细胞因子常识
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细胞因子
3. 诱导凋亡 IL-2可诱导抗原活化的T淋巴细胞凋亡， TNF可诱导肿瘤细胞凋亡。 4. 刺激造血 由骨髓基质细胞和T细胞等产生刺激造血 的细胞因子，在血细胞的生成方面起重要作用
六、细胞因子的网络特性
1. 细胞因子间可相互诱生
• • • • • IL-1能诱生IFN、IL-1、IL-2、IL-4等， IL-2能诱生TNF、IL-2、LT等 IL-1、IL-5、IL-6等可促进IL-2受体的表达； IL-1能降低TNF受体的密度 B细胞和T细胞活化过程中，常需要两种以上细胞因子 的协同作用或彼此调节
细胞因子临床应用存在下列问题
1) 2) 3) 体内效果远不如在体外理想 体内应用毒性反应相当严重 细胞因子的半衰期过短（以分钟计）
细胞因子疗法可从以下几个方面加以改进
1) 2) 3) 4) 5) 细胞因子的局部应用 诱导机体持续产生内源性细胞因子 细胞因子导向疗法 改进细胞因子在体内的应用方案 联合应用优于单独用 细胞因子基因疗法
白 细 胞 介 素 的 特 性
2、集落刺激因子（colony stimulating factor, CSF) 1) 是指能够刺激多能造血干细胞和不同发育阶段的 造血干细胞增生、分化，在半固体培养基中形成 细胞集落的细胞因子。
2）根据它们的作用范围，分别命名为：
3、干扰素（interferon, IFN） 1) 干扰素是最先发现的细胞因子，
干扰素 β （ Beta ）
成纤维细胞、上皮细胞
γ （ Gamma ）
T淋巴细胞、NK细胞
Leukocyte Type I
Fibroblast Type I
Immune Type II
基因
糖基化 功能型
>22
细胞因子常识
重组细胞因子概述一、细胞因子的概念细胞因子(cytokine)是由机体多种细胞分泌的小分子蛋白质，通过结合细胞表面的相应受体发挥以调节免疫应答为主的生物学作用。
细胞因子具有非常广泛的生物学活性，包括促进靶细胞的增殖和分化，增强抗感染和细胞杀伤效应，促进或抑制其它细胞因子和膜表面分子的表达，促进炎症过程，影响细胞代谢等。
二、细胞因子的特征1、低分子量；一般为＜60kD的多肽或糖蛋白。
多以单体形式存在，少数为二聚体，三聚体。
2、天然细胞因子由抗原、丝裂原或其他刺激物活化的细胞所分泌，通过旁分泌(paracrine)、自分泌(autocrine)或内分泌(endocrine)方式在局部发挥短暂作用。
3、一种细胞因子可由多种细胞产生，同一种细胞可产生多种细胞因子。
4、需通过与靶细胞表面相应受体结合后发挥其生物学效应。
5、具有高效性、多效性、叠性、拮抗性、协同性和网络性。
三、细胞因子的分类1、白细胞介素(interleukin，IL-s)最初是指由白细胞产生又在白细胞间发挥作用的细胞因子。
2、干扰素（interferon,IFN)最早发现的细胞因子，有干扰病毒感染和复制的能力。
分α、β和g三种类型。
3、肿瘤坏死因子超家族(tumor necrosis factor，TNF)1975年发现的一种能使肿瘤发生出血坏死的物质。
4、集落刺激因子(colony-stimulating factor，CSF)指能够刺激多能造血干细胞和不同造血祖细胞增殖分化，在半固体培养基中形成相应细胞集落的细胞因子。
包括G-CSF（粒细胞）、M-CSF（巨噬细胞）、GM-CSF（粒细胞、巨噬细胞）、Multi-CSF（多重）（IL-3）、红细胞生成素(EPO)、干细胞生长因子(SCF)、血小板生成素(TPO)等。
5、趋化因子(chemokine)主要功能是招募血液中的单核细胞、中性粒细胞、淋巴细胞等进入特定的淋巴器官和组织以及感染发生的部位。
细胞因子医学宣教专家讲座
• 定义：含有刺激细胞生长作用细胞因子； • 分类：转化生长因子-β（TGF-β）
表皮生长因子（EGF） 血管内皮生长因子(VEGF) 成纤维细胞生长因子（FGF） 神经生长因子（NGF） 血小板衍生生长因子（PDGF）
2024/4/9
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趋化性细胞因子chemokine
• 细胞因子受体都是跨膜蛋白，由胞膜外区、跨膜区和 胞浆区组成
2024/4/9
细胞因子医学宣教专家讲座
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细胞因子受体分类（结构特征）
• I 类细胞因子受体家族 • II类细胞因子受体家族 • 免疫球蛋白超家族受体 • 蛋白酪氨酸激酶受体超家族 • 可溶性细胞因子受体
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• TNF-a:活化单核-巨噬细胞、抗原激活T细胞、活化NK 细胞产生,杀伤靶细胞和促进细胞凋亡。
• TNF-b：由活化T细胞产生，又称淋巴毒素,一个能使肿 瘤发生出血坏死物质。
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集落刺激因子 colony stimulating factor, CSF
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干扰素interferon,IFN
• IFN-α/β：由白细胞、成纤维细胞和病毒感染组织细胞 产生;发挥抗病毒和细菌感染作用。
• IFN-γ：由T细胞和NK细胞产生。发挥免疫调整和抗肿 瘤作用。
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肿瘤坏死因子tumor necrosis factor,TNF
第一节 细胞因子概述
表皮生长因子（EGF） 血管内皮生长因子(VEGF) 成纤维细胞生长因子（FGF） 神经生长因子（NGF） 血小板衍生生长因子（PDGF）
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趋化性细胞因子chemokine
• 细胞因子受体都是跨膜蛋白，由胞膜外区、跨膜区和 胞浆区组成
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细胞因子受体分类（结构特征）
• I 类细胞因子受体家族 • II类细胞因子受体家族 • 免疫球蛋白超家族受体 • 蛋白酪氨酸激酶受体超家族 • 可溶性细胞因子受体
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• TNF-a:活化单核-巨噬细胞、抗原激活T细胞、活化NK 细胞产生,杀伤靶细胞和促进细胞凋亡。
• TNF-b：由活化T细胞产生，又称淋巴毒素,一个能使肿 瘤发生出血坏死物质。
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集落刺激因子 colony stimulating factor, CSF
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干扰素interferon,IFN
• IFN-α/β：由白细胞、成纤维细胞和病毒感染组织细胞 产生;发挥抗病毒和细菌感染作用。
• IFN-γ：由T细胞和NK细胞产生。发挥免疫调整和抗肿 瘤作用。
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肿瘤坏死因子tumor necrosis factor,TNF
第一节 细胞因子概述
第6章-细胞因子(2)
5. 趋化因子受体家族 (G蛋白偶联受体家族)
结构特点：含有7个疏水性跨膜区 ( -螺旋结 构)，胞质区与G蛋白(结合GTP的蛋白)结合，将 信号转导入细胞内部。
35
第四节 细胞因子受体
36
（二）可溶型CKR和CKR拮抗剂
1.可溶型CKR （1）存在：血清、尿液等体液。 （2）可能作用： A.与膜受体竞争结合CK，抑制CK功能。 B.与CK结合, 转运至机体相关部位，增加局部CK的浓度，发挥
42
小结
1. 掌握细胞因子概念、分类、特点； 2. 掌握白细胞介素、干扰素的定义，主要细胞因子的
生物学活性； 3. 了解细胞因子受体的结构、意义，细胞因子的临床
应用。
43
习题
1、名词解释：CK、IL、IFN、TNF、CSF 2、细胞因子的分类及生物学活性有哪些？
44
膜外区（细胞因子结合区）
CK （跨膜糖蛋白）
跨膜区（富含疏水性氨基酸区）
胞质区（信号转导区）
32
（一）CKR分类 ——根据膜外区结构特征分5类
1.免疫球蛋白超家族(IgSF)
在Ig的每个结构域中，都是由70～110个氨基酸组成 的紧密折叠的结构。后来在很多不同种类的蛋白质 中也都发现有类Ig结构域的存在，这些结构同Ig一 起构成了IgSF (immunoglobulins superfamily)。 结构特点：膜外区具有免疫球蛋白样功能区。
第三节 细胞因子的生物学活性
一、调节固有免疫应答
参与固有免疫应答的细胞有：DC，单核-巨噬细胞，中性粒细 胞，NK细胞，NKT细胞，γδT细胞，B-1细胞，嗜碱性粒细胞和 嗜酸性粒细胞等，细胞因子对这些细胞发挥重要的调节作用。
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第三节 细胞因子的生物学活性
结构特点：含有7个疏水性跨膜区 ( -螺旋结 构)，胞质区与G蛋白(结合GTP的蛋白)结合，将 信号转导入细胞内部。
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第四节 细胞因子受体
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（二）可溶型CKR和CKR拮抗剂
1.可溶型CKR （1）存在：血清、尿液等体液。 （2）可能作用： A.与膜受体竞争结合CK，抑制CK功能。 B.与CK结合, 转运至机体相关部位，增加局部CK的浓度，发挥
42
小结
1. 掌握细胞因子概念、分类、特点； 2. 掌握白细胞介素、干扰素的定义，主要细胞因子的
生物学活性； 3. 了解细胞因子受体的结构、意义，细胞因子的临床
应用。
43
习题
1、名词解释：CK、IL、IFN、TNF、CSF 2、细胞因子的分类及生物学活性有哪些？
44
膜外区（细胞因子结合区）
CK （跨膜糖蛋白）
跨膜区（富含疏水性氨基酸区）
胞质区（信号转导区）
32
（一）CKR分类 ——根据膜外区结构特征分5类
1.免疫球蛋白超家族(IgSF)
在Ig的每个结构域中，都是由70～110个氨基酸组成 的紧密折叠的结构。后来在很多不同种类的蛋白质 中也都发现有类Ig结构域的存在，这些结构同Ig一 起构成了IgSF (immunoglobulins superfamily)。 结构特点：膜外区具有免疫球蛋白样功能区。
第三节 细胞因子的生物学活性
一、调节固有免疫应答
参与固有免疫应答的细胞有：DC，单核-巨噬细胞，中性粒细 胞，NK细胞，NKT细胞，γδT细胞，B-1细胞，嗜碱性粒细胞和 嗜酸性粒细胞等，细胞因子对这些细胞发挥重要的调节作用。
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第三节 细胞因子的生物学活性
细胞因子
IL 1～35
干扰素： Ⅰ型α/β —白细胞、成纤维细胞、病毒感染细胞产生 Ⅱ型γ ——活化T细胞、NK细胞等产生。 功能：增强NK、CTL/单核-巨噬细胞活性；增强MHC I、 II类分子的表达；抑制病毒增殖；抗肿瘤。 肿瘤坏死因子： TNF-α:由活化Mo-M ø 、NK细胞、T细胞等产生 TNF-β：由活化T细胞产生（LT） 功能：使肿瘤出血坏死，抑制病毒感染细胞的生长，刺 激T、B细胞生长；炎症介质，内源性致热源，高浓度可 导致恶液质。
集落刺激因子： 刺激造血干细胞增殖分化，并在半固体培养基上长 成细胞集落的细胞因子。 GM-CSF,M-CSF,G-CSF,EPO,SCF,TPO Chemokine：
白细胞、基质细胞分泌，按半胱氨酸的排列分亚家族：
生长因子： 刺激细胞生长作用的细胞因子。 TGF-β,EGF,VEGF,FGF,NGF,PDGF; IL-2,TNF
CK功能 功能 的多向性、 的多向性、 重叠性、 重叠性、 协同性和 拮抗性作 用示意图
抗原于单核 细胞作用后 导致TH细胞 导致 细胞 活化并产生 细胞因子， 细胞因子， 从而在整个 免疫应答的 不同过程中 发挥相应的 调节作用
第二节
CK的分类
分类： 分类：按其结构可分为六个大家族 •白细胞介素 IL •干扰素IFN •肿瘤坏死因子TNF •集落刺激因子CSF •生长因子GF •趋化性细胞因子chemokine
第三节 CK的生物学活性
一、调节固有免疫应答 DC、Mo-MΦ、中性粒细胞、NK细胞 二、调节适应性免疫应答 B细胞、T细胞 三、刺激造血 IFN α、β 抗病毒作用
细胞因子与临床
与疾病的发生有关 细胞因子及其相应的生物制品的应用
第六章 细胞因子 （Cytokine,CK） ）
细胞因子的名词解释
细胞因子的名词解释细胞因子是一类具有调节、介导和传递作用的分子信号物质，它在生物体内起着重要的调控功能。
细胞因子主要通过与特定受体结合，激活一系列细胞内信号传导通路，影响细胞的生长、分化和功能活动。
细胞因子的种类繁多，包括细胞生长因子、细胞因子家族、细胞凋亡因子等，它们合作相互作用，维持生物体内部的平衡。
1. 细胞生长因子细胞生长因子是一类对细胞生长与分化具有刺激作用的蛋白质分子。
常见的细胞生长因子包括表皮生长因子（EGF）、血小板衍生生长因子（PDGF）、成纤维生长因子（FGF）等。
细胞生长因子能够结合到靶细胞的受体上，通过激活内部信号传导通路，触发一系列反应，促进细胞的增殖和生长，参与组织发育以及伤口愈合等生理过程。
2. 细胞因子家族细胞因子家族是一类在结构和功能上高度保守的蛋白质分子，它们在细胞信号转导过程中起到重要作用。
典型的细胞因子家族包括肿瘤坏死因子（TNF）家族、白介素（IL）家族、干扰素（IFN）家族等。
细胞因子家族成员通常具有类似的结构域和生物活性，能够与特定的受体结合，触发一系列的信号级联反应，影响免疫、炎症等重要生理功能。
3. 细胞凋亡因子细胞凋亡因子是一类参与细胞凋亡（程序性细胞死亡）的蛋白质分子，能够调控细胞的死亡信号通路。
典型的细胞凋亡因子包括肿瘤坏死因子（TNF）、凋亡诱导配体（FasL）、乳头状瘤病毒（Warts virus）等。
细胞凋亡因子能够与受体结合，激活千变万化的信号通路，诱导细胞凋亡，起到清除异常、老化或受损细胞的作用，维护机体内部的稳定环境。
4. 细胞因子的功能与应用细胞因子作为细胞间的信息分子，参与调节免疫、炎症、生长和发育等多个生理和病理过程。
它们在医学领域有着广泛的应用。
例如，重组细胞因子制剂被广泛应用于治疗癌症、类风湿关节炎、多发性硬化症等多种疾病，调节机体的免疫反应和细胞增殖。
此外，细胞因子还被用于干细胞培养和再生医学研究中，通过调控干细胞的命运决定和分化，实现组织工程与器官再生。
医学免疫学 第6讲 细胞因子
趋化因子 细菌产物、白三烯B4、C52、中性细胞阳离子蛋 白、细胞因子(ILs、TNF调理素Fc、C3b)
发热 疼痛 IL-1、IL-6、TNF、PG PGE2、缓激肽
组织损伤 氧自由基、溶酶体酶、NO
二、炎性介质 1.概念： 指参与炎症反应的各种细胞因子 。
2.常见炎性介质：
作用 主要炎性介质种类
血管扩张 组胺、缓激肽、PGE2、PGD2、PGF2、PGh、NO 血管通透 组胺、缓激肽、C3a、C5a、LTC4、 LTD4、 性增高 LTE4、PAF、P物质、活性氧代谢产物 粘附分子 选择蛋白类、Ig类、整合蛋白类、粘液样糖蛋白
3.结构：大多为穿膜的蛋白或糖蛋
白，含胞膜外区、穿膜区和胞浆 区。少数是碳水化合物。 4.分布：血细胞和非造血细胞。
二、粘附分子
(cell adhesion molecules, CAM)
介导细胞间或细胞与细胞外基质
间相互接触和结合的分子的统称。
①整合素家族
②免疫球蛋白超家族（IgSF）
③选择素家族：成员L、P、E。
第6讲 细胞因子
细胞因子好比
“指挥信息系统”。
1.细胞因子（cytokine）
由机体的免疫细胞（单核-巨噬细胞、
淋巴细胞）或非免疫细胞（成纤维细
胞、内皮细胞等）分泌的具有生物学
活性的小分子蛋白质的统称，它们能
调节多种细胞的生理功能。
2.细胞因子的共同特性：
②分泌特点：*必须经刺激物刺激才能产生。 ③作用特点：活性极强，非特异性作用 ④相互作用构成细胞因子网络。 ①化学性质：小分子量的蛋白质或糖蛋白。 *分泌是一个短时自限过程。 自分泌、旁分泌、内分泌 多效性 重叠性 拮抗性 协同性 *同种细胞可产生多种细胞因子。
细胞因子
趋化因子受体 CC Receptors CCR1 CCR2A & B CCR3 CCR4 CCR5 CCR6 CCR7/EBI1 CCR8 CCR9/10 配体 MIP-1α,RANTES, MCP-1, MCP-1, MCP-3, MCP-5 Eotaxin, RANTES, MCP-2,3,4 MIP-1α, RANTES, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, RANTES MIP-3α/LARC/Exodus-1 MIP-3β/ELC I-309/mTCA-3 MCP-1,3
干扰素(Interferon,IFN) 抵抗病毒的感染, 干扰病毒的复制的细胞因子，包括 IFN,IFN,(I型);IFN(II型)
肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF) 可直接诱导肿瘤细胞凋亡的细胞因子,包括TNF, TNF(LymphotoxinLT）,FASL,CD70L,CD30L,CD40L, OX40L,TRAIL(TNF related apoptosis-inducing ligand)等
6Ckine/SLC MIP-1α MIP-1β MIP-3β/ELC RANTES CKβ8/MPIF1 Exdous-2
Lymphoid F, M, L, N, E, MC, F, M, L, N, MC Tumor cell lines Thymus, Lymph nodesT, ME, F, M, Various cell lines Liver, lung, bone marrownode tissues Lymph
b. IL-6R、 IL-11R、 G-CSFR、 G-CSFR、
gp130 均含一个IGSF和1个EpoR区
c. LIFR,含2个EpoR区 d. CNTFR, 含1个IGSF区和1个 EpoR区GPI 连
干扰素(Interferon,IFN) 抵抗病毒的感染, 干扰病毒的复制的细胞因子，包括 IFN,IFN,(I型);IFN(II型)
肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF) 可直接诱导肿瘤细胞凋亡的细胞因子,包括TNF, TNF(LymphotoxinLT）,FASL,CD70L,CD30L,CD40L, OX40L,TRAIL(TNF related apoptosis-inducing ligand)等
6Ckine/SLC MIP-1α MIP-1β MIP-3β/ELC RANTES CKβ8/MPIF1 Exdous-2
Lymphoid F, M, L, N, E, MC, F, M, L, N, MC Tumor cell lines Thymus, Lymph nodesT, ME, F, M, Various cell lines Liver, lung, bone marrownode tissues Lymph
b. IL-6R、 IL-11R、 G-CSFR、 G-CSFR、
gp130 均含一个IGSF和1个EpoR区
c. LIFR,含2个EpoR区 d. CNTFR, 含1个IGSF区和1个 EpoR区GPI 连
细胞因子
细胞因子与疾病诊断
1.疾病的辅助诊断 2.判断疾病预后与转归 3.检测机体免疫功能状态,治疗效果和病情
细胞因子与疾病治疗
(一)细胞因子补充/添加疗法:1.给予外源性CK; 2. 细胞因子基因疗法; 3.联合应用;4.诱导产生内源 性CK或外源/内源CK联合应用. (二)细胞因子阻断/拮抗疗法:1.CK产生抑制剂; 2. 抗CK抗体; 3.阻断CK与其受体结合,包括封闭 CK和CKR; 4.抑制或下调CKR表达; 5.CK导向 疗法; 6.给予具有抑制性效应的CK. (三)细胞因子与疾病预防:预防骨髓抑制;免疫佐剂 作用.
其他重要的膜分子（如CD40、CD27及死亡受体Fas、 DR4、DR5等）。
4． IV型CKR家族 免疫球蛋白超家族 该 家族胞外区含免疫球蛋白分子的结构域，包 括IL-1、M-CSF、SCF等的受体
5．趋化性细胞因子受体家族 该家族成员 分子含7个跨膜结构域，包括CCR1~11、 CXCR1~5, CR1与CX3CR1。多数趋化因子 受体可与若干不同的趋化因子结合
免疫细胞的起源与分化
（三）介导天然免疫和炎症反应： IL-6、IL-1、IFN、TNF和趋化因子家族是
系统的作用；等等。
启动抗菌性炎症反应的关键因子，又被称
为促炎细胞因子（pro-inflammatory
cytokine）。
（四）决定免疫应答类型 ： ①Th1细胞产生IL-2、IFN-、TNF-等细 胞因子，主要参与细胞介导的炎症反应； ②Th2细胞主要产生IL-4、IL-5、IL-6、IL9、IL-10、IL-13等细胞因子，主要介导体 液免疫应答和I型超敏反应。 （五）其它：CSF家族成员刺激造血功能； 细胞因子参与调节神经-内分泌
•二、细胞因子的效应机制 •1 细胞因子与相应受体结合后，可诱导受体亚单
细胞因子(免疫学检验课件)
态
免疫学测定方法学评价
➢优点： 特异性高 操作简便、快速，无需依赖细胞株 影响因素较少且易控制，重复性好，方法容易标准化。
➢缺点： 所测定的只是细胞因子的蛋白含量，与其生物活性不一
定呈正比 结果与所用的抗体来源及亲和力有很大的关系 敏感性相对较低 标本中细胞因子的可溶性受体，会影响特异性抗体对细
胞因子的结合
(四) 集落刺激因子（colony-stimulating factor， CSF） ：G-CSF、M-CSF、GM-CSF、SCF、 EPO、TPO等。
(五)趋化因子（chemokine）：促进淋巴细胞、中性 粒细胞、单核细胞等到达炎症部位并激活。
(六)生长因子（growth factor，GF） ：TGF-β、 EGF 、NGF、VEGF、FGF 等。
（六）两面性：通常情况下，发货 抗感染、抗病毒、促进造血和免疫 调节等功能，但在一些异常情况下 又参与炎症反应、诱导肿瘤等疾病 的发生。
（七）非特异性：细胞因子以非特异性 方式发挥作用,不受MHC限制，细胞因 子必须与相应受体结合才能发挥效应;
（八）网络性：细胞因子之间通过合成 分泌的作用相互调节、生物学效应的相 互影响，从而形成复杂而有序的因子网 络，达到机体稳态平衡。
三、细胞因子的免疫学检测法
利用抗原抗体反应的原理，制备出抗细 胞因子的单克隆抗体或多克隆抗体，通过 同位素、荧光素或酶等标记技术加以放大 和显示，从而定性或定量分析细胞因子。 （一）酶联免疫吸附试验（ELISA）
是定量分析中最常用方法。但不能判 断细胞因子的生物学活性。
ELISA方法
ELISA法是应用最为广泛的非均相酶标免疫分析技术，一 步或多步的抗原抗体反应和一步酶促反应构成ELISA的基 本步骤，可作定性或定量分析。ELISA法不仅可以用于细 胞因子检测，也可用于可溶性细胞因子受体或可溶性粘 附因子的测定
免疫学测定方法学评价
➢优点： 特异性高 操作简便、快速，无需依赖细胞株 影响因素较少且易控制，重复性好，方法容易标准化。
➢缺点： 所测定的只是细胞因子的蛋白含量，与其生物活性不一
定呈正比 结果与所用的抗体来源及亲和力有很大的关系 敏感性相对较低 标本中细胞因子的可溶性受体，会影响特异性抗体对细
胞因子的结合
(四) 集落刺激因子（colony-stimulating factor， CSF） ：G-CSF、M-CSF、GM-CSF、SCF、 EPO、TPO等。
(五)趋化因子（chemokine）：促进淋巴细胞、中性 粒细胞、单核细胞等到达炎症部位并激活。
(六)生长因子（growth factor，GF） ：TGF-β、 EGF 、NGF、VEGF、FGF 等。
（六）两面性：通常情况下，发货 抗感染、抗病毒、促进造血和免疫 调节等功能，但在一些异常情况下 又参与炎症反应、诱导肿瘤等疾病 的发生。
（七）非特异性：细胞因子以非特异性 方式发挥作用,不受MHC限制，细胞因 子必须与相应受体结合才能发挥效应;
（八）网络性：细胞因子之间通过合成 分泌的作用相互调节、生物学效应的相 互影响，从而形成复杂而有序的因子网 络，达到机体稳态平衡。
三、细胞因子的免疫学检测法
利用抗原抗体反应的原理，制备出抗细 胞因子的单克隆抗体或多克隆抗体，通过 同位素、荧光素或酶等标记技术加以放大 和显示，从而定性或定量分析细胞因子。 （一）酶联免疫吸附试验（ELISA）
是定量分析中最常用方法。但不能判 断细胞因子的生物学活性。
ELISA方法
ELISA法是应用最为广泛的非均相酶标免疫分析技术，一 步或多步的抗原抗体反应和一步酶促反应构成ELISA的基 本步骤，可作定性或定量分析。ELISA法不仅可以用于细 胞因子检测，也可用于可溶性细胞因子受体或可溶性粘 附因子的测定
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重组细胞因子概述
一、细胞因子的概念
细胞因子(cytokine)是由机体多种细胞分泌的小分子蛋白质，通过结合细胞表面的相应受体发挥以调节免疫应答为主的生物学作用。
细胞因子具有非常广泛的生物学活性，包括促进靶细胞的增殖和分化，增强抗感染和细胞杀伤效应，促进或抑制其它细胞因子和膜表面分子的表达，促进炎症过程，影响细胞代谢等。
二、细胞因子的特征
1、低分子量；一般为＜60kD的多肽或糖蛋白。
多以单体形式存在，少数为二聚体，三聚体。
2、天然细胞因子由抗原、丝裂原或其他刺激物活化的细胞所分泌，通过旁分泌(paracrine)、自分泌(autocrine)或内分泌(endocrine)方式在局部发挥短暂作用。
3、一种细胞因子可由多种细胞产生，同一种细胞可产生多种细胞因子。
4、需通过与靶细胞表面相应受体结合后发挥其生物学效应。
5、具有高效性、多效性、叠性、拮抗性、协同性和网络性。
三、细胞因子的分类
1、白细胞介素(interleukin，IL-s)
最初是指由白细胞产生又在白细胞间发挥作用的细胞因子。
2、干扰素（interferon,IFN)
最早发现的细胞因子，有干扰病毒感染和复制的能力。
分α、β和g三种类型。
3、肿瘤坏死因子超家族(tumor necrosis factor，TNF)
1975年发现的一种能使肿瘤发生出血坏死的物质。
4、集落刺激因子(colony-stimulating factor，CSF)
指能够刺激多能造血干细胞和不同造血祖细胞增殖分化，在半固体培养基中形成相应细胞集落的细胞因子。
包括G-CSF（粒细胞）、M-CSF（巨噬细胞）、GM-CSF（粒细胞、巨噬细胞）、Multi-CSF（多重）（IL-3）、红细胞生成素(EPO)、干细胞生长因子(SCF)、血小板生成素(TPO)等。
5、趋化因子(chemokine)
主要功能是招募血液中的单核细胞、中性粒细胞、淋巴细胞等进入特定的淋巴器官和组织以及感染发生的部位。
根据趋化因子近N端半胱氨酸(Cys)的位置、排列方式和数量，可分为CC、CXC、C、CX3C四个亚家族。
6生长因子(growth factor，GF)
生长因子(GF)是具有刺激细胞生长作用的细胞因子。
六、生物学活性质控
不同的细胞因子用不同的方法进行相应的体外（in vitro）或体内（in vivo）活性检测。
重组细胞因子活性通常会以ED50（半数有效浓度）或units（活性单位）来标识。
因此1mg细胞因子中所含的活性单位（units）可以理解为将1mg/ml细胞因子原液稀释成ED50的稀释倍数注：ED50 (半数有效浓度): 可诱导50%最大反应的细胞因子浓度
1) ED50=1.0ng/ml, 则1.0 ng/ml相当于1 unit;
2) 1mg PDGF-BB中含有多少个units呢?
Units=1mg/1.0 ng/ml=106
3)若测定的ED50为0.5ng/ml对应比活性为：
1mg/0.5ng/mg=2X106
七、纯度测定
纯度：由以下方法测定纯度大于95.0%
（a）高效液相色谱（SEC-HPLC）；
（b）还原和非还原银染SDS-PAGE。
• SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构
• 强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂
变性凝胶电泳：
蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。
非变性凝胶电泳：
非变性凝胶里面没加变性剂。
非变性胶跑出来的蛋白能保持其活性一般用做功能试验，如EMSA。
由于没有变性剂的原因非变性胶电泳时除了与蛋白分子量有关也会受都电荷的影响，因此对蛋白等电点的确定和缓冲液的酸碱性有注意，有时需要倒转电泳时的正负极。
从跑的胶来看，变性胶会比较好看，带比较窄，非变性胶跑出来则比较粗糙。
1. 凝胶的配置中非变性凝胶不能加入SDS，而变性凝胶的有SDS。
2. 电泳载样缓冲液中非变性凝胶的不仅没有SDS，也没有巯基乙醇。
3. 在非变性凝胶中蛋白质的分离取决于它所带的电荷以及分子大小，不像SDS-PAGE电泳中蛋白质分离只与其分子量有关。
4. 非变性凝胶电泳中，酸性蛋白和碱性蛋白的分离是完全不同的，不像SDS-PAGE中所有蛋白都朝正极泳动。
非变性凝胶电泳中碱性蛋白通常是在微酸性环境下进行，蛋白带正电荷，需要将阴极和阳极倒置才可以电泳。
5. 因为是非变性凝胶电泳，所有的电泳时候电流不能太大，以免电泳时产生的热量太多导致蛋白变性，而且步骤都要在0-4度的条件下进行，这样才可以保持蛋白质的活性，也可以降低蛋白质的水解作用。
这点跟变性电泳也不一样。
八、分子量
还原SDS-PAGE测定
本法测得的分子量，除单链蛋白质外，均不是天然蛋白质的完整分子量，而是组成这些蛋白质的亚基或肽链的分子量。
本法对一些电荷异常，或构象异常，或带有大辅基的蛋白质不适用，如组蛋白F1和某些糖蛋白等。
对一些结构蛋白如胶原蛋白等也不适用。
准确度比较：点喷雾质谱法>还原的SDS-PAGE>非还原的SDS-PAGE>HPLC
此法测得的表观分子量由于翻译后修饰（磷酸化，糖基化），剪切，异构等原因，会比预期的分子量偏大。
如：p53蛋白，其表观分子量是53kDa（这也是该蛋白名字的由来），但是根据氨基酸序列计算得到的分子量却是43kDa。
九、N末端氨基酸序列分析
重组蛋白经N末端氨基酸序列分析；必要时应用SDS-PAGE, RP-HPLC和质谱（MS）检测其真实性。
十、内毒素对活性的影响
内毒素（Endotoxin），是革兰氏阴性菌细胞壁的产物。
当细菌死亡自溶或粘附在其它细胞时，表现毒性，内毒素的主要化学成分是脂多糖中的类脂A成分。
内毒素与细胞膜上的受体结合引起免疫反应，对细胞有较强的毒性作用。
我们的产品均采用多种方法有效去除内毒素,使用鲎试剂（Limulus Amebocyte,LAL）测定含量小于0.1ng/ug (1 EU/ug)。
十一、贮存及复溶
产品均为无菌冻干粉剂，调整PH和盐浓度经0.2um过滤后分装冻干。
请使用手动化霜冰箱，由于每次冻融都会造成蛋白的部分变性，所以要适量分装尽量避免反复冻融。
干粉状态在室温下存放3周，不影响活性；放于-18℃以下，可稳定保存至少一年。
复溶时依据说明书，大多数溶解在灭菌超纯水（18MΩ.cm）中，浓度不低于100μg/ml，以待进一步稀释至工作浓度。
蛋白质在高浓度下稳定，所以有些加入载体蛋白，但是可能会对实验造成影响。
我们的产品均不含carrier protein或其他添加物（如BSA、HAS、蔗糖等），而是以低盐的形式做冻干处理，微量的细胞因子在冻干过程中会沉积于管内，形成很薄或不可见的蛋白层。
所以使用前先离心20-30s，使附于管盖或管壁的蛋白集于管底，有些产品复溶需要加入醋酸，因为含PBS的冻干粉中性时容易吸附管壁，加入酸溶于液体中，表面活性剂也防止吸附。
复溶后的细胞因子，4℃可稳定储存 2周；长期保存请分装后存放于-20℃以下，可稳定保存至少三个月。
最好在-80℃保存。
分装时浓度要>100ng/ul，体积要>20ul。
十二、重组细胞因子的交叉活性
• 大多数人类细胞因子对小鼠细胞都有活性。
• 许多小鼠细胞因子对人类细胞也有活力表现，但是比相应人类细胞因子活力低。
• 一些人类的细胞因子如IL-7在小鼠细胞中表现出比小鼠细胞因子更高的比活力。
• 干扰素、GM-CSF、IL-3 和IL-4 有物种特异性，对于非人类细胞几乎没有活性。
• 成纤维细胞生长因子和神经营养因子是高度保守的，在其它的动物细胞中也能表现很好的活性。
十三、细胞因子的应用
• 免疫学实验
• 细胞培养实验
• 细胞治疗
• 细胞调亡的研究
• 干细胞培养与扩增分化（ips）
• 细胞因子的功能性分析
• 体外生化分析
• 作为抗原，应用于生产高质量抗体
• 抗体分析中作为阳性对照
• ELISA和其他分析方法中作为标准品使用
• 蛋白-蛋白相互作用。