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小鼠胚胎干细胞体外诱导分化成骨细胞研究

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什么是胚胎干细胞

什么是胚胎干细胞

什么是胚胎干细胞胚胎干细胞是在人胚胎发育早期——囊胚（受精后约5—7天）中未分化的细胞。

囊胚含有约140个细胞，外表是一层扁平细胞，称滋养层，可发育成胚胎的支持组织如胎盘等。

中心的腔称囊胚腔，腔内一侧的细胞群，称内细胞群，这些未分化的细胞可进一步分裂、分化，发育成个体。

内细胞群在形成内、中、外三个胚层时开始分化。

每个胚层将分别分化形成人体的各种组织和器官。

如外胚层将分化为皮肤、眼睛和神经系统等，中胚层将形成骨骼、血液和肌肉等组织，内胚层将分化为肝、肺和肠等。

由于内细胞群可以发育成完整的个体，因而这些细胞被认为具有全能性。

当内细胞群在培养皿中培养时，我们称之为胚胎干细胞。

研究证实：分离的小鼠胚胎干细胞在体外可以分化成各种细胞，包括神经细胞，造血干细胞（血细胞的前体）和心肌细胞。

令人惊奇的是，这些细胞还具有自发发育成某些原始结构的趋势。

如在一定的培养条件下，一部分胚胎干细胞会分化为胚状体（与小的跳动的心脏具有奇异的相似之处），而另一些细胞会发育成包含造血干细胞的卵黄囊。

形成胚状体和卵黄囊的比例可通过改变培养基而改变，但至今还没有诱导胚胎干细胞发育为一纯的分化细胞群的报道。

从理论上讲，小鼠胚胎干细胞具有发育成某一器官的能力，但还没有用干细胞体外培养成器官的报道。

不过，如果将小鼠胚胎干细胞移植到重度复合免疫缺损小鼠（SCID，它不会排斥移植的细胞）体内时，胚胎干细胞则能够发育成肌肉、软骨、骨骼、牙齿和毛发。

但无论如何，如果直接将分离的小鼠胚胎干细胞植入子宫内，它们不会发育成个体小鼠，因为没有着床必需的滋养层细胞。

这种条件下，胚胎干细胞被认为是多能的（pluripotent），而不是全能的（totipotent）。

尽管如此，如果将胚胎干细胞植入不能发育成个体的四倍体胚胎中，再将该胚胎植入小鼠子宫中，那么可以获得完全是由培养的胚胎干细胞产生的正常个体小鼠。

这表明了胚胎干细胞具有难以置信的全能性。

胚胎干细胞体外诱导分化的研究进展

胚胎干细胞体外诱导分化的研究进展
胞的定向分化。
04
胚胎干细胞体外诱导分化的应用前景
疾病治疗与药物筛选
疾病治疗
胚胎干细胞具有多向分化潜能，可分化为特定类型的细胞，如神经细胞、心肌细 胞等，为疾病治疗提供了新的途径。例如，通过诱导胚胎干细胞分化为神经细胞 ，可以用于治疗帕金森病、阿尔茨海默病等神经系统疾病。
药物筛选
胚胎干细胞可在体外培养扩增，为药物筛选提供了大量的实验样本。通过比较胚 胎干细胞在药物处理前后的分化过程和表型变化，可以评估药物的疗效和副作用 ，为新药研发提供有力支持。
表观遗传修饰
表观遗传修饰可以影响胚 胎干细胞的分化，如DNA 甲基化、组蛋白乙酰化等 。
03
胚胎干细胞体外诱导分化方法
化学诱导分化方法
化学诱导分化是利用化学物质 调节胚胎干细胞的分化过程。
常用的化学物质包括细胞因子 、激素、小分子化合物等。
这些化学物质通过调节胚胎干 细胞的基因表达、信号转导等 途径，诱导细胞定向分化。
组织工程与器官移植
组织工程
胚胎干细胞具有发育成各种组织的潜力，为组织工程提供了理想的基础材料。例如，可以诱导胚胎干细胞分化 为软骨、肌肉、血管等组织，用于修复或替换受损的组织器官。
器官移植
胚胎干细胞可分化为多种器官细胞，为器官移植提供了新的来源。与传统的器官移植相比，胚胎干细胞诱导分 化的器官具有更好的组织匹配性和更少的不良反应，有望成为解决器官短缺和提高移植效果的重要途径。
研究方法
采用体外培养胚胎干细胞的方法，通过添加不同的诱导因子 或采用特殊的培养条件，观察细胞的分化过程和分化产物的 特性，同时结合分子生物学、细胞生物学等技术手段分析相 关机制。
02
胚胎干细胞特性与分化机制
胚胎干细胞特性

小鼠胚胎瘤来源细胞系ATDC5的体外软骨分化诱导研究

小鼠胚胎瘤来源细胞系ATDC5的体外软骨分化诱导研究

小鼠胚胎瘤来源细胞系ATDC5的体外软骨分化诱导研究金旻n;戚华兵;苏楠;杜晓兰;杨京;赵玲;陈林【期刊名称】《中国骨质疏松杂志》【年(卷),期】2009(015)010【摘要】目的在体外建立稳定有效的软骨细胞分化模型.方法复苏ATDC5细胞,在倒置显微镜下观察细胞形态及其生长情况,细胞90%融合时分别用不含Vc和含Vc的诱导培养基培养进行分化诱导.诱导21 d,阿力新蓝染色,RT-PCR检测Ⅱ、Ⅹ型胶原表达进行鉴定.结果含50 μg/mL Vc的诱导培养基诱导1 周便可见明显的软骨小结,细胞产生软骨基质明显增多,Ⅱ及Ⅹ型胶原表达明显增高,且Ⅹ型胶原表达呈提前.结论利用ATDC5细胞系可成功建立软骨细胞分化体外模型.【总页数】4页(P737-740)【作者】金旻n;戚华兵;苏楠;杜晓兰;杨京;赵玲;陈林【作者单位】400042,重庆,第三军医大学大坪医院野战外科研究所全军战创伤中心,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室;400042,重庆,第三军医大学大坪医院野战外科研究所全军战创伤中心,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室;400042,重庆,第三军医大学大坪医院野战外科研究所全军战创伤中心,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室;400042,重庆,第三军医大学大坪医院野战外科研究所全军战创伤中心,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室;400042,重庆,第三军医大学大坪医院野战外科研究所全军战创伤中心,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室;400042,重庆,第三军医大学大坪医院野战外科研究所全军战创伤中心,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室;400042,重庆,第三军医大学大坪医院野战外科研究所全军战创伤中心,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室【正文语种】中文【中图分类】R329.2+8【相关文献】1.胶质源性神经营养因子体外诱导小鼠胚胎中脑神经干细胞分化的研究 [J], 丁继固;丁文杰;李光;赵克勇2.体外诱导胚胎干细胞来源表皮干细胞向汗腺细胞分化的研究 [J], 罗文跃;龙丽芸;李志红3.红色荧光蛋白标记的小鼠胚胎干细胞系建立及体内成瘤的初步研究 [J], 赵无恙;刘韬;钱其军4.小鼠胚胎干细胞体外诱导分化为精原干细胞的研究 [J], 郑炜炜;崔光辉;陈系古;韦相才5.淫羊藿苷诱导小鼠胚胎干细胞体外定向分化为心肌细胞方法学研究 [J], 朱丹雁;楼宜嘉因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

胚胎干细胞体外诱导分化为CD34_造血前体细胞

胚胎干细胞体外诱导分化为CD34_造血前体细胞

基础研究胚胎干细胞体外诱导分化为CD34+造血前体细胞周其锋1,何志旭2,冯炼强1,黄绍良2,李树浓3(中山大学 1 免疫学教研室,2 孙逸仙纪念医院儿科,3 病理生理学教研室,广东广州 510089)摘 要: 目的 胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES)体外诱导分化,制备CD34+造血前体细胞。

方法 胚胎干细胞在含甲基纤维素培养液中分化形成胚胎体(embryoi d body,EB),然后加入造血刺激因子诱导产生CD34+造血前体细胞,间接免疫荧光及流式细胞仪检测分化结果。

结果 胚胎干细胞分化第9~15天均有CD34+细胞,第13天比例最高,可达17 36%。

结论 胚胎干细胞分化成胚胎体,在造血刺激因子的存在下,可大量获得CD34+造血前体细胞。

关键词:胚胎;细胞分化;造血干细胞中图分类号:R321;R329 文献标识码:A 文章编号:1000-257X(2002)5S-0001-02胚胎干细胞(embry onic stem cell,ES)是从囊胚期内细胞团分离得到的[1,2],不仅可以在体外长期传代培养,而且具有向几乎所有组织细胞类型(胚胎滋养层细胞除外)分化的发育全能性[3],因此在组织损伤性疾病等的临床治疗方面,胚胎干细胞显示出广阔的应用前景。

本研究应用相应造血刺激因子体外诱导小鼠胚胎干细胞分化为CD34+造血前体细胞,目的是为进一步研究胚胎干细胞来源造血前体细胞的特性建立基础。

1 材料与方法1 1 小鼠胚胎干细胞株ESE14 1细胞传代培养常规方法复苏ESE14 1细胞于明胶处理过的25mL培养瓶中,培养液为高糖DM ED,含0 01g/L鼠白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,L IF),48h后换液,3d后胰酶消化传代。

1 2 ESE14 1细胞分化培养取生长状态好的ESE14 1细胞,胰酶消化,用I M DM 分化培养液(含9g/L甲基纤维素、0 04g/L鼠干细胞因子)配成单细胞悬液,调整细胞数每毫升2000个,种于6孔板,每孔2~3mL,第6天添加含0 18g/L鼠干细胞因子,0 03 g/L人白细胞介素-3,0 03g/L人白细胞介素-6,3000U/L 人促红细胞生成素的IM DM液每孔1~2mL;分化的空白对照组仅用9g/L甲基纤维素的IM DM液,不含任何细胞因子。

胚胎干细胞体外定向诱导分化的研究进展

胚胎干细胞体外定向诱导分化的研究进展

胚胎干细胞体外定向诱导分化的研究进展（姓名：李翔单位：宁夏师范学院化学与化学工程学院11级科学教育班）摘要：胚胎干细胞是从早期胚胎内细胞团分离培养出来的具有发育全能性或多能性的干细胞,具有多向分化潜能和自我更新的特性。

胚胎干细胞可以定向诱导分化生产组织和细胞,可为细胞移植提供无免疫原性的材料,为难以治愈的疾病的细胞移植治疗提供可能。

本文介绍了胚胎干细胞的诱导分化方法和应用。

关键词：胚胎干细胞;定向诱导分化;分化潜能;自我更新胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES细胞)是从早期胚胎(桑椹胚、囊胚)或原始生殖细胞(primordial germ cell,PGCS)分离出来的能在体外永久培养的、具有多方向分化潜能和种系嵌合能力的细胞系。

ES细胞具有多向分化潜能,可分化形成外胚层、中胚层和内胚层细胞的谱系干细胞,再成长为不同的神经、造血、肌肉,骨骼等各种细胞基于其特性,目前普遍认为,ES细胞对体外研究动物和人胚胎的发生发育,基因表达调控,药物的筛选和致畸实验及作为组织细胞移植治疗,克隆治疗和基因治疗的细胞源及产生克隆和转基因动物等领域将产生重要的影响。

1998年,T homson和Gearhart2个研究组分别从人ICM和PGCS建立了人类ES细胞系,在国际上引起了轰动。

Science杂志将人类ES细胞研究成果评为1999年世界十大科技进展之首,美国《时代》周刊将其列为20世纪末世界十大科技成就之首,并认为ES细胞和人类基因组将同时成为新世纪最具发展和应用前景的领域,由此掀起了ES细胞研究的高潮。

1体外诱导ES细胞的原理在体胚胎分化过程中，组织发生和身体构造的形成具有时空顺序性和相互诱导性。

在个体发育过程中，细胞分化是程序控制的有序有规律过程，程序的运行结果表现为不同发育阶段、不同组织部位的细胞表现出不同的形态、不同的生长方式和不同的生理功能。

从分子水平上来看，这一结果取决于细胞在基因表达上的时空差异。

精原干细胞-是一种成体干细胞,具有自我更新及多向分化潜能

精原干细胞-是一种成体干细胞,具有自我更新及多向分化潜能

精原干细胞-是一种成体干细胞，具有自我更新及多向分化潜能精原干细胞-是一种成体干细胞，具有自我更新及多向分化潜能，已有研究表明，精原干细胞具有多向细胞分化的能力，将其体外扩增，可为细胞移植提供足够的来源，并可将其体外定向诱导为特异性细胞。

学术术语来源---小鼠精原干细胞体外培养诱导成骨的能力文章亮点：1 文章创新性的在体外分离、培养、纯化精原干细胞，并观察其在成骨细胞培养条件下的生物学特征变化，以期为治疗牙槽骨吸收、研制骨组织工程材料的种子细胞选择奠定实验基础。

2 实验结果提示精原干细胞在该诱导培养条件下具有成骨能力的趋势，这将为进一步研究成体干细胞的多向分化理论提供参考，同时也为深入研究精原干细胞向其他细胞转化提供了实验依据。

关键词：干细胞；培养；精原干细胞；成骨能力；诱导；生物学特性；种子细胞主题词：干细胞；成骨细胞；显微镜检查，荧光；培养基, 条件性摘要背景：精原干细胞具有自我更新及多向分化潜能，并可将其体外定向诱导为特异性细胞，提示精原干细胞亦可能具有向成骨细胞转化的可能性，但有关这方面的研究尚未见报道。

目的：观察小鼠精原干细胞在体外成骨细胞培养条件下的生物学特征变化。

方法：取生后15-20 d小鼠胫骨骨髓，分离、培养骨髓基质细胞，5 d后丝裂霉素C处理制备成饲养层；取生后七至八天小鼠睾丸，经酶消化后制成单细胞悬液并接种于饲养层上。

3 d后实验组和对照组分别用条件培养液和基本培养液进行诱导培养，通过倒置相差显微镜观察培养细胞生长状况及形态变化，并结合碱性磷酸酶染色、Ⅰ型胶原免疫荧光染色等方法进行结果检测。

结果与结论：实验组精原干细胞在条件培养液中较对照组细胞贴壁生长快，条件培养3-6 d后见细胞生长迅速，呈集落样增长，细胞立体感增强，细胞团、簇的大小继续增加，细胞外基质增多，但未见明显细胞间桥。

培养15 d后，对两组细胞进行碱性磷酸酶染色可见胞质、胞膜染为黑色，呈阳性。

在荧光显微镜下可见实验组细胞浆内出现绿色荧光，呈阳性荧光反应；对照组细胞呈阴性反应，说明实验组细胞Ⅰ型胶原染色阳性，这与成骨细胞的生物学特性相似。

胚胎干细胞体外定向诱导分化的研究进展

胚胎干细胞体外定向诱导分化的研究进展（姓名：李翔单位：宁夏师范学院化学与化学工程学院11级科学教育班）摘要：胚胎干细胞是从早期胚胎内细胞团分离培养出来的具有发育全能性或多能性的干细胞,具有多向分化潜能和自我更新的特性。

胚胎干细胞可以定向诱导分化生产组织和细胞,可为细胞移植提供无免疫原性的材料,为难以治愈的疾病的细胞移植治疗提供可能。

本文介绍了胚胎干细胞的诱导分化方法和应用。

关键词：胚胎干细胞;定向诱导分化;分化潜能;自我更新胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES 细胞)是从早期胚胎( 桑椹胚、囊胚) 或原始生殖细胞(primordial germ cell, PGCS)分离出来的能在体外永久培养的、具有多方向分化潜能和种系嵌合能力的细胞系。

ES 细胞具有多向分化潜能, 可分化形成外胚层、中胚层和内胚层细胞的谱系干细胞, 再成长为不同的神经、造血、肌肉,骨骼等各种细胞基于其特性,目前普遍认为, ES细胞对体外研究动物和人胚胎的发生发育, 基因表达调控, 药物的筛选和致畸实验及作为组织细胞移植治疗, 克隆治疗和基因治疗的细胞源及产生克隆和转基因动物等领域将产生重要的影响。

1998 年,T homson和Gearhart2 个研究组分别从人ICM和PGCS建立了人类ES细胞系, 在国际上引起了轰动。

Science 杂志将人类ES 细胞研究成果评为1999 年世界十大科技进展之首, 美国《时代》周刊将其列为20世纪末世界十大科技成就之首, 并认为ES 细胞和人类基因组将同时成为新世纪最具发展和应用前景的领域, 由此掀起了ES细胞研究的高潮。

1体外诱导 ES 细胞的原理在体胚胎分化过程中，组织发生和身体构造的形成具有时空顺序性和相互诱导性。

在个体发育过程中，细胞分化是程序控制的有序有规律过程，程序的运行结果表现为不同发育阶段、不同组织部位的细胞表现出不同的形态、不同的生长方式和不同的生理功能。

胚胎干细胞的体外培养及分化的研究现状和前景


Ｉ具体项 目及报告条件： ８ ０ ０／ ＜Ｗ Ｃ ． ×１９Ｌ ２． ×１ Ｌ Ｂ ＜３ ０ ０／ ；
Ｐ Ｔ＜ ５ Ｌ ０× １ ９ Ｌ： Ｇ Ｕ＜ ２ ５ ｍ １ ［； ５ ５ ｍ ｌ Ｌ＜ Ｋ ＜ ０／ Ｌ ． ｍ ｏ ／ ．ｍｏ／ ３ ５ ｍ ｌ Ｌ ｍ ｏ ／ ＜ ａ ＜ １ ５ｍ ｌ Ｌ ． ｍ ｏ ／ ＜Ｃ 。 ＜ ． ｍ ｏ ／ ：１ ５ ｍ ｌ Ｌ Ｎ ２ ｎａ ／ ：３ ５ｍ ｌ ｌ ａ ５ ｏ
说 明 患者 正 处 于 危 险 的 边 缘 状态 ， 时 临床 医生 能及 时得 到信 此
２５ ．ｍｏ／ ． ～３ Ｏ ｍ １ Ｌ可发生认识功能损伤 ，低 于这个范围可出现
低 糖 血 症 神 经 症 状 ；Ｐ Ｔ是 止 血 系统 的重 要组 成部 分 ，同 时影 Ｌ
响 Ｐ Ｔ计数准确性的 因素很多 ， Ｐ Ｔ ０ ０ Ｌ Ｌ 若 Ｌ ＜５ ×１ ，可引起创 ／ 伤性 出血或手术 出血 。 ２ 当出现 “ 危急值 ”时，在确认 仪器 设备正常情 况下，有
年 Ｔ ｏ ｓ ｎ等 首 次 分 离 并 建 立 人 胚 胎 干 细 胞 系 ， 此 掀 起 ｈ ｍｏ 由
胚 胎 干 细 胞 （ ｍ ｒ ｏ ｉ ｔｍ ｃ １ ，Ｅ Ｅ ｂ ｙ ｎ ＣＳ ｅ ｅ １ Ｓ细 胞 ） 是 从 动
物 早期胚胎 的 内细胞 团 （ Ｃ ）或 原始生 殖细胞 分离 出来 的 ＩＭ 具有发育 全 能性 的一种 未 分化 的无 限增 殖 细胞 系 “ 。 自从
Ｉ５ｍ ｌ Ｌ ｈ 阴 性 血 型 ； Ａ Ｔ ０ ｕ Ｌ Ｐ Ｔ Ｉ０ 。 白细 ．ｍ ｏ ／ ；Ｒ Ｌ ＞３ ０ ／ ；Ａ Ｔ ＞ ５ ｓ
胞过高或过低 都是心外手术禁忌症之一，当出现 “ 危急值 ” 时， 必须用手工计数及涂片做细胞学检查；Ｒ 阴性血型属稀 有血 ｈ 型， 及时报 告便于血库及时与血液中心联系提 前备血。临床 卜

1,25(OH)2VD3诱导小鼠胚胎干细胞向成骨细胞分化的研究

组 与 Ｃ组相 同 ， 另添 加 ４× １’ｍｏ Ｌ ｌ ２ （ Ｈ）Ｖ 。检 测 ＡＬ ０ ｌ ， ５ Ｏ ２ Ｄ３ ９ ／ Ｐ活 性 ， 时 定量 Ｐ Ｒ检 测 骨 钙 素 ｍ ＮＡ 的表 达 ， 实 Ｃ Ｒ 茜素 红 Ｓ染 色进 行 矿 化 骨 结 节计 数 。 结 果 Ｅ ｓ Ｂ 贴壁 后 前 ５ｄ 各 组 Ａ Ｐ表 达 未 发 生 明显 变 化 ， 后 Ａ Ｐ表 达 逐 渐 增 加 ， ， Ｌ ５ｄ Ｌ 其 中 Ｄ 组 在 第 ２ 表 达 水平 最 高 。光 镜下 可 见 轮 廓 清 晰大 小 不 等 的 红色 结节 。茜 素 红 Ｓ染 色测 得 Ａ、 Ｃ Ｄ 组骨 结节 Ｏ天 Ｂ、 、
计学意义（ Ｐ＞Ｏ０ ） Ｃ Ｄ组间 比较差异有统计学意义 （ ． ， 、 ５ Ｐ＜Ｏ ５ 。 结论 ． ） ０
【 关键 词 】 胚 胎干 细 胞 成 骨细 胞 ｌ２ （ ， ５ ＯＨ） Ｖ ３ ｚ Ｄ
在浓度 为 ４×１’ｍｏ Ｌ ｌ ２ ０ ， ０ Ｖ ， ５（ Ｈ）ＶＤ ９
数分别 为（ ０ － ） （ ８４５ 、 ３ １ 、 ５ １ 个 ： ２ ８ 、 １ ） （ ｌ－ ） （０４ ） 实时定量 Ｐ Ｒ测得 Ａ、 ｃ、 ４ － ４ － Ｃ Ｂ、 Ｄ组骨钙素 ｍＲ ＮＡ分别为 ｌ． １１、 Ｏ１ ４ ． ８－ ７
２ ． １ ３ ８８ ４０ 、 ２１ ５２ ； 、 Ｏ２ ４ ． 、ｌ． ４ ． ３ ．５ － ．３ Ｃ Ｄ组 与 Ａ、 ９－ ｏ ４－ ７ ４ Ｂ组 比较 差 异 均 有统 计 学 意 义 （ Ｐ＜Ｏ ５ ， Ｂ 组 间 比较 差异 无 统 ． ） Ａ、 ０
１２ （ ２ ３ Ｕ Ｙ ｄ ｎ Ｙ ＮＧ Ｘｕｙ２Ｌ ｅｇａ ＤＯＵ Ｚ ｏ ｇｉｇ． ｏａｉｎ ｌ ｎ ｅｈ ｉ ｌ ｏ ｅｅｏ ｅｙ ｎ ，５ＯＨ） ／ Ｎ ａ ｏｇ， Ａ ｅｉ Ｉ ｎｔｏ， ＶＤ Ｓ ， Ｆ ｈ ｎｙｎ Ｊ ｃｔ ａ ａ ｄＴ ｃｎｃ ｌｇ ｆＳ ｎ ａ ｇ Ｖ ｏ ａＣ ｌ ｈ Ａ ｒ ｕｔｒ Ｕ ｉ ｒ ｔ Ｓｅｙ ｎ ｉ ｎｎ， １２ＰＲＣ ｉａ２ ｐ ｒ ｅ ｔ Ｌ ｅ ｃ ｎｅ Ｌ ｏａ ｇ ｒ ｌ ｎｖｒ Ｎ ｔ ｎ ｌ ｇｉ ｌ ｅ ｎｖ ｓｙ ｈｎａ ｇ ａ ｉｇ １０２ ， ．．ｈｎ；Ｄｅａｔ ｎ ｉ ｉ ｃ ， ｕｙ ｎ ｍａ Ｕ ｉ ｓ ｃ ｕ ｅｉ， Ｌｏ １ ｍ ｏ ｆ Ｓｅ ｓ ｆ Ｎｏ ｅ ｉ ａ ｏａ ｉ Ｓｅ ｅｓ ｎｉｅｒ ｇａ ｄＴ ｃｎ ｌ ｙＣ ｎｒ ａ ｎ ｉ ｒｎｈ Ｎｏｔｗ ｓ Ａ ｎｖｒ ｔ Ｃ ｒｅ ｏ ｄｎ ｕｈ ｒ ＤＯＵ ｔ Ｃ ｌ ｇｎｅｉ ｎ ｅｈ ｏ ｇ ｅｔ ｏ Ｓ ａ ｘ ａ ｃ， ｒ ｅｔ ＆ＦＵ ｉｅ ｉ ． ｏｒｓ ｎ ｉｇａ ｔｏ： ｍ ｌＥ ｎ ｏ ｅｆ ｈ Ｂ ｈ ｓｙ ｐ

干细胞治疗肾脏病的研究进展

干细胞治疗肾脏病的研究进展徐繁潘兴华干细胞是一类具有自我更新和多系分化能力的细胞，按生存阶段可以分为胚胎干细胞和成体干细胞。

目前，干细胞的相关研究已成为生命科学研究的热点，而干细胞移植治疗疾病又是其研究的重点，有研究报道干细胞对一些肾脏病有较好的治疗作用，如IgA肾病、慢性马兜铃酸肾病、局灶节段性肾小球硬化、急进性肾小球肾炎、狼疮性肾炎(LN)、急性及慢性肾衰竭等。

本文就胚胎干细胞和骨髓干细胞在肾脏病研究中的应用、前景展望。

胚胎干细胞胚胎干细胞由囊胚期内细胞团或原始生殖细胞经体外分化抑制培养，在体外筛选出的细胞，具有全能性，即可以在适合的条件下分化为所有3个胚层，但不能分化为胚外组织。

胚胎干细胞比骨髓发育早、更原始、幼稚、自我更新能力强，具有较长的端粒及较高的端粒酶活性，具有较小的免疫原性和较弱的免疫活性，对逆转录病毒介导的基因转染更敏感。

研究人员体外培养小鼠胚胎干细胞使其分化成各种类型的心肌细胞和肾脏固有细胞，还通过控制体外培养的环境获得了小鼠胚胎干细胞来源的脂肪细胞、软骨细胞、肝细胞，还获得了分泌胰岛素及其他胰腺内泌激素的细胞，并形成胰岛样结构[ 。

，有证据显示胚胎干细胞还可分化为肾脏实质细胞，嵌合型胎儿的胚胎生殖细胞可形成肾脏组织_3]。

Thomson等[4 将人胚胎干细胞注入免疫缺陷小鼠，形成了胎肾组织。

目前，将胚胎干细胞用于治疗肾脏疾病技术已经趋于成熟。

能在体内生成有功能的肾组织，并且能在体外对胚胎干细胞预分化。

将胚胎干细胞直接引入肾实质，能形成肾组织，而胚胎干细胞分化为肾脏细胞的体内外调节因子至今还不清楚。

胚胎干细胞移植用于肾脏病的治疗很多问题得到解决，前景可观。

二、自体骨髓间充质干细胞成体干细胞是成体组织中保留的未完全分化的那部分原始细胞，具有多能性或为专能性干细胞，骨髓干细胞是成体干细胞的一种，它的研究始于上世纪60年代。

近十年来，由于生物细胞实验技术的快速发展，极大地推动了骨髓干细胞的研究，人们对骨髓干细胞生物学特性的认识有了显著的提高。

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农业生物技术学报Journal of Agricultural Biotechnology 2006,14(1):7~10*基金项目：国家重点基础研究发展规划(973)项目(No.G1999054301)、国家高技术研究与发展计划(863)项目(No.2002AA216161)、国家自然科学基金项目(No.39970363)和陕西省重点攻关项目资助。

宋晓平:男，1963年生，博士，教授。

E-mail:<sxpxbnl@>.**通讯作者。

Author for correspondence.E-mail:<douzhongying@>.收稿日期：2005-02-16接受日期：2005-04-22·研究论文·小鼠胚胎干细胞体外定向诱导分化成骨细胞*宋晓平窦忠英**雷安民华进联冯秀亮屈雷(西北农林科技大学动物科技学院,杨凌712100)摘要：将小鼠5d 龄ES-D3细胞源的类胚体(EBs)单细胞，按5×104/mL 接种6孔细胞培养板，在DMEM 基础培养基中使EBs 单细胞贴壁培养。

于第14～21天时，分别添加60%成骨细胞条件培养液(A 组)、50μg/mL 维生素C ＋50mmol/L β-磷酸甘油(B 组)和50μg/mL 维生素C ＋50mmol/L β-磷酸甘油＋1μmol/L 地塞米松(C 组)，并设不添加诱导剂对照组(D 组)。

第22天时用1%茜素红染色显示阳性细胞，计算成骨细胞诱导形成率，数据用方差分析和多重比较检验。

结果表明，A 组细胞增殖呈团状聚集，茜素红染色阳性细胞结节多分布于聚集的细胞群内及其边缘，成骨细胞诱导形成率为10.04%，与对照组比较，差异极显著(<0.01)；B 组诱导分化的细胞分泌物形成网状结构，茜素红染色阳性细胞分布在这些网状结构中，成骨诱导形成率为7.43%，与对照组比较差异显著(<0.05)；C 组茜素红染色阳性细胞分散而均匀，但未出现网状结构，成骨细胞诱导形成率提高至27.57%，与对照组比较差异极显著(<0.01)。

关键词：ES 细胞；成骨细胞；诱导分化；骨组织工程中图分类号:S188文献标识码:A文章编号:1006-1304(2006)01-0007-04Directed Differentiation of Murine Embryonic Stem Cells into OsteoblastsSONG Xiao-Ping DOU Zhong-Ying LEI An-Min HUA Jin-Lian FENG Xiu-Liang QULeicells of 5-day embryoid bodies (EBs)derived from murine ES-D3lineage were inoculated into each well of 6-wellculture plate at 5×104/mL in DMEM.During the period from 14to 21days of the EBs-derived single cells attachment DMEM was supplemented with the concentration of 60%of conditioned-medicum(group A),50μg/mL ascorbic acid ＋50mmol/L β-glycerophos-phate(group B),50μg/mL ascorbic acid ＋50mmol/L β-glycerophosphate ＋1μmol/L dexamethasone(group C),and without inducer (group D),respectively,and at the 22th day the positive cells were characterized by the formation of discrete mineralized bone nodules that were stained with 1%alizarin red S,and the ratio of obstoblast differentiation were calculated and analyzed by variance analysis and multiple comparison.The results indicated that in group A the cells were dump-like growth and the positve cells stained with alizarin red mostly located inside or around,and the ratio of obstoblast differentiation was 10.04%,which was extremely significent differences with group D(<0.01).In group B the secretion of differentiated cells formed net-like structures,and the stained-positive cells located in the centre of the structures and the ratio of obsteoblast differentiation was 7.43%(<0.05).In group C the differentiat-ed obsteoblats spreaded uniformly without net-like structures,and the ratio of obsteoblast differentiation was 27.57%(<0.01).embryonic stem(ES)cells;osteoblasts;directed differentiation;bone tissue engineering在体内正常发育过程中，多能干细胞经不断分裂增殖和谱系分化，形成机体各种类型的组织、器官和系统。

胚胎干细胞(embryonic stem cells ，ES 细胞)来自内细胞团(inner cell mass,ICM)的一种多能性细胞，Evans 和Kaufman (1981)首次从小鼠延迟着床的胚泡中获得了ES 细胞，随后，人们相继得到了不同动物的ES 细胞。

在体外抑制分化培养时，ES 细胞能保持未分化的二倍体状态而无限增殖，短期内农业生物技术学报2006年扩增可获得相当的数量，一旦撤除分化抑制因素或添加适当诱导剂，ES细胞还可发生谱系或定向分化(Trounson，2002；宋晓平和窦忠英，2003)。

利用ES 细胞的这种特性，可为临床组织修复、细胞移植和器官移植提供种子细胞。

目前，ES细胞体外定向诱导分化已成为干细胞工程领域的热点和难点课题。

骨形成机体柔软组织的支架并构成运动杠杆，对体内器官起着重要的保护作用。

由于创伤、炎症和肿瘤造成的骨缺损，常常影响骨正常功能的发挥，尤其是大段骨损伤的修复是骨科面临的棘手难题。

目前骨损伤有很多治疗方法，如自体、异体和假体骨移植等。

然而，如何选择合适的骨移植材料，并形成符合缺损的骨形态，以及所存在的生物相容性问题，仍需要探索更好的治疗方法。

本实验通过小鼠ES细胞悬浮培养形成类胚体(embryoid bodies，EBs)，并分别添加成骨细胞(osteoblast)条件培养基，维生素C、β-磷酸甘油或地塞米松诱导ES细胞向成骨细胞分化，旨在为骨组织工程提供新的研究思路。

1材料和方法1.1实验材料1.1.1动物与细胞新生1～3d昆白系小鼠50只，由第四军医大学实验动物中心提供；ES-D3细胞，购自中国科学院上海细胞生物研究所。

1.1.2试剂与仪器高糖DMEM(HyClone)，胎牛血清(FBS，Stem Cell Technologies Inc)，维生素C (VC，Sigma)，β-磷酸甘油(Gly，Sigma)，地塞米松(Dex，Sigma)，茜素红S(Sigma)，青霉素钠(哈药集团制药总厂)，硫酸链霉素(华北制药股份有限公司)。

WTB CO2培养箱(美国)，倒置显微镜(COIC)，Nikon E995数码相机(日本)，6孔细胞培养板(NUNC)。

1.2实验方法1.2.1EBs单细胞贴壁培养将悬浮培养第5天的EBs经0.05%胰酶+0.02%EDTA消化制成单细胞悬液。

在6孔细胞培养板每孔中预先放置1cm×1cm的无菌小盖玻片1枚，加0.1%明胶处理后，每孔按密度5×104/mL接种EBs单细胞悬液1mL，补加细胞培养液1mL，置37℃，5%CO2，饱和湿度的培养箱内培养，使EBs单细胞贴壁培养。

1.2.2添加诱导剂诱导分化在EBs单细胞贴壁生长的第14～21天，A组添加60%的成骨细胞条件培养液(宋晓平等，2004)；B组加50μg/mL维生素C＋50mmol/Lβ-磷酸甘油；C组添加50μg/mL 维生素C＋50mmol/Lβ-磷酸甘油＋1μmol/L地塞米松；D组为对照组，不添加诱导剂。

各组均于第22天时吸除培养液，PBS(-)洗，10%中性福尔马林固定后，再用1%茜素红染色液染色，染成鲜红色为成骨细胞。

1.2.3成骨细胞诱导形成率计算在倒置显微镜下，各实验组随机取3个100倍视野，用数码相机照相记录。

在计算机上将数码照片放大至14.65cm×11.09cm，打印于70g复印纸上，仔细剪取孔底部分，准确称其重量()，再剪下茜素红染色阳性结节部分，准确称其重量()(邓力等，1997)，即成骨细胞诱导形成率(%)=×100%。

数据经方差分析和多重检验比较差异显著性。

2结果和分析EBs单细胞贴壁培养第14～21天，在DMEM 基础培养基中，添加60%成骨细胞条件培养液(A 组)，EBs细胞生长晕细胞增殖呈团状聚集。

诱导分化至贴壁培养的第21天时，茜素红染色显示，染色阳性细胞结节，多分布于聚集的细胞群内及其边缘(图版Ⅰ:图1,2)，成骨诱导形成率为10.04%。

在相同时期内，DMEM培养基中添加50μg/mL维生素C＋50mmol/Lβ-磷酸甘油(B组)，贴壁生长的细胞多形成网状结构，茜素红染色阳性细胞分布在这些网状结构中(图版Ⅰ：图3,4)，成骨诱导形成率为7.43%。

添加50μg/mL维生素C＋50mmol/Lβ-磷酸甘油＋1μmol/L地塞米松(C组)，茜素红染色阳性细胞分散而均匀(图版Ⅰ:图5,6)，成骨细胞诱导形成率达27.57%。