叶盘法转化烟草的原理

2．材料与方法2.1实验材料植物材料：K326烟草种子药品：MS大量元素，MS微量元素，MS铁盐,吲哚乙酸（IAA），6-苄氨基腺嘌呤（6-BA），烟肌醇(B1B6),蔗糖，琼脂，头孢霉素（Cef），羧苄青霉素（Carb），卡那霉素（Kn）、庆大霉素、利福平等；MS培养基(1L):大量元素(20x)50ml、微量元素(100x)10ml、Fe2+(100x)10ml、蔗糖30g、琼脂8g，PH值约为6.0预培养基(1L)：大量元素(20x)50ml、微量元素(100x)10ml、Fe2+(100x)10ml、6-BA(1000x)2ml、B1B6(200x)5ml、甘氨酸(1000x)1ml、琼脂8g，PH值约为6.0。

高温灭菌后加IAA(0.2mg/L)1ml分化培养基(1L)：预培养基的基础上加入头孢霉素2ml，羧苄青霉素1ml，卡那霉素1ml.生根培养基(1L)：1/2MS、IAA 2mg/L、蔗糖30g/L、琼脂5.8g/L，pH=5.8 LB液体培养基(1L)：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCI 10gMS0培养基：为不加琼脂的只含大量元素MS培养基2.3实验方法2.3.1浸染菌液制备将含有目的基因的农杆菌在固体LB培养基上划板，28℃下暗培养两天。

挑取单菌落，接种于5ml含50mg.L-1卡那霉素、50mg.L-1链霉素及50mg.L-1利福平的液体LB培养基中，28℃下振荡培养过夜。

活化过夜的农杆菌，按1:50的比例，稀释到含50mg.L-1卡那霉素的新鲜液体LB培养基中，继续培养至OD600值约为0.5。

取培养物1ml，置于无菌离心管中，12000rpm离心1分钟，弃上清。

加入100ml的MS0培养基，混匀。

2.3.2烟草转化按叶圆盘法转化烟草。

将剪切好的烟草叶盘放置在预培养基上培养1-2天后，置于悬菌液中（MSO悬浮，可以稀释50—100倍）浸泡3-5分钟。

然后取出，用无菌滤纸吸去其表面的液体。

1 实验背景什么是“植物转基因技术”“转基因植物”？植物转基因技术：把从动物、植物或微生物中分离获得的目的基因，或者经过修饰的目的基因，通过各种方法转移重组到植物基因组内，使之稳定遗传并赋予植物新的遗传性状的方法。

转基因植物：通过植物转基因技术获得的、整合有外源基因的植物个体。

1 实验背景为什么要进行植物转基因？优势：◆农业：生产抗逆、高产、优质、抗病虫、除草剂、营养品质改良等优良性状的作物；遗传育种等。

◆制药、化工等：可作为生物反应器，生产药用蛋白和有用次生代谢物，或生产某些有机化合物等。

◆园艺：美化生活等，如蓝玫瑰等。

◆科学研究：生物学、遗传学等多领域基础研究等。

1 实验背景怎样将外源基因转入植物？间接转化法(载体介导)病毒介导法农杆菌介导法（双子叶/单子叶）种质系统介导法胚囊和子房注射法生殖细胞侵染法花粉管通道法直接转化法物理法化学法基因枪法(单子叶植物)显微注射法电击法超声波法PEG 法脂质体法1 实验背景各种转基因方法的区别是什么？（引自崔广荣，2003）1 实验背景针对不同植物，怎样选择转基因方法？目前转基因植株中，约80%以上通过“农杆菌介导转化法”获得。

植株特点首选方法备注对农杆菌敏感农杆菌介导法效率高，方法成熟，转基因植株遗传稳定。

原生质体培养容易直接转化法（如PEG 法）转化率高，可克服转基因植株嵌合体的难题。

多胚珠花粉管通道法提高转化率子房中有较大单胚珠植物(如核果类)显微注射法提高转化率转化难度大的植物基因枪法其它方法不可行时的备选放射性农杆菌发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes根瘤农杆菌Agrobacterium tumefaciens旋钩子农杆菌1 实验背景农杆菌为什么能够介导基因转入植物？土壤农杆菌革兰氏阴性菌RiTi 质粒(tumor inducing plasmid ）约150~200 kb向植物细胞传递外源基因Ti1 实验背景农杆菌为什么能够介导基因转入植物？Vir 区:毒性区，包含多个致病基因，能激活T-DNA 的加工、剪切、复制及转入植物细胞，并使农杆菌表现出毒性。

植物分解二手烟原理
植物分解二手烟的原理主要是通过吸收和转化空气中的有害物质来实现的。

一些植物具有特殊的生理结构和功能，可以帮助净化空气。

以下是一些植物可能用于分解二手烟的原理：
1. 气孔吸收：植物的叶片表面有气孔，这些气孔可以吸收空气中的有害气体和颗粒物。

二手烟中的一些化学物质，如尼古丁、焦油等，可以被植物的气孔吸收并在植物体内进行代谢和转化。

2. 光合作用：植物通过光合作用将二氧化碳和水转化为氧气和有机物质。

在这个过程中，植物可能会将二手烟中的一些有害物质作为代谢底物，将其转化为无害的物质。

3. 吸附作用：一些植物的表面或根系可以吸附空气中的有害物质，如灰尘、颗粒物和化学污染物。

这有助于减少二手烟中的有害成分在空气中的传播。

4. 空气过滤：植物的叶片和枝干可以起到一定的空气过滤作用，阻挡和捕获空气中的微小颗粒物，从而减少二手烟对周围环境的影响。

需要注意的是，植物对二手烟的分解和净化作用是有限的，不能完全依赖植物来解决二手烟问题。

此外，不同的植物对二手烟的分解能力也有所不同。

一些常见的被认为对空气净化有帮助的植物包括绿萝、常春藤、吊兰、芦荟等。

为了最大程度减少二手烟对健康的影响，最有效的方法是避免在室内吸烟，并保持良好的通风。

如果可能的话，最好选择没有人吸烟的环境，或者使用空气净化器等专业设备来净化空气。

同时，倡导健康的生活方式，包括戒烟和减少吸烟，对保护自己和他人的健康非常重要。

叶盘法转基因烟草技术实验目的：学习并了解叶盘法转基因烟草的技术流程。

二. 实验原理：土壤中的农杆菌是一种革兰氏阴性菌，能够感染植物的受伤部位。

农杆菌中有一种环形的Ti质粒，Ti质粒最重要的两个区域为T-DNA区和毒性区，T-DNA是Ti质粒上唯一能够整合到植物染色体上的序列，而毒性区上一系列则帮助T-DNA区整合到植物的染色体上。

土壤农杆菌转化植物的常用方法是叶盘法。

这种转基因方法十分简单，一般是将植物的叶片切成小圆片，用农杆菌感染后共培养2-4天，而后转移到加有选择压的分化培养基上分化出芽，在MS培养基上生根后，再生出完整的植株。

三. 试剂及设备1.试剂：MS培养基：配方见“植物的组织培养技术”实验指导Kan：卡那霉素Cb：羧苄青霉素NAA：萘乙酸6-BA：细胞分裂素T1培养基：MS培养基T2培养基：MS培养基+6-BA2.0mg/L+NAA0.5 mg/L+Kan100 mg/L+Cb500 mg/LT3培养基：MS培养基+ Kan100 mg/L+Cb500 mg/L（T2：生长培养基；T3：生根培养基）2.仪器：光照培养箱，恒温摇床，超净工作台，接种器械等四.实验步骤：1 农杆菌培养1）从平板上挑取含有目的基因的单菌落，接种到3 ml YEB 液体培养基中（Str 25 μg/ml、Rif 50 μg/ml、Kan 80 μg/ml）于恒温摇床上27℃，180 rpm 摇培过夜至OD 600 为0.6-0.8。

2）摇培过夜的菌液按1%-2%的比例，转入新配置的无抗生素的YEB 培养基中，在与上述相同的条件下培养6 h左右，OD600 为0.2-0.5 时即可用于转化。

或：将按上述方法培养的OD 600 为0.6-0.8 的菌液，转入无菌离心管中，于室温条件下，5000 rpm 离心10 min，去掉上清液，菌体用1/2 MS液体（pH 5.4-5.8）培养基重悬，稀释至OD600 为0.2 左右，用于转化。

叶盘转化法叶盘转化法是一种常用的植物组织培养技术，通过将植物的叶片切割成小块，再在适宜的培养基上进行培养和生长，最终实现新植株的繁殖和繁衍。

这种技术不仅可以用于繁殖新品种的植物，还可以用于检测植物的遗传稳定性和抗逆性等特性。

下面将详细介绍叶盘转化法的原理、操作步骤和应用。

一、原理叶盘转化法的原理是利用植物的细胞再分化和再生能力，通过切割叶片并在培养基上提供适宜的营养物质和激素，使叶片细胞再分化为新的植物组织。

培养基中的激素可以促进细胞的分裂和分化，从而形成新的芽或根系。

经过适当的培养和生长，这些新的组织最终能够发育成完整的植株。

二、操作步骤1. 材料准备：选择健康、无病虫害的植物叶片作为材料，将叶片洗净并消毒。

2. 培养基制备：根据需要培养的植物种类选择合适的培养基配方，并按照比例将各种营养物质和激素溶解在适量的水中，调节pH值后加入琼脂。

3. 叶片处理：将洗净的叶片切割成小块，每块大小保持一致，避免过大或过小影响培养结果。

4. 培养基接种：将处理好的叶片块放置在培养基上，注意均匀分布，避免叶片重叠。

5. 培养条件控制：将培养基培养瓶密封并置于适宜的光照和温度条件下，定期观察培养基的湿润程度，并根据需要添加适量的水分。

6. 生长观察和移栽：经过一段时间的培养和生长，观察叶片上是否出现新的芽或根系。

若有，则可将其移栽到新的培养基或土壤中进行进一步培养和生长。

三、应用叶盘转化法在植物繁殖和繁衍中具有重要的应用价值。

首先，它可以用于繁殖新品种的植物。

通过选择具有优良特性的母本植株，利用叶盘转化法可以快速繁殖出大量具有相同特性的新植株。

其次，叶盘转化法也可以用于检测植物的遗传稳定性和抗逆性等特性。

例如，可以通过将转基因植物的叶片进行转化培养，观察新植株是否仍然保持了转基因特性，从而评估转基因植物的遗传稳定性。

此外，叶盘转化法还可以应用于植物的细胞工程和基因工程研究中，例如通过转化叶片细胞来引入特定的基因，实现植物的基因改良和功能性研究。

准备菌液LB 300ml(加抗生素Kan,Rif)
1L MS, 分装300ml (SIM,无抗生素20个平板)，500ml(SIM,有抗生素，倒培养瓶)，200ml（液体，做悬浮液）
Kan,Rif / Basta,Rif
1.根癌农杆菌的活化
挑取单菌落，接种于含抗生素的LB 液体培养基（Rif 50μ g/ml和Kan 50-100μg/ml）中，28℃-30℃200rpm 振荡培养过夜。

2.农杆菌介导叶盘法转化植物
①农杆菌菌体处理
挑取农杆菌菌株接种于LB培养基中（含rif 50μg/ml和kan50μg/ml），200rpm，28℃培养24h，菌液OD600至1.0 左右，离心10min（3000rpm），沉淀菌体。

再用10ml左右的MS液体培养基悬浮，稀释菌体的OD600值为0.3-0.5。

②叶盘法转化转化植物程序
选取理想状态的外植体，在超净台上剪成小方块或者打成叶圆片（大小不限），在制备好的农杆菌菌液中浸染3-5min，置于无菌吸水纸吸干，平铺于SIM （MS+1mg/L6-BA+0.1mg/LNAA）培养基（无抗生素）上黑暗共培养2 天，2天后将外植体转移至含筛选因子的芽诱导培养基如SIM（MS+1mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+Basta 5mg/L+500μg/ml的carb素或500Cef）上进行筛选。

待有芽生成（3~4周）后，继续培养到苗高2~3厘米时，转入生根培养基RIM（MS+ kan50μg/ml+500μg/ml的羧卞青霉素或500Cef）上，进行根诱导生长。

Cb: 羧卞青霉素; Cef:头孢霉素。

第九章烟叶发酵的化学原理一名词解释1.烟草发酵：烟叶通过烘烤（或晾晒）和复烤后，在人工强化条件或自然条件下陈化一个过程，使烟叶内含物发生一系列化学或生物化学变化，减少原烟某些品质缺陷，使烟草香更加显露，吸食品质明显增强的一个卷烟加工极为重要的工艺环节。

2.人工发酵：在特定的人工强化温度和空气湿度的发酵室内，加速陈化烟叶，使其更符合吸食要求的烟叶发酵方式。

二填空题1.根据发酵条件和方法的不同，烟草发酵被分为自然发酵和人工发酵。

2.影响烟叶陈化的主要环境条件有温度、烟叶含水量和空气湿度、打包方式及光线。

3.发酵过程中干物质损耗主要表现为氧气的吸收和二氧化碳、水、氨、挥发性小分子物质的排出，最终导致干物质的减少。

4.影响干物质损耗的因素有烟叶等级、水分、烟包容量等。

5.烟草中发生的棕色化反应可分为有酶参与的棕色化反应和非酶棕色化反应。

6.棕色化反应机理复杂，影响因素较多，其中主要的影响因素有反应物的种类、反应温度、反应系含水量、反应时间、pH和压力等。

四问答题1.简述自然发酵和人工发酵的区别。

答：自然发酵是在库房室温条件下将烟叶贮存一段时间，在自然条件下陈化烟叶，使烟叶更符合吸食要求。

这种发酵方法被欧美和中国的云南普遍采用。

人工发酵是在特定的人工强化温度和空气湿度的发酵室内，加速陈化烟叶，使其更符合吸食要求的烟叶发酵方式。

2.为什么晒烟发酵过程中干物质损耗比烤烟大？答：晒烟烟叶在发酵过程中干物质的损耗比烤烟多，其原因主要是：一方面晒烟烟叶具有较高的原始水分；另一方面是在调制过程中，晒烟中的胶体物质未受到充分破坏，干制后烟叶仍具有较强的持水力。

此外，成熟度越差的烟叶，发酵时干物质损失越大。

3. 简述发酵后烟叶中水溶性有机酸增加的原因。

答：发酵后烟叶中水溶性有机酸增加的原因可以概括为以下四个方面：第一，部分氨基酸在酶促反应分解析出氨，使原来与氨结合的酸基以自由状态的酸存在。

第二，在烟叶发酵过程中，一部分有机酸矿物盐会发生组成形式上的变化。

烟叶发酵的原理和方法烟叶发酵是一种对烟叶进行特定处理的过程，通过控制温度、湿度和氧气供应等条件，促使烟叶内部的化学变化，使其获得特定的风味和香气。

烟叶经过发酵后，能够改善烟叶的吸气性、存储性和燃烧性能，从而提高烟叶的质量和市场竞争力。

烟叶发酵的原理主要涉及到两个过程，即微生物代谢和化学反应。

在发酵过程中，烟叶中的天然酶及周围环境中的微生物起着重要的作用。

其中，微生物代谢主要有两种类型，一种是革兰氏阳性菌群，如乳酸菌、假单胞菌等，它们通过利用烟叶中的可溶性养分进行代谢，产生乳酸、醋酸等有机酸，进而改变烟叶的pH值和营养状况。

另一种是酶解菌群，如枯草杆菌、嗜热菌等，它们能够分解烟叶中的多糖、蛋白质和脂肪等复杂物质，从而为微生物提供能量和生长所需的基本元素。

化学反应主要包括糖类的酵解、氨基酸的分解和物质代谢等过程。

烟叶中的糖类在发酵过程中，会被微生物分解为乳酸、酒精和二氧化碳等物质，从而改变烟叶的口感和香气。

氨基酸则会被微生物代谢为氨气、硫化氢等挥发性物质，这些物质对烟叶的味道和风味有着重要的影响。

此外，烟叶中的其他有机物质也会经过发酵过程发生结构的改变，形成独特的风味物质。

烟叶发酵的方法主要有人工发酵和自然发酵两种。

人工发酵是通过控制温度、湿度和氧气供应等条件，在特定的环境条件下进行发酵。

常用的人工发酵方法有堆积发酵、层叠发酵和箱式发酵等。

其中，堆积发酵是将烟叶堆放在通风良好的场地上，通过热量的堆积和微生物的自身代谢作用进行发酵。

层叠发酵是将烟叶层叠起来，通过压力和湿度的影响，使烟叶发生发酵。

箱式发酵则是将烟叶放在密封良好的容器中，通过控制温度、湿度和氧气供应等条件，使烟叶进行发酵。

自然发酵是将烟叶放在自然条件下进行发酵，不进行人为控制。

自然发酵的原理是通过烟叶内部和外部的微生物和酶的作用，使烟叶逐渐发生发酵。

自然发酵的时间一般较长，需要数个月到数年不等。

无论是人工发酵还是自然发酵，对发酵过程中的环境条件都需要进行控制。

本科生毕业设计（论文）（ 2015届）农业与食品科学学院题目：烟草遗传转化体系的建立学号：姓名：专业班级：2015 年 5 月18 日本科生毕业设计（论文）诚信承诺书我谨在此承诺：本人所写的毕业设计（论文）《烟草遗传转化体系的建立》均系本人独立完成，没有抄袭行为，凡涉及其他作者的观点和材料，均作了引用注释，如出现抄袭及侵犯他人知识产权的情况，后果由本人承担。

承诺人（签名）：年月日目录本科生毕业设计（论文）.............................................................................................. 封1 本科生毕业设计（论文）诚信承诺书...................................................................................... 封2 1 前言. (1)1.1 农杆菌介导法 (1)1.2 基因枪法 (2)1.3 PEG法 (2)1.4 显微注射法 (2)2 材料与方法 (3)2.1 试验材料 (3)2.1.1 植物材料 (3)2.1.2 菌株和质粒 (3)2.2 试验方法 (3)2.2.1 农杆菌的制备 (3)2.2.2 叶片表面消毒 (3)2.2.3 预培养-侵染-共培养 (4)2.2.4 特美汀对农杆菌的抑制作用 (4)2.2.5 芽分化-卡那霉素浓度的测定 (4)2.2.6 根分化 (5)2.2.7 炼苗-移栽 (5)2.2.8 转基因植株的分子鉴定 (5)3 结果与分析 (6)3.1 农杆菌菌液侵染时间对转化效率的影响 (6)3.2 共培养时间对转化率的影响 (7)3.3 特美汀对根瘤农杆菌的抑菌效果 (7)3.4 卡那霉素浓度对烟草叶片外植体出愈率的影响 (8)3.5 转基因植株的分子鉴定 (8)4 讨论 (9)参考文献 (9)致谢 (11)烟草遗传转化体系的建立农业与食品科学学院农学111 吴春盛指导教师：郑志富摘要：利用农杆菌介导的转化法获得转基因植物,这是研究目的基因功能的一种有效方法。

亚细胞定位之烟草转化方法烟草是常见的植物模型，被广泛应用于植物生物学研究中。

研究人员通常通过烟草转化方法，将外源基因导入烟草中，实现对基因的功能研究或产生转基因烟草植株。

烟草转化方法通常包括两个步骤：外源基因构建和烟草转化。

首先，需要构建一个携带外源基因的转化载体。

这个载体通常包含一个启动子、外源基因和终止子。

启动子可以驱动外源基因的转录，终止子可使转录终止。

外源基因可以是一个编码蛋白质的序列，也可以是一个编码RNA或其他功能分子的序列。

构建好转化载体后，接下来可以通过烟草转化方法将其导入烟草中。

烟草转化方法有多种，包括农杆菌介导转化、基因枪法等。

其中，农杆菌介导转化是最常用的方法之一、农杆菌介导转化是利用农杆菌的特性，将外源基因导入烟草细胞中。

首先，需要将转化载体与农杆菌进行共转化，形成转化菌。

接着，将转化菌与烟草叶片进行共同培养，利用农杆菌T-DNA的转移机制，将外源基因导入烟草细胞中。

经过一段时间的培养，将转化的烟草细胞分离培养，最终获得转基因烟草植株。

利用亚细胞定位技术，可以进一步研究转基因烟草植株中外源基因的定位。

常用的方法包括荧光蛋白标记技术和抗体标记技术。

荧光蛋白标记技术可以通过将外源基因与荧光蛋白基因进行融合，使转基因植株产生荧光蛋白标记，从而观察外源基因在细胞内的定位。

抗体标记技术则是将外源基因编码的蛋白质与特异性抗体结合，通过免疫荧光染色等方法观察外源基因的定位。

通过亚细胞定位技术，可以了解转基因烟草植株中外源基因在不同亚细胞位置的分布。

这对于研究外源基因的功能以及其与其他生物分子的相互作用方式非常重要。

此外，亚细胞定位研究也可以为转基因烟草的功能性研究提供重要线索。

总结起来，烟草转化方法是利用烟草作为植物模型，将外源基因导入烟草中的方法。

通过亚细胞定位技术，可以了解外源基因在转基因烟草植株中的定位，进一步研究外源基因的功能和相互作用方式。

烟草转化方法为研究转基因植物提供了重要的工具和方法。

农杆菌介导的烟草转化农杆菌介导的烟草转基因技术一、实验目的了解转基因的基本原理及操作方法。

二、基本原理根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种能诱发植物产生肿瘤的细菌，根癌农杆菌中含有诱导植物产生肿瘤的质粒（Tumor inducing plasmid），简称为Ti质粒。

野生型农杆菌的Ti 质粒，含有两个与致瘤有关的区域：一个是T-DNA区（transferred DNA region），含致瘤基因；另一个是毒性区（Virulence region），在T-DNA的切割、转移与整合过程中起作用。

农杆菌可将T-DNA插入到植物基因组中，并且可以通过减数分裂稳定地遗传给后代。

我们将目的基因插入到经过改在的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。

三、材料1、植物材料：烟草无菌苗2、农杆菌与载体：EHA105；PBI121四、方法步骤1、试剂的配制（1）LB固体培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂8g/L。

（2）液体MS/MT培养基PH：5.8-6.0 （3）烟草共培养培养基：固体MS培养基（4）烟草筛选培养基：MS +（2.0mg/L）6-BA + （0.3mg/L）NAA + （30g/L）蔗糖+ （400mg/L）头孢霉素+ （50mg/L）卡那霉素+ （7.5g/L）琼脂PH：5.8-6.0（5）烟草生根培养基：固体MS培养基2、农杆菌侵染菌液的制备方法：（1）超净工作台紫外灯灭菌15min，接种环酒精灯灼烧灭菌备用（2）铺皿：LB（50mg/L卡那霉素+25mg/L利福平）（3）划线：用接种环沾取预转化的农杆菌菌液于铺好的培养基划“之”字或者“#”字（4）封皿，做标记（5）28℃恒温培养1d-2d（6）用无菌刀刮取适量菌体于50mL液体MS培养基中，28℃，180r/min震荡培养1-2h至均匀悬浮液，紫外分光光度计测量菌液的OD600值，用液体MS调整浓度至OD600值约为0.8-1.0为宜，备用。

4.1. 农杆菌转化烟草所需培养基和试剂（1）YEB液体培养基：蛋白胨5.0 g/L，酵母提取物1.0 g/L，蔗糖 5.0 g/L，MgSO4 0.5g/L，调pH至7.2~7.5，高压灭菌。

（固体培养基每升加15g琼脂，）（2）链霉素（Str）、卡那霉素（Km）：贮存液浓度为50 mg/mL，溶于双蒸水中，0.22 μm滤膜过滤后分装，–20℃保存。

（3）羧苄青霉素（Cb）和头孢霉素（Cef）：贮存液浓度为500 mg/mL，溶于双蒸水中，0.22 μm滤膜过滤，–20℃保存。

（4）6-氨基嘌呤（6-BA）和ａ-萘乙酸（NAA）：各取20mg，先用少量1 mol/L NaOH溶解，再加蒸馏水至1 mL，最好现用现配。

（5）烟草转化所用的培养基共培养培养基：MS+ 6-BA 2 mg/L+ NAA 0.2 mg/L分化培养基：MS+ 6-BA 2 mg/L+ NAA 0.2 mg/L+ Cb 500mg/L+Kan 100 mg/L 生根培养基：1/2MS + Kan 100 mg/L+ Cef 250mg/L（1/2MS是指MS大量元素减半）4.3.1 农杆菌LBA4404感受态的制备（1）取100 μL农杆菌LBA4404，接种于5 mL LB液体培养基（含50 mg/L Str）中，28℃、200 rpm暗培养过夜；（2）取2 mL培养的菌液于50 mL YEB液体培养基（含50 mg/L Str）中继续培养，直至OD600值为0.4左右；（3）将培养好的菌液在冰块中冰浴30 min，然后4℃，5,000 rpm离心5 min，弃去上清液；（4）加入10 mL预冷的20 mmol/L CaCl2悬浮菌体，尽量打散菌体，使菌体充分悬浮，有助于制备较高效率的感受态；（5）4℃，5,000 rpm离心5 min，弃去上清液，尽量去净液体；（6）用1 mL预冷的20 mmol/L CaCl2悬浮菌体，分装成100 μL/管，在液氮中冷冻后放于–70℃保存。

LBA4404烟草叶盘法转化（copyright by Haoli Ma）1、菌的准备（Day 1）：将含有已构建好质粒的LBA4404菌液在LB+Str+Kana平板上划线，28°C 36h，挑单克隆至3-5 ml YM培养基中250 rpm 28°C 36h，按照1：100-1：50的比例扩大培养50ml 3-5h至OD=0.5，然后将菌液离心，用MS0液体培养基(50ml)悬浮菌体至OD=0.2-0.4用于侵染；2、外植体的预培养（Day 2）：选取第一片完全展开的健康叶片（4-5周），用手术刀切成0.5cm 见方大小（切掉叶缘避开主脉，20片/皿），叶片上表面朝下在MS1固体培养基上25°C 暗培养2-3d(以外植体膨大至两到三倍为准)；3、侵染(Day 4)：将预培养过的烟草叶片加入到菌液中，涡旋振荡确保叶片切口被菌液浸没，静止5-10min，用无菌滤纸吸去附着的菌液；4、共培养(Day 4)：将侵染过的叶片上表面朝下置于MS1固体培养基上28°C 暗培养3d（在共培养固体培养基上垫一层灭菌滤纸）；5、选择培养(Day 7)：将叶片上表面朝上转移至含有抗生素（Cp+HygB）的MS1固体培养基上25°C 16h light/d ark 2 weeks，subculture/2 weeks；6、生根培养(Day 7+14*x)：当叶缘长出芽并可以分离时（1cm以上），将芽切下转移至含有抗生素（Cp+HygB）的MS2固体培养基中，两周后长出根，打开育苗盒的盖子练苗一周后转入温室培养。

MS培养基（MS0）：MSMS分化培养基（MS1）（共培养培养基，co-culture media）：MS + 0.5mg/L IAA + 2.0 mg/L BA + 3﹪sucrose + 0.6-0.8﹪Phytagel（固体加液体不加）PH=5.8MS生根培养基(MS2)：MS + 0.5 mg/L IAA + 3﹪sucrose + 0.6-0.8﹪Phytagel （固体加液体不加）PH=5.8Str (50 mg/L) Kana (50 mg/L) Cp(cephalothin，头孢霉素，500 mg/L) Hyg B(hygromycin B，潮霉素B，50 mg/L)注1：步骤5中，选择培养筛选周期视情况而定。