蔗糖合成酶(分解方向;SS-I)活性检测试剂盒说明书 可见分光光度法

土壤蔗糖酶(Solid-Sucrase,S-SC）试剂盒使用说明分光光度法50管/24样货号：BC0240产品简介：S-SC能够水解蔗糖变成相应的单糖而被机体吸收，其酶促作用产物与土壤中有机质、氮、磷含量，微生物数量及土壤呼吸强度密切关，是评价土壤肥力的重要指标。

S-SC催化蔗糖降解产生还原糖，进一步与3，5－二硝基水杨酸反应，生成棕红色氨基化合物，在540nm有特征光吸收，在一定范围内540nm光吸收增加速率与S-SC活性成正比。

试验中所需的仪器和试剂：可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、冰、甲苯（不允许快递）和蒸馏水。

产品内容：试剂一：甲苯5mL×1瓶，4℃保存；（自备）试剂二：液体15mL×1瓶，4℃保存；试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前每瓶加入40mL蒸馏水充分溶解备用；试剂四：液体45mL×1瓶，4℃保存；标准品：粉剂×1支，4℃保存，含10mg无水葡萄糖（干燥失重<0.2%），临用前加入1ml 蒸馏水溶解备用，4℃可保存1周，或者用饱和苯甲酸溶液溶解，可保存更长时间。

标准品准备：将标准品用蒸馏水稀释至0.5、0.4、0.3、0.2、0.1mg/ml。

操作步骤：试剂名称测定管对照管标准管风干土样（g）0.10.1-试剂一（μL）1515-振荡混匀，使土样全部湿润，37℃放置15min-试剂二（μL）250250-试剂三（μL）750--蒸馏水（μL）-750-混匀，放入37℃水浴培养24小时，10000g，4℃，离心5min，取上清液，同时准备标准品上清液或标准品（μL）200200200试剂四（μL）500500500充分混匀，放入沸水浴中煮沸5min（盖紧，以防止水分散失），流水冷却后充分混匀。

标准曲线的建立：540nm处蒸馏水调零，读标准管吸光值A。

以浓度（y）为纵坐标，吸光度A（x）为横坐标建立标准曲线。

货号：QS2504 规格：50管/24样蔗糖合成酶（Sucrose synthase，SS）试剂盒说明书可见分光光度法正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定测定意义：蔗糖是源（叶片等）光合产物向“库”器官运输的主要形态。

蔗糖合成酶（Sucrose Synthase, EC 2.4.1.13）是双向反应酶，既可催化蔗糖合成又可催化蔗糖分解，是蔗糖代谢的关键酶之一。

研究其合成方向SS-Ⅱ的活性对于植物蔗糖合成具有重要意义。

测定原理：SS-Ⅱ催化游离果糖与葡萄糖供体UDPG反应生成蔗糖，蔗糖与间苯二酚反应可呈现颜色变化，在480nm下有特征吸收峰，酶活力大小与颜色的深浅成正比。

自备实验用品及仪器：可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、移液器、1 mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水试剂的组成和配制：提取液：液体60mL×1瓶，4℃保存；试剂一：液体4mL×1瓶，-20℃保存；试剂二：1000μg/mL蔗糖溶液10mL×1瓶，4℃保存；试剂三：液体3mL×1瓶，4℃保存试剂四：液体40mL×1瓶，4℃保存；试剂五：液体10mL×1瓶，4℃保存；样品测定的准备：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL 提取液），进行冰浴匀浆。

8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

测定管需要设一个对照管。

SS-Ⅱ活性计算：第1页，共2页1、按照蛋白浓度计算单位定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1μg 蔗糖定义为一个酶活力单位。

SS-Ⅱ活性(μg /min/mg prot)= C标准管×V1×（A测定管-A对照管)÷（A标准管-A空白管)÷(V1×Cpr)÷T=100×（A测定管-A对照管)÷（A标准管-A空白管)÷Cpr2、按照样本鲜重计算单位定义：每g组织每分钟催化产生1μg 蔗糖定义为一个酶活力单位。

货号：MS2508 规格：100管/96样蔗糖磷酸化酶（Sucrose Phosphorylase, SP）试剂盒说明书微量法注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：SP(EC2.4.1.7)主要存在于微生物和植物中，裂解葡萄糖苷键，催化葡萄糖基转移到果糖、木糖、半乳糖和鼠李糖等，合成相应的葡萄糖基低聚糖。

此外，SP还能催化氢醌合成熊果苷，具有极强的美白效果，在化妆品工业中具有重要应用。

测定原理：SP能够以磷酸为受体，催化蔗糖产生1-磷酸葡萄糖，在葡萄糖磷酸变位酶催化下变位为6-磷酸葡萄糖，在6-磷酸葡萄糖脱氢酶作用下还原NADP+生成NADPH，导致340nm光吸收值增加。

测定340nm吸光度增加速率，即可计算SP活性。

自备实验用品及仪器：天平、低温离心机、恒温水浴锅、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板和蒸馏水。

试剂组成和配制：提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存。

缓冲液：液体10mL×1瓶，4℃保存。

试剂一：液体5mL×1瓶，4℃保存。

试剂二：液体1.5mL×1支，4℃保存。

试剂三：液体1mL×1支，4℃保存。

试剂四：粉剂×1支，-20℃避光保存，临用前加1mL双蒸水溶解。

试剂五：粉剂×1支，-20℃避光保存，临用前加1mL双蒸水溶解。

试剂六：粉剂×1支，-20℃避光保存，临用前加2mL双蒸水溶解。

试剂七：粉剂×1支，-20℃避光保存，临用前加2mL双蒸水溶解。

粗酶液提取：1.组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后10000g，4℃，离心10min，取上清待测。

2.细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后10000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。

实验一蔗糖酶活力测定一、目的要求了解蔗糖酶的性质及3,5–二硝基水杨酸比色法测定蔗糖酶活力的实验原理，熟练掌握其测定方法。

二、实验原理蔗糖酶（sucrase, EC 3.2.1.26）又称转化酶，蔗糖在其作用下，水解为D–葡萄糖与D–果糖。

酵母细胞含丰富的蔗糖酶（胞内酶），细胞破壁后释放出来的蔗糖酶可以从果糖末端切开蔗糖的果糖糖苷键，使蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，葡萄糖和果糖是还原糖，其含量可通过3,5–二硝基水杨酸比色法测定，从而度量酶活力的大小。

蔗糖酶活力定义为：在35℃实验缓冲液条件下，每3min释放1mg还原糖的酶量为1酶活单位。

由于蔗糖酶在碱性条件下极易失活，所以可用碱终止酶解反应。

3,5–二硝基水杨酸定糖法实验原理：利用3,5–二硝基水杨酸溶液和还原糖溶液共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在520nm波长处有最大吸收峰，在一定范围内其吸光度与还原糖含量呈线性关系，可用于还原糖含量测定。

三、试剂和仪器（一）试剂1、3,5–二硝基水杨酸试剂（DNS）。

甲液：溶解6.9g结晶酚于15.2mL 10%NaOH，并用水稀释至69 mL，在此溶液中加6.9 g NaHSO3。

乙液：称取255 g酒石酸钾钠置于300 mL 10%NaOH中，再加入880 mL 1%3,5–二硝基水杨酸溶液。

将甲、乙两溶液混合即得到颜色呈黄色的使用液，贮于棕色瓶中，室温下放置7–10天后使用。

1、葡萄糖标准使用液（1mg/mL）：称取干燥的葡萄糖0.1000 g，溶于水并定溶至100 mL。

2、5%蔗糖溶液：称取5.00 g蔗糖用pH5.5 0.1mol/L 醋酸-醋酸钠缓冲溶液配置成100mL。

3、1mol/L NaOH。

(二)仪器1、电热恒温水浴锅。

2、721分光光度计。

1、秒表或手表。

四、操作方法1、标准曲线制备使用1cm比色皿，在520nm波长条件下，以试剂空白条零，测定各管吸光值。

用坐标纸绘制标准曲线；或用回归法计算求出以A520nm值为自变量，葡萄糖含量(mg)为因变量的直线方程。

蔗糖合成酶的测定方法一、仪器设备冷冻离心机、恒温水浴、分光光度计二、试剂HEPES-NaOH（50mmol/L，pH7.5）缓冲液，包括50mmol/L MgCI2；2mmol/LEDTA；0.2%(W/V)BSA；2%PVP；0.1%间苯二酚：称取0.1g溶解并定溶于100ml 95%乙醇中。

30%盐酸、2mol/L NaOH、100mmol/L UDPG、100mmol/L6-磷酸果糖、100mmol/L 果糖三、操作方法1、粗酶液制备称取0.5g样品（植物叶片去掉主叶脉），洗净剪碎，置于预冷的研钵中，加3ml Hepes-NaOH 缓冲液，冰浴研磨，10000×g离心10min。

2、酶活性测定依次加入50μL粗酶液，50μLHepes-NaOH缓冲液pH7.5，20μL 50 mmol/LMgCI2，20μL 100mmol/L UDPG，20μL 100mmol/L6-磷酸果糖（20μL 100mmol/L果糖），30℃中反应30min后，加入200μL 2mol/L NaOH终止反应，沸水煮10min，流水冷却，加入1.5ml 30%盐酸和0.5ml 0.1% 间苯二酚，摇匀后置于80℃水浴保温10min，冷却后置于480nm处，以提前杀死酶活性为空白比色测定蔗糖含量。

同时取50μL粗酶液，加入200μL 2mol/L NaOH，以下同上操作，测定蔗糖含量。

3、蔗糖标线制作：取0、40、80、120、160、200μg/ml的蔗糖溶液50μL，操作同上，然后以蔗糖浓度为纵坐标，以吸光值为横坐标，得方程。

4、计算样品中酶活性（μg·g﹣1·h﹣1）=式中C—反应液催化产生的蔗糖总量（μg）；V1—提取酶液时加入的缓冲液体积（ml）；V2—酶反应时加入的粗酶液体积（ml）淀粉酶活性的测定1方法1.1试剂配制淀粉酶提取缓冲液：0.1mol/L-1柠檬酸溶液(pH 5.6);1%的淀粉溶液：用0.1mol/L-1的柠檬酸缓冲液(pH 5.6)配制；标准麦芽糖溶液(1mg/mL-1);3,5-二硝基水杨酸试剂(DNS试剂):称取6.5 g 3,5-二硝基水杨酸溶于少量水中，移入1000 mL容量瓶中，加入325 mL 2mol·L-1 NaOH溶液，再加入45g丙三醇，摇匀，冷却后定容到1000 mL。

蔗糖酶测定1.分析意义：蔗糖酶是根据其酶促基质----蔗糖而得名的。

又叫转化酶或β-呋喃果糖苷酶。

它对增加土壤中易溶性营养物质起着重要的作用。

研究证明，蔗糖酶与土壤许多因子有相关性。

如与土壤有机质、氮、磷含量，微生物数量及土壤呼吸强度有关。

一般情况下，土壤肥力越高，蔗糖酶活性越高。

它不仅能够表征土壤生物学活性强度，也可以作为评价土壤熟化程度和土壤肥力水平的一个指标。

2 方法选择及原理蔗糖酶能酶促蔗糖水解生成葡萄糖和果糖。

蔗糖酶活性的测定方法有用酶学的方法测量所产生的葡萄糖（滴定法或重量法）或是根据蔗糖的非还原性，用生成物（滴定法或重量法）能够还原菲林溶液中的铜，再根据生成的氧化亚铜的量计算出糖的含量。

也可根据蔗糖水解的生成物与某种物质（3，5-二硝基水杨酸或磷酸铜）生成的有色化合物进行比色测定。

还有一种方法，根据蔗糖液酶促反应前后光偏振面的变化（旋光法）进行测定。

3 比色法3.1试剂配制（1）20%蔗糖。

（2）甲苯。

（3）pH5.5醋酸盐缓冲液：取120ml冰醋酸用水稀释至1L（a），取164g无水CH3COONa 溶于水并稀释至1L（b）。

将（a）与（b）二液按1：8混合再用电位计校正pH。

（4）0.2M Na2HPO4·12H2O。

（5）钼溶液：配制5%钼酸铵水溶液（a），再取200ml浓H2SO4加水800ml（b）。

使用前将两夜按1：1混合。

（6）铜试剂：取50g CuSO4·5H2O溶于500ml水中（a），取25g Na2CO3、25g酒石酸钾钠、20g NaHCO3和200g Na2SO4溶于水并稀释至1L再加几滴甲苯（b）。

使用前将两液混合。

（7）标准葡萄糖溶液：将葡萄糖先在50—58 O C条件下真空干燥至恒重。

然后取500mg溶于100ml甲苯酸溶液中（5mg还原糖/ml），即成标准葡萄糖溶液。

再用标准液制成1ml含0.01—0.5mg葡萄糖的工作溶液。

3.2标准曲线绘制：葡萄糖标准溶液稀释成1ml含1mg还原糖工作液。

蔗糖是重要的光合产物，是植物体内运输的主要物质，优势碳水化合物的暂贮形式之一。

蔗糖合成酶（SS）、蔗糖磷酸合成酶（SPS）是植物体内催化蔗糖合成的两种酶。

对这两种酶活性的测定，可以了解植物组织合成蔗糖能力的高低。

【实验原理】蔗糖合成酶催化游离果糖与葡萄糖工体UDPG反应生成蔗糖。

UDPG+果糖---蔗糖+UDP这是一个可逆反应，平衡常数为1.3-2.0。

该酶在分解方向的Km值相对较高（30-150mmol/L），细胞中高的蔗糖浓度有利于反应向分解方向进行。

蔗糖合成酶活性测定既可在合成方向进行测定（外加底物UDPG和果糖，测产物蔗糖的量表示酶活性），也可以在分解方向进行测定（外加蔗糖和UPD，测定果糖含量表示酶活性）。

蔗糖磷酸合成酶（SPS）催化UDPG与果糖-6-磷酸（F6P）结合形成磷酸蔗糖：UPDG+F6P---蔗糖-6-P+UDP+H+6-磷酸蔗糖可以经磷酸蔗糖酶（SPP）水解后形成蔗糖。

实际上最近有证据证明SPS 和SPP可以在体内形成一个复合体，因此使得SPS催化的反应基本上是不可逆的。

酶活性测定是外加UDPG和F6P，测定产物蔗糖的量表示酶活性。

一般把SPS-SPP系统看作是蔗糖合成的主要途径，而把蔗糖合成酶看作是催化蔗糖分解的。

果糖是酮糖，可与间苯二酚混合加热反应生成红色产物，在一定范围内糖的含量与反应液颜色成正比。

蔗糖在含有盐酸的间苯二酚中水解成葡萄糖和果糖，也能生成红色产物，在480nm处可比色测定。

【实验材料】植物茎【仪器设备及设备】冷冻离心机，恒温水浴，分光光度计，研钵一套，磁力搅拌器，天平（感量0.01mg），0.1、0.5、1、5ml移液管各1个，10ml具塞试管10支，5ml量瓶一个，冰箱【试剂药品】1.提取缓冲液：100mmol/L Tris-HCl(PH7.0)缓冲液，内含5mmol/LMgCl 2,2mmol/LEDTA-Na 2,2%乙二醇，0.2%牛血清蛋白（BSP），2%PVP，5mmol/LDTT。

第1篇一、实验目的1. 了解蔗糖酶的活力测定原理和方法。

2. 掌握分光光度计的使用技巧。

3. 通过实验，掌握如何测定蔗糖酶的活力。

二、实验原理蔗糖酶活力测定是通过测定在一定条件下，酶催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖的速率来衡量酶的活力。

在本实验中，采用3,5-二硝基水杨酸法测定还原糖含量，进而计算蔗糖酶活力。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 蔗糖酶- 蔗糖- 3,5-二硝基水杨酸- 碳酸钠- 氢氧化钠- 硫酸铜- 碘化钾- 硫酸铁铵- 水浴锅- 分光光度计- 烧杯- 容量瓶- 移液管- 秒表2. 实验仪器：- 分光光度计- 烧杯- 容量瓶- 移液管- 秒表四、实验步骤1. 配制反应液：- 称取0.1g蔗糖酶，加入1ml蒸馏水溶解。

- 称取0.5g蔗糖，加入5ml蒸馏水溶解。

- 将蔗糖溶液和蔗糖酶溶液混合，总体积为10ml。

2. 水解反应：- 将混合液放入水浴锅中，设定温度为50℃，反应时间为30分钟。

3. 还原糖测定：- 取3ml反应液，加入3,5-二硝基水杨酸溶液2ml，混匀。

- 将混合液放入水浴锅中，加热至沸，反应时间为2分钟。

- 冷却至室温，用蒸馏水定容至10ml。

4. 比色：- 使用分光光度计，以蒸馏水为参比，测定混合液在540nm处的吸光度值。

5. 结果计算：- 根据标准曲线，计算还原糖含量。

- 根据还原糖含量和反应液体积，计算蔗糖酶活力。

五、实验结果与分析1. 标准曲线绘制：- 以不同浓度的葡萄糖溶液为标准，绘制标准曲线。

2. 蔗糖酶活力计算：- 根据实验数据，计算蔗糖酶活力。

3. 结果分析：- 通过比较不同实验条件下蔗糖酶活力，分析影响酶活力的因素。

六、实验结论通过本实验，我们成功掌握了蔗糖酶活力测定的原理和方法。

实验结果表明，在一定条件下，蔗糖酶活力与还原糖含量呈正相关，说明蔗糖酶具有催化蔗糖水解的能力。

七、实验注意事项1. 实验过程中，注意保持反应液的温度恒定。

2. 使用移液管时，注意避免气泡产生。

鲜样1g（不同处理天数的第一片真叶或者根系，保存于－80℃冰箱中的）↓加入0.5g pvpP和10mL Hepes冰浴研磨成匀浆（50mMHepes－NaOH pH 7.5缓冲液体系配制1L。

Hepes：11.9150gNaCl：16.0gKCl：0.74gNa2HPO4·12H2O：0.543g葡聚糖： 2gEDTA： 0.3722gMgCl2： 2.0330gDTT： 0.3856gVc： 1.7614g）↓四层纱布过滤↓12000g，4℃，离心20min，用石英砂配平↓弃沉淀，留上清液，加5.6g硫酸铵，加入后充分搅动，充分溶解↓放置15min，用空管加水与离心管配平↓12000g，4℃，离心20min↓弃上清液，沉淀内加入3mLHepes溶解，移到透析袋内↓透析袋放到盛有20mL稀释10倍的Hepes↓4℃冰箱内透析20h即为酶液1.AI活性测定25mL刻度试管内加入0.6mL Na2HPO4（0.1M）柠檬酸调pH到4.8↓加0.2mL（0.1M）蔗糖↓加0.2mL酶提取液↓37℃孵育30min↓每个试管中加入1mL蒸馏水，空白加2mL蒸馏水↓在加1.5mL3,5-二硝基水杨酸（DNS）↓520nm比色（比色前混匀）2.NI活性测定25mL刻度试管内加入0.6mL Na2HPO4（0.1M）柠檬酸调pH到7.2↓加0.2mL（0.1M）蔗糖↓加0.2mL酶提取液↓37℃孵育30min↓沸水浴5min，流水冷却↓每管加21.5mL蒸馏水↓520nm比色（比色前混匀）3.蔗糖合成酶（SS）活性测定25mL刻度试管内加入0.1mL 果糖（0.05M）↓加0.1mLUDPG↓加0.1mLTris（0.1M）↓加0.1mLMgCl2（10mM）↓加0.2mL酶液↓37℃孵育30min↓100℃水浴1min，加0.4mL蒸馏水定容至1mL（空白加1mL蒸馏水）↓加0.1mLNaOH（2N）↓沸水浴10min，流水冷却↓加3.5mLHCl（30%）↓加1mL间苯二酚（0.1%），摇匀↓80℃水浴10min，流水冷却↓480nm比色（比色前混匀）4.蔗糖磷酸合成酶（SPS）活性测定25mL刻度试管内加入0.1mL 6-磷酸果糖（0.05M）↓加0.1mLUDPG↓加0.1mLTris（0.1M）↓加0.1mLMgCl2（10mM）↓加0.2mL酶液↓37℃孵育30min↓100℃水浴1min，加0.4mL蒸馏水定容至1mL（空白加1mL蒸馏水）↓加0.1mLNaOH（2N）↓沸水浴10min，流水冷却↓加3.5mLHCl（30%）↓加1mL间苯二酚（0.1%），摇匀↓80℃水浴10min，流水冷却↓480nm比色（比色前混匀）。

植物蔗糖合成酶(SS)试剂盒说明书试验原理：植物蔗糖合成酶(SS)试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验（ELISA）.已知待测物质浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。

先将待测物质和生物素标记的抗体同时温育。

洗涤后，加入亲和素标记过的HRP。

再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物A、B，和酶结合物同时作用。

产生颜色。

颜色的深浅和样品中待测物质的浓度呈比例关系。

内容及其配制自备材料1）蒸馏水。

2）加样器：5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。

3）振荡器及磁力搅拌器等。

安全性1）避免直接接触终止液和底物A、B。

一旦接触到这些液体，请尽快用水冲洗。

2）实验中不要吃喝、抽烟或使用化妆品。

3）不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。

作注意事项1）试剂应按标签说明书储存，使用前恢复到室温。

稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。

2）实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。

3）不用的其它试剂应包装好或盖好。

不同批号的试剂不要混用。

保质前使用。

4）使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物A、B液时，避免使用带金属部分的加样器。

5）使用干净的塑料容器配置洗涤液。

使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。

6）洗涤酶标板时应充分拍干，不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。

7）底物A应挥发，避免长时间打开盖子。

底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。

避免用手接触，有毒。

实验完成后应立即读取OD值。

8）加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应板孔温育的时间一样。

9）按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。

样品收集、处理及保存方法1）血清-----操作过程中避免任何细胞刺激。

使用不含热原和内毒素的试管。

收集血液后，1000×g离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

2）血浆-----EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。

1000×g离心30分钟去除颗粒。

1．2．1蔗糖合成酶(SS)、蔗糖磷酸合成酶(SPS)活性参照於新建[]的方法并稍加改进。

酶液提取：取0.5g左右预冷的水稻叶片(剪碎的去主叶脉的叶片)，加4 mL缓冲液A(50mmol ／L Tris—HC1，pH 7．0、10 mmol／L MgC12、2 mmol／L EDTA-Na2、20 mmol／L巯基乙醇、2％乙二醇)于预冷的研钵中冰浴快速研磨成糊状，倒入离心管中，在低温冷冻离心机上4℃ 10000 r／rmin离心30 min，所得上清液用于酶活性测定。

SS活性的测定：在总体积0.15 mL的反应介质(含50 mmol／L Tris—HCL，pH7.0、10 mmol ／L MgC12, 10 mmol／L果糖、3 mmol／L UDPG)中，加入100uL酶液，30℃水浴中反应10 min，加入2 mol／L NaOH 0.05mL，沸水煮10 min，流水冷却。

再加入1．5 mL浓盐酸和0．5 mL 0．1％的间苯二酚，摇匀后置于80℃水浴保温10 min，冷却后于480nm处比色测定蔗糖的生成。

活性单位以[蔗糖nmol／(g·min)，Fw]表示。

SPS活性的测定：在蔗糖合成酶反应体系中用10 mmol／L果糖-6-磷酸取代10 mmol／L果糖，其余均按蔗糖合成酶的方法。

活性单位以[蔗糖umol／(g·h)，Fw]表示。

药品配制（按100份）酶液提取1 配制缓冲液A---1000ml200mmol／L Tris—HC1----500ml200m mol／L Tris 12.1g----500ml蒸馏水，200m mol／L HC1／L 8.36ml盐酸（37%）加水491.63ml水将250 ml Tris+233.5 ml HC1，在此液中加入MgC12（分子量95.21，0.9521g），EDTA-Na2（含两个结晶水分子量372，g），巯基乙醇（分子量78，ml），乙二醇（分子量，ml），最后加蒸馏水定容到1000ml2 配制缓冲液B---1000ml 5 ml12.5ml Tris+11.65ml HCl，加入MgC12 0.0238g，果糖（259.19分子量，0.1296g），加入UDPG （Uridine 5′-diphosphoglucose disodium salt from Saccharomyces cerevisiae分子量610.27，19.1ug）,定容到25ml 容量瓶12.5ml Tris+11.65ml HCl，加入MgC12 0.0238g，加入果糖-6-磷酸（304.1分子量，0.03041g），UDPG（Uridine 5′-diphosphoglucose disodium salt from Saccharomyces cerevisiae分子量610.27，19.1ug）,定容到25ml 容量瓶3 . 2 mol／L NaOH 50ml 0.4g 定容至50 ml4.0．1％的间苯二酚1g 999ml 蒸馏水5．做蔗糖标准曲线植物组织ATP酶活性测定一、原理ATP酶（adenosinetriphosphatase）可催化ATP水解生成ADP及无机磷的反应，这一反应放出大量能量，以供生物体进行各需能生命过程。

鲜样1g（不同处理天数的第一片真叶或者根系，保存于－80℃冰箱中的）↓加入0.5g pvpP和10mL Hepes冰浴研磨成匀浆（50mMHepes－NaOH pH 7.5缓冲液体系配制1L。

Hepes：11.9150gNaCl：16.0gKCl：0.74gNa2HPO4·12H2O：0.543g葡聚糖： 2gEDTA： 0.3722gMgCl2： 2.0330gDTT： 0.3856gVc： 1.7614g）↓四层纱布过滤↓12000g，4℃，离心20min，用石英砂配平↓弃沉淀，留上清液，加5.6g硫酸铵，加入后充分搅动，充分溶解↓放置15min，用空管加水与离心管配平↓12000g，4℃，离心20min↓弃上清液，沉淀内加入3mLHepes溶解，移到透析袋内↓透析袋放到盛有20mL稀释10倍的Hepes↓4℃冰箱内透析20h即为酶液1.AI活性测定25mL刻度试管内加入0.6mL Na2HPO4（0.1M）柠檬酸调pH到4.8↓加0.2mL（0.1M）蔗糖↓加0.2mL酶提取液↓37℃孵育30min↓每个试管中加入1mL蒸馏水，空白加2mL蒸馏水↓在加1.5mL3,5-二硝基水杨酸（DNS）↓520nm比色（比色前混匀）2.NI活性测定25mL刻度试管内加入0.6mL Na2HPO4（0.1M）柠檬酸调pH到7.2↓加0.2mL（0.1M）蔗糖↓加0.2mL酶提取液↓37℃孵育30min↓沸水浴5min，流水冷却↓每管加21.5mL蒸馏水↓520nm比色（比色前混匀）3.蔗糖合成酶（SS）活性测定25mL刻度试管内加入0.1mL 果糖（0.05M）↓加0.1mLUDPG↓加0.1mLTris（0.1M）↓加0.1mLMgCl2（10mM）↓加0.2mL酶液↓37℃孵育30min↓100℃水浴1min，加0.4mL蒸馏水定容至1mL（空白加1mL蒸馏水）↓加0.1mLNaOH（2N）↓沸水浴10min，流水冷却↓加3.5mLHCl（30%）↓加1mL间苯二酚（0.1%），摇匀↓80℃水浴10min，流水冷却↓480nm比色（比色前混匀）4.蔗糖磷酸合成酶（SPS）活性测定25mL刻度试管内加入0.1mL 6-磷酸果糖（0.05M）↓加0.1mLUDPG↓加0.1mLTris（0.1M）↓加0.1mLMgCl2（10mM）↓加0.2mL酶液↓37℃孵育30min↓100℃水浴1min，加0.4mL蒸馏水定容至1mL（空白加1mL蒸馏水）↓加0.1mLNaOH（2N）↓沸水浴10min，流水冷却↓加3.5mLHCl（30%）↓加1mL间苯二酚（0.1%），摇匀↓80℃水浴10min，流水冷却↓480nm比色（比色前混匀）。

蔗糖酶的提取、分离、纯化及活性检测摘要随着分子生物学的发展，不论对酶分子本身作用机制的研究还是其他研究，越来越需要纯度更高的酶制剂，这就要求我们熟悉酶提纯的一般操作步骤及酶的提纯及活力测定等重要的生物实验技术。

本次实验主要通过提取啤酒酵母中的蔗糖酶并经过两次纯化测定其活力与Km。

在实验过程中用乙醇分级分离法，DEAE-Cellulose 柱层析，分子筛（凝胶过滤）层析提取纯化蔗糖酶。

在实验过程中，虽然我们很努力, 但由于我们对实验的程序不熟悉，因此在实验的一些过程中有一些明显的操作失误，使得实验的最后测定结果与理论值有一定出入。

关键词啤酒酵母蔗糖酶乙醇分级分离DEAE-Cellulose 柱层析分子筛层析Km 前言生物体内所发生的一切化学反应，几乎都是在专一性酶的催化下进行的，因此酶的研究对了解生命活动的规律以及生命本质的阐述具有十分重要的意义。

随着分子生物学的发展，不论对酶分子本身作用机制的研究以及分子生物学其他重要课题的研究都越来越多地需要使用作用专一，纯度高的酶制剂。

这就要求人们建立各种方法，以便从各种生物来源的材料中分离提纯酶。

由于酶本身也是蛋白质，因此酶分离提存的方法大体上与蛋白质纯化方法相同，一般来说，没有一种固定的方法，而往往根据实验者所要分离提纯酶的取材以及酶本身的物理﹑化学及生物学性质来确定分离提纯方法。

各种酶的纯化通常有五个阶段：①材料的选择与预处理；②细胞破碎；③抽提；④纯化；⑤浓缩﹑干燥及保存。

酶分离纯化成功与否的重要标志：一是要有较高的收率；二是达到所要求的纯度，这两个指标通常是矛盾的，可根据需要来有所侧重，一般来说，好的方法与步骤应该是简单易行，最终的酶制剂有较高的收率和纯度。

就单独的每种分离提纯的方法而言，有盐析法、有机溶剂分级法、调PH分级沉淀法、选择变性法、吸附法、层析法（纸层析、薄板层析、柱层析等）。

其中盐析法是用于蛋白质和酶分离提纯的最早而且最广泛的一种方法，该方法是根据蛋白质和酶在一定浓度的溶液中溶解度的降低程度的不同而达到彼此分离的方法盐析法常用的中性盐有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等，其中用得最多的是硫酸铵，因为它具有温度系数小而溶解度大的优点。