转化生长因子β<,1>在食管鳞癌中的表达和临床意义

中文摘要，ｏ’一二ｊ，ｉｇｉｊ暑－‘，ｉ［』，一？‘转化生长因子ｐ（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ，ＴＧＦ—ｐ）是一类多功能的多肽类生长因子，几乎体内的每个细胞都产生ＴＧＦ一马并存在其受体。

』ＴＧＦ—Ｂ。

作为ＴＧＦ一￥的一个重要亚型，同时也是人体内主要的存在形式，早在２０世纪８０年代就已被证实在细胞的增殖与分化、细胞外基质（ＥＣＭ）的合成与沉淀、血管的生成及细胞凋亡中起重要作用。

』毪肿瘤的发生发展过程中，ＴＧＦ—Ｂ，具有双相作用：在肿瘤发生早期，抑制肿瘤细胞的生长；随着肿瘤的发展，它变成了肿瘤生长的刺激因子。

近年来，随着人们对其研究的不断深入，发现ＴＧＦ—ｐ。

作为一类具有多种生物学活性的多效细胞因子，在肿瘤的发生发展、浸润和转移中均起着非常重要的作用。

但是，目前国内外的研究很少涉及ＴＧＦ～ｔ３，在食管鳞癌组织中的表达与病理分级、临床分期、肿瘤浸润深度、淋巴转移的关系。

本研究将就对此问题进行相关探讨。

实验材料１．材料：收集２００１年９月－２００２年３月中国医科大学附属第一医院和辽宁省肿瘤医院胸外科食管癌标本共４５例，其中包括癌组织及癌旁６ｃｍ以上的正常组织，手术切除后于一８０℃深低温冰箱冻存。

所有病例术前均未发现有远处转移，未行放疗、化疗，术后均有病理证实。

４５例病例中男性３４倒，女性１１例；小于６０岁的３１例，大于等于６０岁的１４例，平均年龄５３．２岁（范围３６—７３岁）；均为鳞癌；ＴＮＭ分期Ｉ期９例，Ⅱ期２２例，Ⅲ期１ｌ例，Ⅳ期３例；其中１８例有淋巴结转移。

分期标准依照国际抗癌联盟．１．（ＵＩＣＣ）１９９７年１０月出版的第５版《恶性肿瘤ＴＮＭ分期》中的食管癌标准划分。

２．试剂：ＲＮＡ提取试剂ＴＲＩｚｏｌ购自ＧＩＢＣＯＢＲＬ公司；ＴＡＫＡ．ＲＡＲＮＡＫＩＴ（ＡＭＶ）Ｖ２．１购自宝生物（大连）工程有限公司；ＲＴ—ＰＣＲ引物由上海ＳＡＮＧＯＮ生物工程公司合成；ＰＧＥＭ一３ＺＦ（＋）ＤＮＡ／ＨＡＶⅢＭＡＫＥＲＳ购自华美生物工程公司；其他试剂均为国产分析纯化。

３．主要仪器设备：超声粉碎机（ＣＰＳ—Ｉ型，上海超声波仪器厂）；台式高速低温离心机（ＤＵＰＯＮＴＳＵＰＥＲ一２型，美国ＳＯＲ．ＶＡＬＬ公司）紫外分光光度计（ｕＶ一２６０型，日本ＳＨＩＭＡＤＺＵ公司）；多功能电泳仪（ＭＵＬＴＩＰＨＯＲⅡ型，瑞典ＰＨＡＲＭＡＣＩＡＢＩＯ—ＴＥＣＨ公司）；ＢＩＯＭＥＴｔＬＡ．ＵＮＩＯⅡ型ＰＣＲ仪（德国）；凝胶自动成象及分析系统（ＵＰＶ，ＵＳＡ）。

实验方法１．总ｍＲＮＡ提取：各切取１００毫克食管癌组织及癌旁正常组织，加入１ｍｉＴＲＩｚｏｌ试剂，用匀浆器将组织匀浆，加入０．２ｒｉｄ氯仿充分振荡１５秒，４℃１０，０００ｒｐｍ离心１５分钟，取上清，加入７５％乙醇（ＤＥＰＣ处理水配制）ｌｍｌ，涡旋漂洗一次，４℃７５００ｒｐｍ离心５分钟，弃上清，将沉淀溶于０．０１％ＤＥＰＣ水，置于５５～６０℃水浴中孵育１０分钟，于分光光度计下测定ＲＮＡ浓度，用０．０１％ＤＥＰＣ水调整ＲＮＡ终浓度为ｌｕｇ／ｕｌ，然后置于一８０℃深低温冰箱中保存。

２．反转录及ＰＣＲ扩增：反转录体系如下：适量总ＲＮＡ加入ＯｌｉｇｏｄＴ引物，于７０℃孵育１０分钟，立即置于冰上静置５分钟，再加入ｌｕｌ５×ｂｕｆｆｅｒ、０．５ｕｌｄＮＴＰ、０．２５ｕｌＲＮＡ酶抑制剂，于３７℃孵育５分钟，加入０．５ｕｌＡＭＶ，并以ＤＥＰＣ处理的水，补足５ｕｌ体系，３７℃孵育５０分钟，再于９５℃加热５分钟，灭活ＡＭＶ。

・２・在此基础之上进行ＰＣＲ扩增，ＰＣＲ反应体系如下：取ＲＴ产物５ｕｌ，依次加入１０ｘｂｕｆｆｅｒ２ｕｌ、ＴＧＦ—Ｂｊ上、下游引物各０．８ｕｌ、ＴａｑＥ０．２ｕｌ，用ｄｄＨ２０补足反应体系共２５ｕｌ。

然后送ＰＣＲ仪上扩增。

ＰＣＲ反应条件为：９５０Ｃ变性２分钟，按９４屯１分钟，５５℃１分钟，７２＂Ｃ１分３０秒循环３０个周期，再于７２℃延伸７分钟。

ＴＧＦ—Ｂ，ｃＤＮＡ的引物，根据ＴＧＦ—Ｂ，基因结构，选择扩增ｃＤＮＡ的碱基序列。

上游引物为：５’一ＧＣＣＣＴＧＧＡＣＡＣＣＡＡＣＴＡＴＦＧＣＴ一３’；下游弓！物为：５’一ＡＧＧＣＴＣＣＡＡＡＴＧＴＡＧＧＧＧＣＡＧＧ一３’，预计扩增片段为１６１ｂｐ；内部参照８一ａｃｔｉｎ引物序列上游引物为：５’一ＧＴ—ＧＧＧＣＣＧＧＴＧＴＡＧＧＣＡＣＣＡ一３’；下游引物为：５’一ＧＧＴＴＧＧＣＣＴ－ＴＡＧＧＧＴＴＣＡＧＧ一３’，预计扩增片段为－９４６ｂｐ。

３．ＰＣＲ产物（聚丙爝酰胺凝胶电泳检测）取１０ｕ妒ＣＲ产物进行１２％聚丙烯酰胺凝胶电泳，进行溴乙锭染色（终浓度０．５ｕ∥越）凝胶经ＵＶＰ凝胶成像分撕系统进行扫描分析。

ＴＧＦ一８．ｍＲ—ＮＡ相对表达水平计算公式如下：某样品ＴＧＦ—Ｂ：ｍＲＮＡ相对表达水平＝样品ＴＧＦ—ｔ３，扫攒值／样鼹Ｂ—ａｃｔｉｎ扫描值。

４。

统计分析：检测结果以叉±ｓ表示，缆间比较采用ｔ检验。

实验缕果１．不周组织中ＴＧＦ一￥；ｍＲＮＡ水平：在４５例食管鳞癌标本串，各期食管瘗组织中ＴＧＦ～８，ｍＲＮＡ水平均显著离予癌旁正常组织（Ｐ＜０．０１），丽随着病理分期Ｉ期到Ⅳ期ＴＧＦ～段ｍｔｌＮＡ水平逐渐增离（Ｐ＜０。

０１）。

２．ＴＧＦ—Ｓ，ｍＲＮＡ水平与食管痉临床病理的关系：不同组织分纯程度购食管癌缓织中的ＴＧＦ一８，ｍＲＮＡ水平无显著差异（Ｐ＞０．０１）。

在髀瘤缨魑局部浸润深度中，（Ｔ３＋Ｒ）组食管癌组织中懿ＴＧＦ一§ｌｍＲＮＡ承平显著褰予（Ｔ，＋Ｔ：）组（Ｐ《Ｏ。

０１）。

翦淋・３・巴结转移组的ＴＧＦ—Ｂ。

ｍＲＮＡ水平显著高于无淋巴结转移组（Ｐ＜ｏ．０１）。

ＬｐＬ７结论、ＴＧＦ—Ｂ，ｍＲＮＡ水平与食管鳞癌的发生、进展和转移有密切的相关性。

关键词：食管癌；转化生长因子；逆转录聚合酶链反应、／・４・英文缩略语英文缩写英文全称中文全称・９・前言１９７８年，ＤｅＬａｒｃｏ稳Ｔｏｄａｒｏ在小鼠肉瘿病毒转化的细胞株条件培养基中鉴定出ＳＧＦ（Ｓａｒｃｏｍａｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ），因具有转化细煦特性，教又称为ＴＧＦ（Ｔｒａｎｓｆｏｍｌｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）。

转化生长因子８（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ８，ＴＧＦ一§）是一类多功能的多肽类生长因子，几乎体内鼹每令细胞都产生ＴＧＦ一８并存在其受体。

ＴＧＦ—Ｂ，作为ＴＧＦ一８的一个重要或型，同时也是人体内主要的存在形式，旱在２０世纪黝年代就已技证实在纲胞的增殖与分化、缨脆外基质（ＥＣＭ）的合成与泼淀、血管的生成及缎脆凋亡中起燕要作翔。

许多痰病摇动脉粥群硬化、肾脏、肝脏、膝等的终维化，以及肿瘤的发生发展，都与ＴＧＦ一８，生成的增多或减少有关¨Ｊ。

在翳瘤的发生发麓过程中；ＴＧＦ～器，具寿双摺作用：在肿癯发生早期，摔割肿瘤细胞的生长；随蓉辨瘤的发展，它变成了肿瘤生长的刺激因子Ｈ１。

１９９９年，孙苏平等人观察了食管鳞癌患者巍清ＴＧＦ一多。

承平的改变与放疗近期疗效的关系。

结果表明，放疗前食管鳞癌患者盘清ＴＧＦ～３，平均水平弱显窝予对照组，差异显蓉；敖疗詹其水平与放疗的近摆疗效、食管癌是否转移或复发密切格关。

研究认为盎清ＴＧＦ一§，求平可以传为监测食管鳞癌敖疗疗效的一顼重要指标”－。

近年来，随着Ａ们对其研究的不甑深入，发现ＴＧＦ—Ｓ。

作为一类舆毒多种生物学活佼的多效缨胞因子，在胂瘤的发生发展、浸润和转移中均超着非常重要的作用Ｈ』。

但是，目前凿内外的研究很少涉及ＴＧＦ～叠，在食管鳞癌缱绥中的表达与病理分级、临床分期、肿瘤浸滤深度、淋巴转移的关系。

率研究将就对此问题进行相关探讨。

・ｌＯ・实验材料与方法一、实验毒手辩１．实验对象：收集２００１年９胃一２００２年３月中阔医科大学附耩第一医疏稻辽宁省肿瘸医院腩外科食管癌标本共本５销，其中包括癌组织及癌旁６ｃｍ以上的正常组织，手术切除后于一８０℃深低溢泳箱冻存。

所有瘸饲术前均未发现有远处转移，未行敌疗、化疗，术后均有病理证实。

４５饲病例中勇往３４铡，女性ｌｌ倒；小于６０岁的３ｌ衡，大子等于６０岁的１４衙，平均年龄５３．２岁（蔽酹３６～７３岁）；均为鳞癌；ＴＮＭ分期Ｉ朝９铆，矗期２２倒，磁期１１傻，Ⅳ瓣３饲；其中砖俪有淋已结转移。

分期标准依照函际抗癌联盟（ＵｔＣＣ）１９９７年ｌＯ月岛版的第５版《恶性肿痛ＴＮＭ分期》中的食管瘸标准鲻分。

２．主要实验药品：ＲＮＡ提取试剂疆Ｉｚｏｌ购蠢ＧＩＢＣＯＢＲＬ公司；ＴＡＫＡＲＡＲＮＡＫＩＴ（ＡＭＶ）Ｖ２．１购自塞生物（大连）工程有隈公司；ＲＴ—ＰＣＲ弓｜物由上海ＳＡＮＧＯＮ生物工程公司合成；ＰＧＥＭ～３ＺＦ（＋）ＤＮＡ／ＨＡＶ１１ＩＭＡＫＥＲＳ购自华美生物工程公司；其他试剂均为国产分析纯。

３．主要仪器设备：超声粉碎机（ＣＰＳ—ｌ型，上海超声波仪器厂）；台式高速低温离心机（ＤＵＰＯＮＴＳＵＰＥＲ一２型，美国ＳＯＲ—ＶＡＩ上公司）紫外分光光度计（ＵＶ一２６０墅，日本ＳＨＩＭＡＤＺＵ公闭）；多功能电泳仪（ＭｕＬＴＩＰＨＯＲⅡ型，瑞典ＰＨＡＲＭＡＣＩＡＢＩＯ—ＴＥＣＨ公司）；ＢＩＯＭＥＴＲＡＵＮＩＯｌＩ型ＰＣＲ仪（德国）；凝胶自动成象及分析系统（ＵＰＶ，ＵＳＡ）。

二、实验方法．１．总ｍＲＮＡ提取：参照ＴＲＩｚｏｌ说明书分别提取食管癌组织及癌旁正常组织的总ＲＮＡ。

具体步骤为：各切取１００毫克食管癌组织及癌旁正常组织，加入１ｍｌＴＲＩｚｏｌ试剂，用匀浆器将组织匀浆，加入０．２ｍｌ氯仿充分振荡１５秒，４℃１０，０００ｒｐｍ离心１５分钟，取上清，加入７５％乙醇（ＤＥＰＣ处理水配制）ｌｍｌ，涡旋漂洗一次，４℃７５００ｒｐｍ离心５分钟，弃上清，将沉淀溶于０．０１％ＤＥＰＣ水，置于５５～６０℃水浴中孵育１０分钟，于分光光度计下测定ＲＮＡ浓度，用Ｏ。

０１％ＤＥＰＣ水调整ＲＮＡ终浓度为１ｕｇ／ｕｌ，然后置于一８０℃深低温冰箱中保存。

２。

反转录及ＰＣＲ扩增：反转录体系如下：适量总ＲＮＡ加入ＯｌｉｇｏｄＴ引物，于７０℃孵育１０分钟，立即置于冰上静置５分钟，再加入１ｕｌ５Ｘｂｕｆｆｅｒ、０．５ｕｌｄＮＴＰ、０．２５ｕｌＲＮＡ酶抑制剂，于３７℃孵育５分钟，加入０．５ｕｌＡＭＶ，并以ＤＥＰＣ处理的水，补足５ｕＬ体系，３７℃孵育５０分钟，再于９５℃加热５分钟，灭活ＡＭＶ。

在此基础之上进行ＰＣＲ扩增，ＰＣＲ反应体系如下：取ＲＴ产物５ｕｌ，依次加入１０×ｂｕｆｆｅｒ２ｕｌ、ＴＧＦ—Ｂ，上、下游引物各０．８ｕＬ、ＴａｑＥ０．２ｕｌ，用ｄｄＨ：Ｏ补足反应体系共２５ｕｌ。

然后送ＰＣＲ仪上扩增。

ＰＣＲ反应条件为：９５℃变性２分钟，９４℃１分钟，５５℃１分钟，７２℃１分３０秒循环３０个周期，再于７２℃延伸７分钟。

ＴＧＦ一１３，ｃＤＮＡ的引物，根据ＴＧＦ—Ｂ１基因结构，选择扩增ｃＤＮＡ的碱基序列。