查尔酮异构酶分子生物学研究进展

查尔酮类物质的合成及生物活性研究The Synthesis and Bioactive Research of Chalcones巫晓琴马林*广州中山大学化学与化学工程学院化学系摘要本实验主要研究黄酮类物质中的查尔酮，通过合成及UV、CD测试，研究其对α-葡萄糖苷酶和蛋白质非酶糖基化的抑制效果及抑制机理，并总结出初步的构效关系。

关键词查尔酮合成α-葡萄糖苷酶非酶糖基化1、前言研究发现以染料木素、槲皮素等为代表的黄酮类化合物是高效的α-葡萄糖苷酶非竞争性抑制剂及非酶糖基化抑制剂。

我国中医药资源丰富，从传统中药复方中研制α-葡萄糖苷酶抑制剂及非酶糖基化抑制剂，必然成为开发防治糖尿病等疾病药物的热点。

查尔酮为黄酮类化合物的一种，其化学结构为1,3-二苯基丙烯酮,以它为母体的天然化合物存在于甘草、红花等植物中,这些天然查尔酮多含酚羟基，如甘草中的异甘草素、红花中的红花苷元等。

这些含羟基的查尔酮表现为多种药理作用，如抗肿瘤作用[1]、抗炎作用[2]、镇痛作用[3]、抗溃疡作用[4]、抗病毒作用[5]、抗菌作用[6]、抗真菌作用[7]、抗疟疾作用[8]等。

而目前有关其对α-葡萄糖苷酶及非酶糖基化的抑制作用的相关研究开展得较少，鲜有报道。

2、实验2.1查尔酮系列化合物的合成2.1.1原理本实验使用含不同取代基的苯乙酮和苯甲醛缩合制备了一系列查尔酮。

R6' R4'OHOR3R4OR4'R6'R3R4OH--H2OCharlton 1 2 3 4 R3H H OH OH R4N(Me>2OH OCH3OCH3 R4’H H H OH R6’H H H OH合成Charlton 4用到的原料2，4-二羟基苯乙酮为自己合成，合成反应式如下：OHOH+CH 3COOHOHOH COCH 3无水ZnCl 2+H 2O2.1.2仪器与试剂恒温加热采用巩义市英峪予华仪器厂制造的DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌器； 熔点在北京泰克仪器有限公司制造的XT-4双目显微熔点测定仪上测定； IR 在德国BRUKER 公司Tensor37型傅立叶变换红外光谱仪上测定； MS 在岛津LCMS-2018A 液相色谱质谱联用仪上测定；核磁在美国 VARIAN 公司生产的Mercury －Plus 300核磁共振波谱仪上测定。

异黄酮合成代谢调控关键酶CHS、CHI的特性与研究前景第26卷第5期2007年1O月大豆科学SOYBEANSCIENCEV oI_26No.5Oct.2007异黄酮合成代谢调控关键酶CHS,CHI的特性与研究前景李莉,孙欣.,马君兰,赵越(1.东北农业大学,哈尔滨150030;2.黑龙江省农业科学院大豆研究所,哈尔滨150086)摘要查尔酮合酶(Chalconesynthase,CHS)与查尔酮异构酶(Chalconeisomerase,CHI)是异黄酮合成途径中的两个关键酶,它们在植物中的表达效率直接影响到异黄酮的产量.本文综述了植物CHS,CHI的功能,特性,基因结构,进化以及基因表达调控等方面研究的新进展,并对CHS,CHI研究的应用前景进行了展望,在此基础上提出了从根本上提高异黄酮产量的可行途径以及一些亟代解决的问题.关键词异黄酮;查尔酮合酶(CHS);查尔酮异构酶(CHI)中图分类号Q814文献标识码A文章编号1000—9841(2007)05--0762--04 PROGRESS0NKEYENZYMESCHS,CHIOFISOFLAV0NESSYNTHESIZELILi,SUNXin",MAJun—lan,ZHAOYue(1.NortheastAgriculturalUniversity,Harbin150030:2.SoybeanResearchInstituteofHeilongjiangAcademyofAgriculturalSciences,Harbin150086)AbstractChalconesynthase(CHS)andChalconeisomerase(CHI)arethekeyenzymesinisof ia—vonessynthesize,andvariationoftheirexpressionmightaffectthecontentofisoflavones.Th efunction,character,genestructure,geneevolutionandexpressioncontrolofCHSandCH1we resummarizedinthispaper.TheapplicationforegroundofCHSandCH1werealsoprospected, andthemeanstoincreaseisoflavoneswereadvised.KeywordsIsoflavones;Chalconesynthase(CHS);Chalconeisomerase(CHI)异黄酮(Isoflavone)是植物生长过程中形成的次生代谢产物,是生物黄酮中的一种,也是一种植物雌激素,主要是指以3一苯并吡喃酮为母核的化合物,动物体内不能合成.它主要包括大豆黄素(Daidzein),染料木素(Genistein),6一甲氧大豆素(Glycitein)三种游离型甙元和它们的九种葡糖苷.收稿日期:基金项目:作者简介:通讯作者:2006—12—30黑龙江省教育厅资助课题(10551024)李莉(1977一),女,硕士研究生,研究方向植物生理生化.赵越,E—mail;yuezhao一**************;Tel1393613,1116大量的实验表明:异黄酮在植物体内可作为保护性物质,保护植物正常生长,抵制病虫侵害;在动物体内能降低胆固醇,预防癌症,预防骨质疏松,促进繁殖,泌乳和生长等,显示了异黄酮可以作为动物生长的调节剂和促进剂,使其成为动物营养学的研究热点之一[.然而,在自然界中异黄酮的资源十分有限,只局5期李莉等:异黄酮合成代谢调控关键酶CHS,CHI的特性与研究前景限于豆科的蝶形花亚科等极少数植物中,如大豆,墨西哥小白豆,苜蓿和绿豆等植物中,其中异黄酮含量最高的只有苜蓿和大豆(故称为大豆异黄酮),在含量最高的大豆中所含的异黄酮也仅为0.1～0.5.因此研究异黄酮合成的关键酶基因的表达规律,不但可以在分子生物学领域找到提高异黄酮相对含量的方法,而且在深入利用异黄酮资源方面具有极大的应用价值.异黄酮的生物合成途径是研究最早且较深入的次生代谢途径之一,大量研究已经大体揭示了异黄酮生物合成途径(图1):对香豆酸辅I~A(4?Coumaryl-CoA)丙二酰辅酶A(Malonyl—CoA) HS)查尔~j(Chalcone)l查尔酬异构酶(CHI)'类黄flleJ(Flavones)图1植物体内异黄酮合成代谢的一般途径Fig.1Thegeneralpathwayofisoflavone synthesisandmetabolisminplant从图上可知:异黄酮合成途径是植物类黄酮代谢途径的一个分支,部分参与异黄酮合成的酶与参与其它类黄酮类物质(如花色素苷元等)合成的酶相互交叉.其中特别值得提出的是CHS和CHI,作为异黄酮合成途径中的两个关键酶,其表达量的改变或表达功能的丧失及酶的失活都将直接影响到黄酮类代谢产物的量j,所以越来越多的人把目光集中在这两种酶的研究上.1CHS,CHI研究的新进展1.1查尔酮合酶(或苯基苯乙烯酮合酶.Chaleone synthase,CHS)1.1.1CHS蛋白的基本功能CHS蛋白为类黄酮合成途径中的第一个特异性酶,它不需要辅助因子,在特定物种中,CHS蛋白和一个依赖NADPH的还原酶协同作用,催化该途径的第1步反应,即1分子4一香豆酰一CoA与3分子丙二酰一CoA缩合形成查尔酮(又称苯基苯乙烯酮,Chalcone).查尔酮为其它类黄酮(如花色素苷元,异黄烷酮,黄酮醇等)合成提供基本骨架,所以说CHS蛋白催化的反应是整个类黄酮合成途径的重要限速步骤.1.1.2CHS蛋白的基本特性对CHS蛋白的X射线衍射,表明该酶是一个同源二聚体蛋白,有2个功能互相独立的亚基,每个亚基的分子量为4O～45 kDaEs].不同植物问,CHS蛋白氨基酸同源性一般在85以上,表明不同植物的CHS蛋白具有高度的保守性,而这种一级结构的高度的保守性,也说明了不同植物的CHS蛋白功能的高度一致性.比如,被子植物和松柏科植物间CHS蛋白的氨基酸序列同源性高达9O.1.1.3CHS基因的结构CHS基因是世界上第一例从经紫外线辐射的欧芹(Petroselinumhor—tense)悬浮培养细胞中分离的类黄酮生物合成基因],目前EMBL数据库中有来自于19个科8O多个CHS基因编码区全序列.不同植物之问,CHS基因的编码区比较保守,长约1.2kb,不同科问DNA的同源性达6O以上. CHS的基因结构也非常保守,据报道除金鱼草的一个CHS基因AMCHS含有两个内含子外],其余的都只有1个内含子,而且这个内含子的位置在已发现的序列中均相同,即位于第65位(以欧洲赤松的PSCHS为标准)的半胱氨酸密码子内第1和2 位碱基之间,其长度从几十碱基对到几千碱基对不等.外显子I编码约57～64个氨基酸,外显子2编码约340个氨基酸,对CHS基因外显子2氨基酸序列进行排序,结果表明,CHS基因的外显子2比较保守,没有大的插入,缺失突变,科间氨基酸同源性一般在7O以上【6j.不同植物之间,CHS基因拷贝数目差异很大],而且功能上存在明显差异.如,金鱼草和拟南芥的基因组中都只含单个的CHS基因拷贝,菜豆有6～8个,水生三叶草至少有9个,矮牵牛中有12 个,非洲菊中有3个.同一植物体内虽然也存在CHS多个编码基因,但在不同品系中的表达活性不同.如:Pinusstrobus中的CHS1和CHS2基因编码的蛋白质有88的同源性,但CHS1催化查尔酮合成,CHS2催化二酮基CoA与甲基丙二酰CoA 的缩合反应;矮牵牛中至少有8个CHS基因,有的品系有一个基因表达活性高,有的品系有2个基因表达活性较高.1.1.4CHS基因的进化CHS基因是一个多基因家族,依据类黄酮物质存在与否,推测该基因最早出现在藓类,在CHS基因的进化中基因重复一分歧大豆科学5期(duplication—divergence)是经常发生的事件.攀枝花苏铁的两个克隆CPAI和CPAS分布在相距很远的分支中,说明CHS基因的重复在裸子植物就已经发生,依据已有数据,欧芹,拟南芥和金鱼草中似乎都只存在一个拷贝,而在其他物种中均有多个, 其中豆科的拷贝数最多,但在分支图上,豆科的27 个序列却只形成一组,即这些序列重复发生在豆科分化之后.以上分析说明CHS基因在不同的科中发生的重复和丢失的情况不同,因此,很难确定直系同源的CHS基因成员,从而很难用此基因进行被子植物科间系统发育的研究.1.1.5CHS基因的表达调控CHS基因的表达能被光照[,生理钟【1..,低温"],BA和GA5],脯氨酸及碳水化合物,P蛋白[1等所调节.CHS基因的表达也是与其它基因相互作用的结果,如FIN2,FJN5基因的突变导致CHS表达受损伤口,而L兀厂Tl和ICXI基因的突变则导致CHS基因表达水平的提高口引.1.2查尔酮异构酶(或查尔酮一黄烷酮异构酶, Chalconeisomerase,CHI)1.2.1CHI蛋白的基本功能CHI蛋白是第一个被认识的与类黄酮合成相关的酶,它催化分子内环化反应,通过选择性地连接一个在结构上有益于闭环的离子化的查耳酮,使双环的查耳酮变为有生物学活性的三环的(S)一黄烷酮,即形成第1个类黄酮产物.CHI催化活性具有pH依赖性,在pH7.5时,其催化活性为90,而在pH6.0时,其催化活性则为50L1.这一步反应也可以在没有CHI蛋白的条件下在植物体中缓慢自发进行.1.2.2CHI蛋白的基本特性CHI蛋白以单体的形式普遍存在于大多数植物中,分子量因植物组织而异,约24～29kDaL1.通过比较发现,不同植物CHI蛋白的氨基酸序列同源性在50以上,存在明显差异,但这一差异集中在靠近N端与C端的部分氨基酸残基上,这说明在整个进化过程中,CHI蛋白的进化是趋于保守的.CHI蛋白的1.85A分辨率晶体结构显示,它具有一个奇怪的口一三明治折叠,这种三维结构的特异性可能与其催化活性的立体化学特异性有关,活性位点裂口的拓扑学效应限制了环化反应的立体特异性L1.CHI基因序列家族及其蛋白的这种三维折叠结构在植物中具有唯一性,已被建议作为植物特有的基因标记【1.1.2.3CHI基因的结构CHI基因在多种植物中被克隆(已克隆的CHI基因信息可在NCBI的主页上获得),具有较高的同源性,约499/6～809/6[3].植物中的CHI基因家族主要分为两大类[1:TypeI类CHI基因编码的酶蛋白只能将查尔酮异构化为(2S)一黄烷酮;TypelI类CHI基因编码的酶蛋白除了具有TypeI类的功能外,还能将6,_脱氧查尔酮异构化为(2S)一5一脱氧黄烷酮,它主要存在于豆科植物中.现在把在真菌和细菌中发现的,与植物CHI基因直向同源(orthologous)的CHI基因[1,归为TypeIII.在研究矮牵牛的CHI时发现,它含有两个CHJ基因,CHJA(AF233637)和CHJB(Xl4590). CHIA全长726bp,编码241个氨基酸L2叩;CHIB全长2l70bp,编码220个氨基酸.CHIA基因编码区上游存在两个启动子PAl和PA2,PAl和PA2在不同矮牵牛花组织中具有不同的驱动活性.PAl启动子在花冠组织中驱动CHIA表达,而PA2启动子仅在花药发育后期和花粉粒组织中启动CHJA ¨.CHIB只有一个启动子,仅仅在花药发育早期(未成熟的花粉组织)驱动CRIB基因表达.此外, CHIA和CRIB基因启动子区域有37bp的高度保守的DNA序列.1.2.4CHI基因的表达调控研究发现,CHI酶蛋白的积累与消失受光调控和紫外辐射诱导,并与CHS蛋白的积累存在协同性L2...另外,CHI也受P 蛋白的影响口引.实验表明,这种协同积累效应是因为CHI基因和CHS基因mRNA协同表达的结果....2研究前景大豆起源于中国,我国大豆的种质资源十分丰富.近几年,我国的科技界对于大豆蛋白,大豆磷脂,大豆低聚糖等成分的研究已逐渐深入,与国际上相关的研究与交流也比较多,但对于大豆异黄酮这一国际新热点的研究,却远远落后于欧,美,日本等国.它的研究的深入开展及成果的推广应用,将对我国相关方面的研究有极大的推动作用,并可以带来巨大的社会与经济效益L2引.改良栽培环境,贮藏条件,加工工艺等,这些方法确实在某些程度上提高了大豆异黄酮的含量,但不是从根本上提高其产量的方法.随着细胞生物学和分子生物学的不断发展,越来越多的研究者把工作重点转移到以为基础的生物技术上来,以期望在5期李莉等:异黄酮合成代谢调控关键酶CHS,CHI的特性与研究前景765 提高异黄酮类次生代谢物的产量的同时降低成本,主要表现在其代谢关键酶的分子克隆及基因工程方面L2,这也已经成为生命科学的一个新生长点.进一步了解对CHS,CHI特异性基因的结构特点,克隆,测序,作用机制,表达部位和时空表达模式的研究,将利于进一步研究它们的基因表达调控机理,同时也为更好的改造这些基因,进而改变它们的表达活性,富集特定目的次生代谢产物——异黄酮提供更多的基础资料.若能同时增强多个基因的协同表达则是提高异黄酮产量的捷径.人们在研究中发现,cHs基因和cH基因的表达在很多方面确实具有协同性,如它们同时受转录因子P蛋白的影响,转录因子P蛋白就充当了"分子开关"的作用,随着分子生物学的不断发展,在各国科学研究工作者的共同努力下,这些问题终将会得到解决,也将为异黄酮类次生代谢产物的研究开拓新的途径.参考文献[1][2][3][4][5][6][7][8]谷利伟,谷文英,过世东.新型生长调节剂——异黄酮类植物雌激素[J].饲料添加剂,2000,21(12):26—28. ShelaghRMuir,GeoffJCollins,SusanRobinson,eta1.Ovet expressionofpetuniachalconeisomeraseintomatoresultsin fruitcontainingincreasedlevelsofflavonols[J].NatureBio—technology,2001,19:470—474.KarinSpringob,JunichiroNakajima,ManfiYamazaki,eta1. Recentadvancesinthebiosynthesisandaccumulationofan—thocyanins[J].NaturalProductReport,2003,(20):288—303.KreuzalerF,RaggH,FautzE,eta1.Uv—inductionofchalcone synthasemRNAincellsuspensionculturesofPct—roselinum hotense[J].ProceedingsNationalAcademyofScience,USA, 1983,8O:2591—2593.SommerH,SaedlerH.Structureofthechalconesynthase geneofAntirrhinummajus[J].MolecularandGeneralGe—netics,1986,202:429—434.王金玲,瞿礼嘉,陈军,等.CHS基因外显子2的进化规律及用于植物分子系统学研究的可行性[J].科学通报,2000,45 (9):942—950.DurbinML,McCaigB,CleggMT.Molecularevolutionofthe chalconesynthasenmhigenefamilyinthemorninggloryge—nome[J].PlantMolecularBiology,2000,42:79—92. SchroderJ,RaiberS,BergerT,eta1.Plantpolyketidesyn—thase:achalconesynthase-typeenzymewhichperformsacon～densationreactionwithmethylmalonyl—CoAinthebiosynthe—sisofC—methylatedchalconcs[J].Biochemistry,1998,37: 8417—8d25.[9]ArthurJM.Radiationandanthocyaninpigmentsin:Biological EffectsofRadiation[M].DugganBMed.NewY ork:McGraw HiIl,1936:1109—1118.[10][11][12][13][14][15][16][17][18][19][20][21][22][23]ThainSC,MurtasG,LynnJR,eta1.Thecircadianclockthat controlsgeneexpressioninArabidopsisistissuespecific[J]. PlantPhysiology,2002,130(1):102—110.LeyvaA,JarilloJA,SalinasJ,eta1.Lowtemperatureinduces theaccumulationofPhenylalanineAmmonia—LyaseandChal- coneSynthasemRNAsofArabidopsisthalianainalight—de—pendentmanner[J].PlantPhysiology,1995,108:39—46. KanekoM,ItohH,InukaiY.Wheredogibberellinbiosynthe—sisandgibberellinsignalingoccurinriceplants[J].ThePlant Journal,2003,35:104.GrotewoldE,PetersonT.Isolationandcharacterizationofamaizegeneencodingehaleoneflavononeisomerase[J].Molee—ularandGeneralGenetics,1994,242(1):1—8.ChoDS,HongSH,NamHG,SohMS.FIN5positivelyreg—ulatesfar—redlightresponsesinArabidopsisthaliana[J]. PlantCellPhysiology,2003,44(6):565—572.BiezaK,LoisR.AnArabidopsismutanttoleranttolethalul—traviolet—Blevelsshowsconstitutivelyelevatedaccumulation offlavonoidsandotherphenolies[J].PlantPhysiology,2001, 26(3):1105.JezJM,NoelJP.Reactionmechanismofchalconeisomerase pHdependence,diffusioncontrol,andproductbindingdiffer—ences[J].JournalofBiologicalChemstry,2002,277(2):1361—1369.NorimotoShimada,ToshioAoki,ShuseiSato,eta1.Acluster ofgenesencodesthetwotypesofehaleoneisomeraseinvolved inthebiosynthesisofgeneralfalavonoidsandlegume-speeif—ics—deoxy(iso)FlavonoidsinLotusjaponicas[J].PlantPhysi—ology,2003,131(3):941—951.JezJM,BowmanME,DixonRA.Structureandmechanism oftheevolutionarilyuniqueplantenzymeehalconeisomerase [J].NaturalStructuralBiology,2000,7(9):786—791. GensheimerM,MushegianA.Chalconeisomerasefamilyand fold:nolongeruniquetoplants[J].ProteinScience,2004,13 (2):540—544.TunenAJV,KoesRE,MolJNM,eta1.Cloningofthetwo chalconeflavanoneisomerasegenesfromPetuniahybrid:co—ordinate,light—regulatedanddifferentialexpressionoffla—vonoidgenes[J].EMBOJ,1988,7:1257—1263. TunenAJV,HartmanSA,MolNM,eta1.Regulationofehaleoneisomerase(CHI)geneexpressioninpetuniahydria: theuseofalternativepromotersincorolla,anthersandpollen [J].PlantMolecularBiology,1989,12:539—551.杨茂区,陈伟,冯磊,等.大豆异黄酮的生理功能研究进展[J]. 大豆科学,2006,3:320—324.BurbulisIE.Winkel—ShirleyB.Interactionsamongenzymes oftheArabidopsisflavonoidbiosyntheticpathway[J].Pro—ceedingsNatinonalAcademyofScience,1999,96(22):29—34.。

植物查尔酮合成酶分子生物学研究进展河南农业科学植物查尔酮合成酶分子生物学研究进展王燕,许锋,程水源(1,长江大学园艺园林学院,湖北荆州434025;2,黄冈师范学院生命科学与工程学院,湖北黄冈438000)摘要:查尔酮合成酶(chalconesynthase,CHS,EC2.3.1.74),是植物类黄酮物质合成途径中的第一个酶,也是植物次生代谢途径中的关键酶之一,对植物具有非常重要的生理意义.为此,综述了查尔酮合成酶基因结构,基因进化,表达调控机理以及诱导因子,概述了查尔酮合成酶基因工程在植物生理方面的研究,并进一步对查尔酮合成酶的分子生物学研究做了展望.关键词:植物;查尔酮合成酶;分子生物学;基因工程中图分类号:943.2文献标识码:A文章编号:1004—3268(2007)08—0005—05查尔酮合成酶(chalconesynthase,CHS,EC2.3.1.74)是植物类黄酮物质合成途径中的第一个酶.它催化该途径的第一步,即3个分子的丙二酰一CoA和1个分子的对香豆酰一CoA结合形成第一个具有C15架的黄酮类化合物一查尔酮.该产物进一步衍生转化构成了各类黄酮化合物l1].此中间物的异构化和功能基团的进一步取代都能导致黄酮,异黄酮和花色素苷的合成.这些化合物为自然界提供了颜色,并参与了植物的多种生理过程,包括防紫外线辐射,抗病,生长素运输,花粉的育性等,.现已对许多植物查尔酮合成酶基因进行了分离克隆和测序,很多学者通过转基因方法成功地将外源查尔酮合成酶基因导入植物,提高了转基因植物查尔酮合成酶活性,并且这些植物都表现出了目的生理性状.而且查尔酮合成酶在植物中是普遍存在的,它的分子进化存在多种途径,也有许多查尔酮合.成酶基因的分子进化途径的研究报道.在此基础上对国内外植物查尔酮合成酶分子生物学及基因工程的研究进展进行了综述.1查尔酮合成酶基因结构自从第一个荷兰芹的chs序列在l983年发表以来,到目前为止,已从多种双子叶,单子叶和裸子植物中克隆了s基因,例如,玉米,高粱,兰花,矮牵牛引,拟南芥,金鱼草l.],豆类～.和松树|l等.所有报道的chs基因都属于多基因家族,chs基因在结构上非常保守,除金鱼草的1个chs基因AMCHS含有2个内含子外[1o2.其余的chs 均只包含1个内含子和2个外显子.而且这个内含子的位置在已发现的序列中均相同,即位于第65位(以欧洲赤松PinusSylvestris的PSCHS为标准)的半胱氨酸密码子内第一和第二位碱基之间,其长度从几十碱基对到几千碱基对不等.外显子l较短,只编码约60个氨基酸,且长度变异较大;外显子2编码约340个氨基酸,在进化中较保守,易于排序,提供的进化信息较多|1.王金玲等的研究也表明,可用CHS基因外显子2代表全基因进行研究口. Koes等研究矮牵牛的CHS基因家族包括8～l0个成员,在植物正常发育中仅CHs—A和CHs—J在花中表达,前者转录mRNA占CHS总mRNA的90[8l2查尔酮合成酶基因进化CHS在植物中是普遍存在的,现认为最早在陆生植物中出现,例如,轮藻纲和苔藓植物『2.有资料显示,CHS是从脂肪酸代谢途径中的一个酶进化而来.越来越多的证据显示,在进化的过程中,CHS的功能有过多次转变,例如,不断重复地转变成芪合成酶(stilbenesynthase,STS).Tropf等收稿日期:2007—03—14基金项目:湖北省自然科学基金(2002AB094);湖北省青年杰出人才基金(2003AB014);教育部新世纪优秀人才计划(NCET一04—0746);湖北省教育厅重大科技项目(Z200627002)作者简介:王燕(1967一),女,江苏南通人,吾0教授,主要从事银杏次生代谢分子生物学方面的研究.通讯作者:程水源(1965一).男,湖北天门人,教授,博士生导师,主要从事银杏次生代谢方面的研究.5?2007年第8期通过CHS和STS的进化指出,在进化的历史中,STS曾经几次从CHS独立地进化出来.Lanz等指出,CHS在植物的不同类群中是很保守的,已有数据表明,CHS基因是一个较大的基因家族,其编码区比较保守,长约1.2kb,科之间的氨基酸同源性在7O～90[243.Ursula等首次尝试用CHS基因编码区的DNA序列来研究物种的进化关系引,当时他们只分析了7个种8个序列;王金玲等于2000年共分析了19个科的83个序列_1川.基于最筒约法对所研究的CHS基因外显子2部分DNA序列构建的系统进行自展分析的结果表明:各科序列在分支图上的分布情况不同,对于大部分分科,同一科的序列都形成一组,只有少数科的序列分布在相距很远的分支中,在CHS基因的进化中,经常发生基因重复一分歧(duplication—divergence). 攀枝花苏铁的2个克隆CPA1和CPA5分布在相距很远的分支中,说明CHS基因的重复在裸子植物就已经发生.杨俊波等的研究表明l2:山茶属CHS基因家族在进化过程中已分化为A,B,C3个家族,包括A1,A2,A3,B1,B2,C等6类不同的基因成员.其中只有A2类成员为全部被研究的5种植物所共有,而其他类成员只在部分被研究的植物中发现.所有这些CHS成员具有很高的同源性,在核苷酸水平上同一亚家族内基本上高于9O,不同亚家族间也在78%以上.从推测的氨基酸组成看,山茶属内CHS基因的功能一旦发生了分化,各类成员的碱基替代率会有较大差异.进一步分析认为,该属CHS基因的分化直到近期还在活跃地进行.Ferrerd等也指出不同种的进化式样有一定的差别,这种不同的进化式样可能是物种形成后受不同环境因素影响而形成的.近几年来的研究结果表明,CHS只是植物聚酮化合物合成酶家族中的一个成员.通过功能和序列鉴定这个家族的其他成员包括:STS,ACS,2PS,这些蛋白与CHS的序列同源性在65～75之间. Durbin等指出,CHS非常适合于基因复制的研究和基因家族起源的调查引.但是,目前还没有从假定的早期陆生植物中或者其可能的祖先植物中分离得到CHS及其相关的基因,关于这些植物中CHS 相关蛋白合成的次生代谢产物也没有研究.3CHS基因表达的调控研究3.1CHS表达的调控机理CHS是类黄酮生物合成过程中第一个关键酶,6CHS基因的表达受多种内外因素的调控.将CHS基因的启动子片段与GU5报告基因连接,导入植物细胞,通过转基因,原生质体瞬时表达,定点专一突变等手段对CHS基因的启动子进行研究,在CHS 基因启动子区找到了一些作用元件.正是这些元件以及他们与转录因子之间的相互作用,决定了CHS 基因的表达方式受发育和内外因素的复杂调控【2. 与查尔酮基因表达相关的顺式作用元件与反式作用因子已陆续被发现川,如ACE元件(ACGele—ment)『3l,.,H区(H—box)_33],富含AT元件(A T —richelement)_34I.,沉默子(Silencer)[.,P区(BoxP)[37J,工区和Ⅱ区(BoxI和BoxⅡ)_3.3.2CHS表达的诱导因子查尔酮合成酶往往受不同的发育调控和组织特异性调控,对不同外界刺激的敏感程度也不同. Senebier在18世纪末最早发现类黄酮的生物合成受光的调控,在一些植物中,花色素苷只有在光照下才会产生.Arthur也认为,刺激花色素苷合成最有效的光是蓝光/UV—A和UV—B.CHS的表达产生mRNA受到蓝光,紫外光的调节.在香菜细胞培养中,CHS表达产生最大量mRNA同时需要蓝光和紫外光.在自芥和香菜中,暗生长的幼苗CHS表达产生mRNA受光敏色素调节,而成熟叶片中, UV—B和uV—A/蓝光受体介导CHS表达产生mRNA.拟南芥中,紫外光和蓝光控制幼苗CHS表达产生mRNA和成熟叶组织的CHS表达.光敏色素对幼苗的CHS表达起作用[3.除了受光诱导外,CHS的表达还受病原微生物侵染和机械损伤等各种外界因子所诱导c4¨.4CHS基因工程与植物生理代谢4.1CHS转基因在植物花色的影响方面研究截至目前,大多数花卉新品种都是通过传统育种方法来获得的[4.而传统的方法存在着很多的局限性.遗传工程技术的发展给观赏植物产业的发展开辟了一条新的途径,在大多数植物种类中,类黄酮化合物是最重要的花色素.类黄酮生物合成基因的克隆,为遗传工程手段改变花色奠定了基础.目前,遗传工程技术可以从两个方面来改变花的颜色. 第一:抑制类黄酮生物合成基因的活性,导致中间产物的积累和花色的改变;第二,引入新基因来补充某些品种缺乏合成某些颜色的能力【l4.抑制类黄酮生物合成基因的活性有2种方法:一是通过反义RNA技术将目的基因的反义链连接河南农业科学在启动子后面,并转化植物,使目的基因的表达受到抑制;二是通过向植物中引入额外数量的目的基因拷贝,以共抑制技术方式,使目的基因的表达受到抑制[4.CHS基因的反义抑制和共抑制技术已经在牵牛,天竺葵,菊花和玫瑰中取得了成功].用遗传工程技术改变花色的另一条途径是通过转基因技术.例如,牵牛中的二氢黄酮醇4～还原酶不能把二氢黄酮醇(dihydrokaempfero1)转化为合成花葵素糖苷的中间产物,用传统的方法很难培育出橘红色的牵牛花.Meyer等利用遗传工程技术,将玉米的dfr基因转化进入开白花的牵牛中,使该DFR基因在牵牛中表达,产生的dIr酶能使二氢黄酮醇转化为相应的中间产物,进一步合成花葵素糖苷,培育出了橘红色的牵牛花[4.4.2CHS基因工程在植物育性方面的研究类黄酮与植物的育性有密切的关系.它在花粉中主要的合成部位是绒毡层,然后运输到子囊腔并最后进入花粉粒的外壁,成为组成外壁的一个重要的成分.因此,类黄酮在花粉粒的形成中起着非常重要的作用.研究认为,chs—a转基因植物雄性不育现象的产生可能是由于chs在花药中的转录.邵莉等人将正向chs—a基因转入矮牵牛中,在成功地改变了花的颜色的同时还发现了转基因植物也出现了雄性不育的现象.在玉米中,人们早就发现由于CHS突变(C2, Whp)而产生的不育的白色花粉粒.与此同时,水稻中类CHS基因的异常表达也可能导致花粉粒败育l_4.张毅等研究证明了在水稻花药中特异表达的类查尔酮合成酶基因D5mRNA的积累在四分体时期达到高峰并持续到小孢子时期,而这一时期与外壁的形成密切相关,而且有报道表明,拟南芥的雄性不育突变体msl2即为花粉外壁形成的缺陷型.4.3CHS基因工程在植物防御反应中的研究对于chs在植物防御反应中的调控方式的研究正在两个方向上进行:一是观察植物受到病原微生物侵染后的各种生理变化;另一个是研究与CHS表达相关的调控因子及其基因的调控方式.在病原微生物与植物相互作用的过程中,各种激发因子和抑制因子大都存在于细胞之外,而CHS 及其他与真菌有关的基因的表达均发生在细胞内, 细胞外的信号如何传递到细胞内,是一个引人注目的问题.目前已确证与CHS表达有关的信号传递过程是磷酸肌醇(PI)途径.不少研究结果显示.植物在遭受病原微生物侵染后,CHS活性显着增强,chs活跃转录,这些结果表明,由CHS调控的苯丙烷代谢反应很可能是植物抵抗病原物侵染的重要防卫反应之一[5.齐放军等用水稻抗白叶枯病近等基因系材料及转基因系材料,研究了水稻白叶枯病菌互作中,水稻防卫基因chs的转录特征[5.Northern检测结果显示,在与白叶枯病菌非亲和性互作中,水稻chs基因的转录均不受到诱导或只是受到很微蜀弓的诱导. 表明由chs基因调控的苯丙烷核心反应的启动和产物的合成,有助于增强水稻对白叶桔病菌的抗性.试验结果显示:互作中水稻chs基因是否受到白叶枯病菌的诱导,不仅与水稻中抗病基因有关,而且还与抗病基因的种类有关.表明水稻chs基因在互作中是否受到诱导转录,取决于其水稻功能性抗病基因产物对白叶枯病菌的专化性识别[5.从植物受到病原微生物侵染开始,到chS被诱导表达一系列调控过程至今还缺乏一个完整的认识.相信随着chs这一模式基因在植物防御机制中的作用研究的不断深入,人类不但将进一步认清植物基因调控的机理,而且可以通过利用它们的调控途径来改变某些基因的表达效应,从而为改良作物品种,提高作物抗病能力开辟一条崭新的途径.5展望迄今,有关学者至少对1o余种植物查尔酮合成酶基因进行了转化研究,如烟草,核桃,芸香,水稻,玫瑰,百合,矮牵牛,黄瓜,玉米等,尤其是在观赏植物花色的转基因研究方面最为深入.在未来农业中,开展CHS基因的克隆,结构特点,表达部位和时空表达模式的研究.以便有目的的用之于转化植物,使之在转基因植物中大量,持久地表达,提高目的次生代谢产物的含量,使植物查尔酮合成酶转基因应用进入产业化具有重要意义.参考文献:[1]程水源,颐曼如,束怀瑞.银杏叶黄酮研究进展[J].林业科学,2000,36(6):110一l15.[2]KoesRE,FrancescaQ,JosephNM.Theflavonoid biosyntheticpathwayinplants:functionandevolution 口].Bioessays,l994,16:123—132.[3]MartinCR.Structure,function,andregulationofthe chalconesynthase[C]//.InternationReviewofCytolo gy,l993,147:233—284.[4]ReimoldU,KroegerM,KreuzalerF,eta1.Coding72007年第8期E5J[6]E7]E8][9][io3[11][12][13][14][15]and3noncodingnucleotide thasemessengerRNAandsequenceoftheenzyme[J].18O6.sequenceofchalconesyn—assignmentofaminoacidEMBOJ,1983,2:1801一FrankenP,NiesbachKU.WeydemannU,eta1.The duplicatedchalconesynthasegenesC2andWhp(white pollen)ofZeamaysareindependentlyregulated;evi—dencefortranslationalcontrolofWhpexpressionby theanthocyaninintensifyinggene[J].EMBOJ,1991,10:2605—2612.LoC,CoolbaughRC.NicholsonRI.Molecular characterizationandinsilicoexpressionanalysisof chalconesynthasegenefamilyinsorghumbicolor[J]. PhysiolMolPlantPathol,2002,61:179—188. LiewCF,GohCJ,LohCS,eta1.Cloningandchar—acterizationoffull——lengthcDNAclonesencodingchal—conesynthasefromtheorchidBromheadiafinlaysoni—ana[J].PlantPhysiolBiochem.1998,9:647—655. HohonTA,BruglleraF,TanakaY.Cloningandex—pressionofehalconesynthasefrompetuniahybrida[J]. PlantJ,1993,4:1003—1010.SaslowskyDE,DanaCD,WinkelSB.Anallelicse—riesforthechalconesynthaselocusinArabidopsis[J]. Gene,2000,225:127—138.SommerH,SaedlerH.Structureofthechalcone synthasegeneofAntirrhinummajus[J].MolGen Genet,1986,202:429—434.AkadaS,KungS,DubeSK.Nueleotidesequenceof asoybeanchalconesynthasegenewithapossiblerole inultraviolet--Bsensitivity,gmcbs6[J].PlantPhysi～ol,1993,102:699—702.ArioliT,HowlesPA,WeinmanJJ,eta1.Trifoli- umsubterraneumchalconesynthaseisencodedbya multigenefamily[J].Gene,1994,138:79—86. MckhammHI,HirschAM.Isolationofchalcone synthaseandchalconeisomerasecDNAfromalfalfa (MedicagosativaL.):highesttranscriptlevelsoc～curinyoungrootsandroottips[J2.PlantMolBiol, 1994,24:767—777.SchroderJ,RaiberS,BergerT,eta1.Plant polyketidesynthases:achalconesynthase-typeen～zymewhichperformsacondensationreactionwith methylmalonyl—CoAinthebiosynthesisofC—meth～ylatedchalcones[J].Biochemistry,1998,23:8417—8425.FliegmannJ,SchroderG,SchanzS,eta1.Molecularanalysisofchalconeanddihydropinosylvinsynthase fromScotspine(pinussylvestris),anddifferential regulationoftheseandrelatedenzymeactivitiesin stressedplants[J].PlantMolBiol,1992,3:489—5O3.8?[16][17][18][19][2O][21][22][23][24][25][26][27][283Y angJ,HuangJ,GuH,eta1.Duplicationanda—daptiveevolutionofthechalconesynthasegenesof Dendranthema(Asteraceae)[J].MolBiolEvol, 2002,19:1752—1759.王金玲,瞿礼嘉,陈军,等.cHS基因外显子2的进化规律及其用于植物分子系统学研究的可行性[J].科学通报,2000,45(9):942—950.KoesRE,SpeltceG,V anderE.Clonigandmolecu—larcharacterizationofthechalconesynthasemulti—genefamilyofRetuniohybrida[J].Gene,1989,81:245—157.StaffordHA.Flavonoidevolution:anenzymicap—proaeh[J].PlantPhysiol,1991,96:680—685. KubitzkiK.Phenylpropanoidmetabolisminrelation tolandplantoriginanddiversification[J].Plant Physiol,1987,131:17—24.MarkhamKR.Distributionofflavonoidsinthelower plantsanditsevolutionarysignificance.intheFla—vonoids(JBHarborne,ed)[M].ChapmanandHall, London.1988:427—468.MarkhamKR.Bryophyteflavonoids,theirstruc—tures,distribution,andevolutionarysignificance IN]∥.BrophytesTheirChemistryandChemical Taxonomy(H.D.ZinsmeisterandR.Mues,eds.) OxfordClarendonPress,1990:143—161. TropfS,KarcherB,SchroderG,etaZ.Reaction mechanismsofhomodimericplantpolyketidesyn—thase(stilbenceandchalconesynthase).asingleac—tivesiteforthecondensingreactionissufficientfor synthesisofstilbenes,chalconee,and6～de—oxychalcones[J].JBiolChem,1995,270:7922—7928.LanzT,TropfS,MarnerFJ,eta1.Theroleofcys—teinesinpolyketidesynthasesitedirectetedmutagen—esisofresveratrolandchalconesynthase,twoen—zymesindifferentplant—specificpathways[J].JBiol Chem,1991,266:9971—9976.UrsulaNK,BarzenEB.Chalconesynthasegenein plants:atooltostudyevolutionaryrelationships[J].JMolEvol,1987,26:213—225.Y angJB,TianX,LiDZ,eta1.Molecularcomposi—tionandevolutionofthechalconesynthase(CHS) genefamilyinfivespeciesofcamellia(Theaceae)[J]. ActaBotanicaSinica,2003,45(6):659～666.FerrerJI,JezJM,BowmanME,eta1.Structure ofchalconesynthaseandthemolecularbasisofplant polyketidebiosynthesis[J].Nature,1999,6(8):775—840.DurbinML,McCaigB,CleggMT.Molecularevo—lutionofchaleonesynthasemultigenefamilyinthe morningglorygenome[J2.PlantMolBiol,2000,42:河南农业科学79—92.r29]AkiraNakatsuka,Y okoI,MasumiY.Spatialand temporalexpressionofchalconesynthaseanddi—hydroflavonol4～reductasegenesintheasiatichy—bridlily[J].PlantScience,2003,165(4):759—767.[3O]廖靖军,安成才,吴思,等.查尔酮合成酶基因在植物防御反应中的调控作用[J].北京大学,2000,36 (4):569—571.r3门WeisshaarB,ArmstrongGA,BlockA.Lightinduc—ibleandconstituivelyexpressedDNAbindingproteins recognizingaplantpromoterelementwithfunctional relevanceinlightresponsiveness[J].EMBOJ,1991,10(7):1777—1786.r32]AustinM,NoelJ.Thechalconesythasesuperfamily oftype,polyketidesynthases[J].NatProdRep,2003,20:79—110.[33]YuLM,LambCJ,DixonRA.Purificationand biochemcalcharacterizationofproteinswhichbindto theHboxciselementimplicatedintranscriptionalac—tivationofplantdefensegenes[J].PlantJ,1993,3(6):805—810.[34]KibaA,ToyodaK,IchinoseY.Specificinhibitionof cellwallboundATPasebyfungalsuppressiorfrom mycosphaerellapiodes[J].PlantCellPhysiology, 1995,36:809—817.r35]LawtonMA,DeanSM,DronM,eta1.Silencerre—gionofachalconesynthasepromotercontainsmulti—piebindingsitesforfactor,SBF1,closelyrelatedtoGT[J].PlantMolBiol,1991,16(2):235—249.[36]DaCE,KleinL,SchmelzerE.BPF1,apathogenin—ducedDNAbindingproteininvolvedintheplantde—fenseresponse[J].PlantJ,1993,4:125—135.[37]Y oshiyukiI,HikaruS,KazuhiroT,eta1.Contrary operationsofBox-Ielementofpeaphenylalanineam—monia-lyasegene1promoterfororgan-specificex'' pression[J].PlantPhysiologyandBiochemistry,2001,39(5):355—362.[38]Y amadaT,SriprasertsakP,KatoH.Functionalas—nalysiosofthepromotersofphenylalanineammonial—yasegenesinpeaEJ].PlantCellPhysiol,1994,35:93——104.[39]王曼,王小菁.蓝光,紫外光的受体及其对CHS表达诱导的研究[J].植物学通报,2002,19(3):265一[4O][42][43][44][45][46][473[48][49][5O][51][52]271.DanglJI,HahlborockK,SchellJ.Regulationand StructureofChalconeSynthaseGenes[M]//.NewY ork:AcademicPress,1989:155—173.V anderM,StuitjeAR,MolNJ.Regulationof GeneralPhenylpropanoidandFlavonoidGeneEx—pression[M].CRCPress,BocaRaton,1993:125—155.赵昶灵,郭传明,陈俊愉.植物花色呈现的生物化学, 分子生物学机制及其基因工程改良[J].西北植物学报,2003,23(6):1024—1035.邵莉,李毅,杨美珠,等.查尔酮合酶基因对转基因植物花色和育性的影响[J].植物,1996,38(7): 517—524.V anderM,StamME,TunenA,eta1.Antisense inhibitionofflavonoidbiosynthesisinpetuniaanthers resultsinmalesterility[J].PlantCell,1992,4:253262.ElidaG,FadiC,HamdanF.Cloningofthechapero—nint—complexpolypeptide1genefromSchistosoma mansoniandstudiesofitsexpressionlevels[J].Para—sitolRes,2000,86:253—258.赵云鹏,陈发棣,郭维明.观赏植物花色基因工程研究进展[J].植物通报,2003,20(】):51—58. MeyerP,HeidmannI,ForkmannG.Anewpetunia flowercolourgeneratedbytransformationofamutant withamaizegeneEJ].Nature,1987,330:677～688.郑宏红,瞿礼嘉,刘美华.花药特异性表达的类查尔酮合酶基因D5与水稻花粉发育相关[J].科学通报, 2000,45(11):1132—1138.张毅,瞿礼嘉,刘美华,等.对一个在水稻雄蕊中大量表达的cNDA的结构和表达分析[J].科学通报, 1998,43(4):607～611.TaylarPE,GloverJA,LavithisM.Geneticcontrol ofmalefertilityinArabidopsisthaliana:structuralan—alysesofpostmeioticdevelopmentmutants[J].Plan—ta,1998,2O5:492—505.WannerIA,IiGQ,ThePhenylalanineammonia—lyasegenefamilyinArabidoposisthaliana[J].Plant MolBio,1995,27:328—335.齐放军,高学文,王金生,等.携带不同抗白叶枯病基因的水稻防卫基因pal和chs的转录特征[J].农业生物技术,2000,8(4):337—340.9'。

査尔酮合成酶基因及其分子进化研究进展
李苗;李国旗
【期刊名称】《中国农学通报》
【年(卷),期】2015(31)18
【摘要】查尔酮合成酶基因在植物苯丙氨酸代谢途径中的作用至关重要,直接或间接影响着植物代谢产物合成、抗性调节、花色形成等生理生化过程。

为了进一步加强对查尔酮合成酶基因功能的发掘与利用,本研究综合归纳了査尔酮合成酶基因及其克隆、遗传多样性和分子进化等方面研究进展,得出查尔酮合成酶基因克隆采用的主要方法,进而指出査尔酮合成酶基因分异进化研究的未来方向,同时为特色基因资源开发方面研究提供技术资料检索帮助和研究方法参考。

【总页数】5页(P116-120)
【关键词】查尔酮合成酶基因;克隆;遗传多样性;分子进化
【作者】李苗;李国旗
【作者单位】宁夏农业生物技术重点实验室;宁夏大学西北退化生态系统恢复与重建教育部重点实验室
【正文语种】中文
【中图分类】Q7
【相关文献】
1.植物查尔酮合成酶分子生物学研究进展 [J], 王燕;许锋;程水源
2.嫁接陆地棉查尔酮合成酶与查尔酮异构基因的克隆及r表达分析 [J], 宋成攀;夏
松波;王孝刚;张教海;秦鸿德;张友昌;冯常辉;别墅
3.洋葱查尔酮合成酶基因的分子克隆和表达分析 [J], 霍凤梅;缪军;张一卉;杨妍妍;刘冰江;霍雨猛;杨建平;吴雄
4.植物查尔酮合成酶超基因家族的分子进化 [J], 包颖;郭昌锋;陈少华;刘梅
5.盐芥査尔酮合成酶基因的生物信息学预测与分析 [J], 高亚平;李玮;刘艳
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。