一瓶作DDT的抗性鉴定，并增加玻片上DDT的剂量。

鉴别结果又有某一家系存活率最高，便又把该家系另一瓶未和DDT玻片的果蝇选留，同样再一对对分开繁殖。

这样，经过连续十多次的鉴定和选择，并且每次鉴定都增加玻片上DDT的剂量，选留下来的抗性家系抗DDT的能力可比原来的增加几百倍。

在这一实验中，DDT只起选择鉴别的作用，每次留下来作种的是抗性家系中未接触DDT的那一半，所以从实验开始到结束，它的后代都从未接触过DDT，这证明果蝇的抗药性不是定向变异和获得性遗传，而是在突变基础上单向性选择的结果。

2细菌抗药性实验用细菌作实验更可以在短期内获得卓有成效的结果，其中最著名的是利德伯格创造的细菌影印培养实验（见下图）。

实验开始，把液体培养的细菌涂布在含细菌生长必需营养成分的洋菜培养基上（1，2），保温培养约24小时后，就会在培养基表面出现由每个细菌细胞分裂繁殖所形成的许多菌落。

这时，可用缚有平绒跟培养皿直径一致的圆柱体按预先做好的箭号标证印到培养基上。

这样，每个细菌菌落便有部分细菌细胞按一定位置影印到平绒上（3）。

把缚有平绒的圆柱体同样按照箭号标记转移影印到另一个含青霉素或链霉素的洋菜培养基上（4），再保温培养，就可鉴定出那些能继续繁殖的抗性菌落。

这些抗性菌落是不是接触了抗菌素以后通过定向变异产生的呢？按照抗性菌落的位置在原来培养基上找出相应的菌落，并把它们接种到不含抗菌落，并把它们接种到不含抗菌素的洋菜培养基上，由于有其他细菌的竞争，由它们所形成的菌落便布满在洋菜培养基上。

实验五报告大肠杆菌抗药性突变株的分离PB12210261 徐导中国科学技术大学生命科学学院【摘要】大肠杆菌有个体小、生活周期短、常能在简单的合成培养基上迅速繁殖等特点，并且可以在相同条件下处理大量个体，所以是进行遗传学研究的良好材料。

微生物的抗药性突变是DNA分子的某一特定位置的结构改变所致，与药物的存在无关，某种药物的存在只是作为分离某种抗药性菌株的一种手段，而不是作为引发突变的诱导物。

【关键词】大肠杆菌抗药性培养基【Abstract】Escherichia coli is individual small, short life cycle, can often features multiply rapidly in synthetic medium and simple, and can handle a large number of individuals under the same conditions, so that it is a good material for genetic research. Microbial resistance mutations are changes in DNA molecules in a specific position caused by the structure, has nothing to do with the presence of drug, a drug exists only as a means of separating a resistant strain, rather than as a trigger induced mutation.【Key words】Escherichia coli Resistance Culture medium【前言】大肠杆菌作为外源基因表达的宿主，遗传背景清楚，技术操作简单，培养条件简单，大规模发酵经济，倍受遗传工程专家的重视。

2005-2006学年度第二学期《普通微生物学》期终试卷B卷参考答案一．名词解释，请解释下列名词（共20分，每小题2分）：1. 悉生生物凡是接种了某种或某些已知纯种微生物的无菌动物或植物，称为悉生生物。

2. 性导当Hfr菌株细胞内的F质粒因不正常切离而脱离染色体组时，可以重新形成游离的、但携带整合点附近的一小段染色体基因的F’质粒，当携带F’质粒的菌株和F-菌株结合时，可将供体菌的部分基因连同F质粒一起传递给受体菌，这种通过F’质粒传递供体基因的方式称为性导，又称为F质粒或F因子转导。

3. 延滞期又称为停滞期，指少量单细胞微生物接种到新鲜的培养液中后，在开始培养的一段时间内，因代谢系统适应新环境的需要，细胞数目没有增加的一段时期。

4. 锁状联合蕈菌在菌丝延伸时通过形成喙状突起而连接两个细胞的方式不断时双核细胞分裂，从而不断使菌丝尖端不断向前延伸，此种菌丝细胞分裂的方式称为锁状联合。

5. 单克隆抗体由一纯系B淋巴细胞克隆经分化增殖后的浆细胞所产生的单一成分、单一特异性的免疫球蛋白分子。

6. 模式菌株指能够代表一个微生物种的典型菌株以及由该菌株传代得到的与原初菌株完全一致的纯培养物。

7. 假菌丝指酵母细胞经过一系列的芽殖后，长大的子细胞与母细胞不立即分离，其间仅以狭小的面积相连，这种藕节状的细胞串就称为假菌丝。

8. 抗代谢药物是指一类在化学结构上与细胞内必需代谢物的结构相似，并可以干扰正常代谢活动的物质。

9. 伴孢晶体少数芽孢杆菌在形成芽孢的同时，会在芽孢旁形成一颗菱形、方形或不规则形的碱溶性的蛋白质晶体称为伴孢晶体，又称为δ内毒素。

10. 次生F’菌株通过F’菌株与F-菌株的结合，使后者也成为F’菌株，这就是次生F’菌株。

11. LPS位于革兰氏阴性细菌细胞壁最外层的一层较厚（8-10nm）的类脂多糖类物质，有类脂A、核心多糖、O-特异侧链3部分组成。

12. 异形胞是存在于丝状生长的蓝细菌种类中的形大、壁厚、专司固氮功能的细胞，数目少而不定，位于细胞链的中间或末端。