荧光探针法测定亚细胞游离Ca_2_研究进展

荧光探针法测定亚细胞游离Ca 2+研究进展李华静,张稳婵,韩 双,邰 玲(山西运城学院应用化学系,山西 运城 044000)摘 要:本文对亚细胞游离Ca 2+的测定研究进行了综述.分析了亚细胞游离Ca 2+的重要信使作用以及常用荧光探针法并对其优、缺点进行了比较和评述.关键词:荧光探针亚细胞游离钙绿荧光蛋白中图分类号:O 657 39 文献标识码:A 文章编号:1671-380X (2007)02-0074-03Th e Deve l op m ent Abou t Surveying and Research i ng Subcell u l ar Free Calciu m w ith Fluorescent Prob e L I H ua-ji ng,Z HANG W en-chan ,HAN Shuang ,TA I L i ng(D e par t m ent of A pp lied Che m istry,Yuncheng Universit y,Shan x i Yuncheng 044000,China)Abstrac t :T he thesis appra i se the deve l op m ent about survery i ng and research i ng subcell u l ar free Calc i u m and ana l y se the i nfor m a tion ca rr ier o f subce ll u lar free Ca lci um and comm en t on fluo rescent probe m ethod and eva l uate v irt ues and defects of it K ey W ords :fl uo rescent probe ;subce ll u l a r ;free calc i u m;green fluorescent pro tein 钙是维持人体生命活动的重要元素之一,Ca 2+是生物体内最重要的信息传递物质之一.Ca 2+作为细胞内的信息传递物质,它起着调节许多重要细胞功能的作用.作为第二信使,Ca 2+还参与生物信号的跨膜传递,并介导细胞对外界刺激的应答反应等.随着人们对于钙代谢、钙通道,钙的转运和利用以及某些疾病发生和发展关系的认识越来越深入,胞内Ca 2+的研究已成为化学、生物学﹑临床医学等学科重要的热点课题[1-5].1 胞内Ca 2+的分布及其信使作用通常细胞钙以结合态和自由离子态(Ca 2+)两种形式存在.只有处于自由离子态的Ca 2+才具有生理活性,而游离Ca 2+又分为细胞外Ca 2+和细胞内C a 2+.一般认为,大多数细胞外钙约50%~60%是结合钙.细胞内钙则99 9%以结合钙的形式存在,且分布也极不均匀,有50%存在于细胞核.许多被称为 钙库!的细胞器,如内质网﹑线粒体等,其钙含量很高,其游离Ca 2+浓度也较胞质高.按占细胞钙含量百分数的多少排列,线粒体占30%;内质网占14%;质膜(外层)占5%;而细胞溶质中钙仅占总钙的0 5%(结合态)或0 005%(离子态).细胞在静息(非激活)状态时,胞质Ca 2+浓度在0 1 mo l/L 左右.由此可见,细胞Ca 2+的分布是极不均匀的,细胞内外之间以及胞内各细胞器与胞质之间均存在较大的浓度梯度.因此,Ca 2+的信使功能是通过调控细胞内游离Ca 2+浓度及其分布来实现的,Ca 2+信号的产生和终止是细胞内Ca 2+增减、波动的结果.所以,亚细胞水平的Ca 2+含量及分布变化的动态监测对于Ca 2+信号传递本质的认识具有十分重要的意义.即要求细胞Ca 2+测定更能够提供有关Ca 2+亚细胞区域的彼此独立又相互关联的信息,诸如胞核、线粒体、内质网等[4].从20世纪50年代起,先后建立和发展了多种测定细胞内Ca 2+的方法,如钙离子传感器法、核磁共振法、微电极法和Ca 2+荧光探针法等,其中Ca 2+荧光探针法是目前最常用的一种方法.2 Ca 2+荧光探针法Ca 2+荧光探针法是近年发展起来的一类钙离子浓度测定方法,Ca 2+荧光探针法包括发光蛋白法和小分子Ca 2+荧光探针法.2 1 发光蛋白法发光蛋白主要包括Ca 2+激活生物发光蛋白和基因重组发光蛋白.1)Ca 2+激活生物发光蛋白:1962年,Sh i m omura [6]等从多管水母(A equo riav ictor i a)中分离出一种蛋白质-水母发光蛋白(aequorin).1967年,R i dgway 和A shley 用该蛋白首次成功地应用于活细胞内[Ca 2+]的测定[7].水母蛋白与Ca 2+结合后发射蓝色荧光(465nm ),在0 1~10 mo l/L Ca 2+浓度范围内,荧光强度与C a 2+浓度成正比,是目前应用较广的一种Ca 2+荧光探针[8-10].Ca 2+激活生物发光蛋白有许多优点:对细胞无毒性,不会影响细胞的正常生长发育;是一种高负电性蛋白,没有区域化现象,也不会渗出细胞[11];测量时不需要强光照射,不会出现光漂白现象和自发荧光干扰等问题.利用基因工程技术合成的一些具有较好靶向性的该蛋白质的突变体,可用于亚细胞器内游离Ca 2+浓度的测定[12-15].但它的不足之处在于高浓度Ca 2+会使其不可逆转的失活[5],不能用来测定浓度较高的某些亚细胞器中的游离C a 2+浓度,如内质网[19];发射的荧光太弱,使得成像很困难;使用时必∀74∀第29卷 第2期2007年4月宜春学院学报(自然科学)Journa l of Y ichun U n i ve rsity (so cia l sc i ence)V o l 29,N o 2Apr 2007* 收稿日期:2007-01-18作者简介:李华静(1978-),女,山西霍州人,助教,硕士,主要从事化学教学与研究须要加入肠腔素(coe lenterazi ne)这种辅酶[5,1617].2)基因重组发光蛋白:以绿荧光蛋白(GFP)为基础的基因重组发光蛋白是近年来研究非常活跃的一个领域[5,18-20].1997年na t ure报道了R Y T sien在这方面的代表性工作基因重组GFP突变体came leons!,即基于Ca2+水平依赖的两发光蛋白之间的荧光共振能量转移(FRET),构建了中心为钙调蛋白及M13多肽,两边分别为发光蛋白CFP和Y FP,并在一端插入某细胞器靶位的信号肽序列的三明治!式重组DNA序列,转染受体细胞,即可在细胞内表达出亚细胞区域定位的、对Ca2+响应的发光蛋白.使用不同的细胞器信号序列构建的系列ca m e leons!已成功应用于H e l a细胞胞质、胞核、内质网等区域Ca2+的检测.基因重组发光蛋白为亚细胞区域Ca2+的测定开辟了光明的发展前景,它是目前测定亚细胞游离Ca2+的最常用的方法[20].基因重组发光蛋白克服了C a2+激活生物发光蛋白的许多缺点,如Ca2+诱导的荧光响应是可逆的;不需要外加特别的辅基;发射的荧光较强,可以采用普通的激光共聚焦显微镜和多光子荧光显微镜来成像等[5,16].此外,该探针可进行细胞内Ca2+的比例分析[19].但也有许多缺点:与Ca2+结合导致的荧光强度变化幅度较小;对p H较为敏感[16];对Ca2+含量瞬变的响应迟缓且不灵敏;在某些细胞或细胞器中难于表达;标记细胞时,手续繁杂,耗费时间太长,不适用于急性分离细胞的测定.综上所述,发光蛋白Ca2+探针的成功构建解决了C a2+探针的亚细胞区域定位标记问题,但发光蛋白对Ca2+含量瞬变的响应迟缓[19];探针自身在细胞内有附加生理活性;特别是他们为基因重组蛋白,需要先构建获得目的基因,随后标记细胞时又需用基因转染的手段,手续繁杂,耗时又费力,且不能用于急性分离细胞的测定[4].这些严重制约了该类探针的广泛应用,因此发光蛋白Ca2+探针未能够发展成为一类人们普遍采用的细胞Ca2+测定探针.2 2 小分子Ca2+荧光探针法该方法可无损伤导入细胞、对Ca2+选择性高、响应迅速且能与现代先进的荧光成像技术联用,是目前应用最广泛的测定胞内Ca2+浓度的方法.目前常用的小分子Ca2+荧光探针主要是由美籍华裔科学家T si en等合成的三代小分子Ca2+荧光探针及其类似物.根据激发波长的不同,可将其分为紫外光激发和可见光激发的Ca2+荧光探针.1)紫外光(UV)激发的Ca2+荧光探针 表1列出了常用紫外光激发的Ca2+荧光探针.2)可见光激发的Ca2+荧光探针 表2列出了常用可见光激发的Ca2+荧光探针.其中F luo-3和Fura-2是目前国际上使用最为广泛的.这些小分子Ca2+荧光探针克服了发光蛋白负载耗时、费力的缺点,可直接以AM酯型导入细胞,孵育只需20~ 30m in,大大简化了负载程序,且这些探针荧光性能优良,能产生较强的荧光信号,所以它们被广泛应用于全细胞钙的测定[20,21].但该类探针容易出现指示剂泄露、光漂白,尤其是不具有靶向性,故难以用于亚细胞水平Ca2+的测定.表1 常用紫外光激发的Ca2+荧光探针Ind ica t o rCa2+F ree( ex/ e m)Ca2+Bound( ex/ e m)K d(n M) Fura-2363/512335/505145Indo-1346/475330/401230B is-f ura2366/511338/504370Q u i n-2353/495333/49560Indo-1FF346/475330/40133,000 Fura-2FF360/505335/50535,000 Indo PE3346/475330/408260Fura PE3364/508335/500250BTC464/533401/5297,000M ag-Indo1349/480328/39035,000M ag-fura2369/511329/50825,000F IP18346/502335/495450FFP18364/475335/408400表2 常用可见光激发的Ca2+荧光探针Ind i catorC a2+F ree( ex/ e m)Ca2+Bound( ex/ em)K d(n M)F l uo-3503/526506/526390F l uo-4491494/516345F l uo-5N491494/51690,000F l uo-3FF506/526515/52641,000M ag-fl uo-4490493/51622,000 Calc i u m G reen-1506/531506/531190 Calc i u m G reen-2506/536503/536550 Calc i u m O range549/575549/576185 Calc i u m C ri m son590/615589/615185O regon g reenB A PTA488-1494/523494/523170 Fura R ed472/657436/637140R hod2556/576553/5761,000R hod-5N547549/576320,000M ag-rhod-2547549/57770,000Calc i u m G reen C18509/530509/53028020世纪90年代初,钙荧光探针的设计、合成与应用研究在我国也活跃起来.其中性能较好的S TD In是一种新型具有靶向性的胞浆内Ca2++荧光探针.STD In的最大激发波长位于540nm,与C a2+结合后蓝移至424nm;2个强∀75∀第2期 李华静,张稳婵,韩 双,等:荧光探针法测定亚细胞游离C a2+研究进展 第29卷度不等的发射峰分别位于601n m和554n m,与Ca2+结合后,两荧光峰强度都增加,最大发射峰位移至601n m处,且水溶性比以前的钙荧光探针较好[22].利用该探针结合激光共聚焦显微镜技术首次观察到5-羟色胺诱导胃底平滑肌细胞产生的!钙火花!(Ca l c i u m Spark)现象,探讨了其形成机理 与其它探针相比,据报道该探针具有较好的靶向性,可只标记胞浆内的C a2+而不标记其他细胞器内的Ca2+,据此可比较准确地测定胞浆内的Ca2+浓度,该探针可望用于测定胞内[Ca2+]i .最近陕西师范大学张小玲教授又合成了不需要引导机制就可直接分别导入胞质和胞核的新型Ca2+荧光探针STD BT[23],该探针可同时标记胞质和胞核,是一种核、质双标的新型Ca2+荧光探针.3 钙荧光探针的发展前景目前,发光蛋白Ca2+探针因标记手续繁杂,耗时又费力,限制了其广泛应用.而国际上广泛使用的小分子C a2+探针又因其不具有靶向性且价格昂贵也限制了其广泛应用.因此设计合成既具有靶向性,又可长波激发,与Ca2+结合前后有荧光峰位移变化、整体性能优良、价廉的新型细胞钙荧光探针依然是试剂合成工作者奋斗的目标.参考文献:[1]M J B erri dge,M D Boo t m an,P L i pp,Calc i u m-life and death si gna,l N a t ure,1998:395,645-648[2]T H un ter,S i gnali ng-2000and beyond,Ce l,l2000:100, 113-127[3]M Zaccolo,P M aga l haes,T P ozzan,Compart menta liza ti on o f c AM P and Ca2+S i gna ls,Curr O p i n Ce ll B i o l ,2002: 14,160-166[4]G R M onte ith,Seeing i s believ i ng:R ecent trends i n the m easurement of Ca2+i n subcell ular doma i ns and i ntrace ll u l a r o rgane 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