实验十八 血清胆红素测定(改良J-G法).pptx

改良J—G法检测新生儿溶血病患者血清胆红素的问题探讨作者：叶章发张超桂远望来源：《中国实用医药》2014年第30期【摘要】目的分析改良J-G法检测新生儿溶血病患者血清胆红素存在的问题。

方法使用改良J-G法分别检测患儿血清、稀释血清以及使用亚硝酸盐法检测血清胆红素项目，进行统计、分析。

结果改良J-G法检测总胆红素、间接胆红素，血清与稀释血清检测结果之间差异有统计学意义（P0.05）。

结论使用改良J-G法检测新生儿溶血病患者血清胆红素时，必要时应稀释血清进行检测，以免影响检测结果的可靠性。

【关键词】改良J-G法；新生儿溶血病；血清胆红素在临床实验中发现，使用改良J-G法检测新生儿溶血病患者血清胆红素，当其黄疸较为严重时，实验检测结果存在一定问题，现报告如下。

1 材料与方法1. 1 标本来源本院排除其他严重疾病、且黄疸较为严重的新生儿溶血病患者血液标本51例，其中男28例，女23例。

1. 2 仪器 OLYMPUS AU-2700全自动生化分析仪。

1. 3 试剂①国内某品牌改良J-G法总胆红素检测试剂。

试剂1：盐酸0.7 mol/L ，对氨基苯磺酸20 mmol/L ，柠檬酸0.7 mol/L，咖啡因 0.18 mol/L。

试剂2：亚硝酸钠溶液20mmol/L。

②国内某品牌改良J-G法直接胆红素检测试剂。

试剂1：盐酸0.3 mol/L ，对氨基苯磺酸30 mmol/L 。

试剂2：亚硝酸钠溶液10 mmol/L。

③兰森生物技术有限公司公司提供总胆红素、直接胆红素亚硝酸盐法检测试剂。

RANDOX（Human-Sera分析用人血清基质）定值冻干质量控制血清。

1. 4 方法由儿科护理人员使用真空采血管，采集患儿股静脉血液3.00～5.00 ml，及时送检验科处理备用。

首先，准确吸取离心处理后的血清0.25 ml，使用生理盐水倍比稀释，稀释至根据肉眼观察颜色，判断其大致在正常人血清总胆红素参考值上限水平；然后，分别吸取血清0.25 ml、各管稀释血清0.25 ml，放置各自检测试管中，上机进行改良J-G法胆红素项目实验检测；同时，血清标本进行亚硝酸盐法胆红素项目检测。

实验十六血清胆红素测定（改良J-G法）【目的】1.熟悉血清胆红素测定的原理和方法；２.掌握胆红素测定的正常参考范围及临床意义。

【原理】血清中结合胆红素可直接与重氮试剂反应，生成偶氮胆红素；未结合胆红素需要在加速剂（咖啡因-苯甲酸钠）作用下，分子内氢键破坏后，才能与重氮试剂反应生成偶氮胆红素。

醋酸钠缓冲液保持反应的pH，反应完成后加入终止试剂（叠氮钠）以破坏重氮试剂，最后加入碱性酒石酸钠溶液，使颜色不稳定的紫红色偶氮胆红素在咖啡因存在下转化为稳定的蓝色偶氮胆红素，在600nm波长比色，从标准曲线查找总胆红素和结合胆红素含量。

【器材】试管及试管架、吸管、恒温水浴箱、分光光度计、秒表。

【试剂】1．咖啡因试剂称取无水水醋酸钠，苯甲酸钠，乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2），溶于约500ml去离子水中，再加入咖啡因，搅拌使溶解（加入咖啡因后不能加热溶解），用去离子水补足至1L，混匀。

过滤后置棕色瓶，室温保存。

2．碱性酒石酸钠溶液称取氢氧化钠，酒石酸钠（Na2C4H4O6·2H2O），用去离子水溶解并补足至1L，混匀。

置塑料瓶中，室温保存。

3．5g/L亚硝酸钠溶液称取亚硝酸钠，用去离子水溶解并定容至100ml，混匀，置棕色瓶，冰箱保存，稳定期不少于2周。

若发现溶液呈淡黄色，应废弃重配。

4．5g/L 对氨基苯磺酸溶液称取对氨基苯磺酸（NH2C6H4SO3H·H2O），溶于800ml去离子水中，加入浓盐酸15ml，用去离子水补足至1L。

5．重氮试剂临用前取上述亚硝酸钠溶液和对氨基苯磺酸溶液20ml，混匀即成。

6．L叠氮钠溶液7．胆红素标准液（1）目前一般用未结合胆红素配制标准液，此标准品须用含白蛋白的溶剂配制，常用人混合血清，对此血清的要求如下：收集无溶血、无黄疸、无脂浊的新鲜血清，混合，必要时可用过滤器过滤。

取过滤后的血清1ml，加入新鲜L NaCl溶液24ml，混合。

在414nm波长，1cm光径，以L NaCl溶液调零点，其吸光度应小于；在460nm的吸光度应小于。

血清立接胆红素测定1.实验原理在PH3左右、有表面活性剂和间接反应胆红素抑制剂的条件下，样品中的直接胆红素容易被矶酸盐氧化成胆绿素，而间接胆红素不能。

在450nm （胆红素吸收峰）处监测反应。

矶酸盐氧化前后吸光度的下降与样品中胆红素的浓度成正比。

由此可计算出样品中直接胆红素浓度。

2.标本：2.1病人准备：无特殊要求。

最好用禁食的标本以减少乳糜血的干扰。

2.2类型：血清、肝素或EDTA血浆，应避光保存。

3.标本存放：15〜25℃保存可稳定2天；2〜8℃保存可稳定7天；-20℃保存可稳定3个月，如冰冻保存，不可反复冻融！。

4.标本运输：常温条件下避光保存运输。

5.标本拒收标准：标本溶血、细菌污染、脂血、非避光保存运输的标本。

6.实验材料6.1试剂：上海欧泰克直接胆红素试剂盒6.L 1试剂组成酒石酸盐缓冲液100mmol/L表面活化剂I 适量磷酸盐缓冲液10 mmol/L矶酸钠盐 4 mmol/L6.1.2试剂准备：试剂为即用式。

6.1.3试剂稳定性与贮存：试剂避光保存于2〜8C,若无污染，可稳定至失效期。

试剂有效期为18个月。

试剂2必需避光保存。

试剂不可冰冻。

6.1.4变质指示：当试剂有浊度时，表明有细菌污染，不能继续使用。

6.1.5注意事项：此试剂为体外诊断用。

警告！腐蚀剂！不要入口。

避免和眼睛，皮肤或衣服接触。

如果接触到，立即用大量的水冲洗受损害的部位15分钟。

接触到眼睛或吞服，立即寻找医疗保护。

6.2校准品：使用罗氏复合校准品对自动分析仪进行校准，参见生化检验校准品和质控品.SOP文件6. 3质控品：参见生化检验校准品和质控品.SOP文件7.仪器：日立7060生化分析仪8.操作步骤8.1项目基本参数：参见生化检验日立7060生化分析仪项目测定参数.SOP文件8.2仪器操作步骤：参见生化检验日立7060生化分析仪操作规程.SOP文件检验结果的判断与分析10.质量控制：在每一批标本中都应把非定值血清水平I与H 质控做为未知标本进行分析，以2s为质控警告限，3s为失控限，绘制质控图，判断是否在控。

尿胆红素（改良J－G法定量测定）工艺简介一、检测目的胆红素是血红蛋白的代谢产物，来源有三：（1）人体内胆红素的3/4源于循环血液中衰老红细胞崩解后所释放出的血红蛋白辅基血红素降解而产生；（2）骨髓中的红细胞原位溶血所释放的血红蛋白；（3）含卟啉的血色蛋白如肌红蛋白和其他非血红蛋白性的正铁血红素分解后产生极少量胆红素。

血红蛋白被单核-巨噬细胞系统破坏后分解成胆绿素，再还原成胆红素进入血与血浆白蛋白结合而被运转，称为非结合胆红素或间接胆红素；间接胆红素难溶于水，不能由肾脏排出而进入肝脏，受肝内葡萄糖醛酸基转移酶的作用与葡萄糖醛酸结合，形成葡萄糖醛酸酯，称为结合胆红素或直接胆红素。

结合胆红素由肝随胆汁排至肠道，被还原成粪胆原（尿胆原）再经氧化变成粪胆素（尿胆素），大部分随粪便排出体外；小部分经门脉吸收回肝，复经肝肠循环，其中一小部分进入血循环，经肾排出，称尿胆原。

当肝细胞损伤，胆管阻塞，红细胞破坏增加或寿命缩短时，胆红素代谢发生异常，临床上即出现黄疸。

二、反应原理尿液与醋酸钠-咖啡因-苯甲酸钠试剂混合后，加入偶氮苯磺酸，生成紫色的偶氮胆红素。

其中醋酸缓冲液用以保持偶氮反应的PH，咖啡因、苯甲酸钠加速偶氮苯磺酸的偶联反应。

抗坏血酸破坏剩余偶氮试剂，终止偶氮反应。

最后加入强碱性酒石酸溶液使紫色偶氮胆红素变成蓝色偶氮胆红素，在600nm波长下比色,测定蓝色偶氮胆红素的生成量。

三、试剂1．咖啡因-苯甲酸钠试剂无水醋酸钠41g，苯甲酸钠37.5g，EDTANa20.5g，溶于约500mL的蒸馏水中，再加入咖啡因25g，搅拌至完全溶解(不可加热)，然后加蒸馏水稀释至1000mL，混匀，过滤后放置棕色试剂瓶中。

作用：非结合胆红素须有加速剂咖啡因-苯甲酸钠-醋酸钠作用，其分子内氢键破坏后才能与重氮试剂反应，也产生偶氮胆红素。

醋酸缓冲液用以保持偶氮反应的PH。

2. 5g/L亚硝酸钠溶液：亚硝酸钠 5.0g，加蒸馏水溶解并稀释至1000mL，若发现溶液呈淡黄色时，应丢弃重配。

血清胆红素测定病人准备：病人准备除了特殊检验有专门规定外，一般要求病人处于安静状态，生活饮食处于日常状态，目前已公认过度空腹、饮食、饮酒、吸烟及姿势体位等可影响某些检验结果，现分述如下：1. 运动：肌肉活动的影响可分短暂性的和持续性的两类，短暂性影响为血浆脂肪酸含量，可因运动而暂时减少，而后渐渐增加而恢复。

丙氨酸可因运动暂时增加达180%，受到持续性影响主要是一些与肌肉有关的酶，如肌酸激酶、乳酸脱氢酶等，据称一场60min的手球训练赛后11h，肌酸激酶活性比赛前仍增加达125%，长期坚持体育锻炼还会提高性激素水平，因此采血前宜安静，不作过大的活动。

2. 食物：进餐后血浆脂肪、蛋白质、糖类有所增加。

有人研究于高脂餐后2-4h采血，多数人碱性磷酸酶含量增高，主要来自肠源性同工酶，且与血型有密切关系，O型或B型兼为Le+分泌型者增高更明显。

一般认为高蛋白质餐使血浆尿素增加，但不影响肌酐含量，高比例不饱和脂肪酸食物，可减低胆固醇含量；食物如含有动物血液，可引起粪隐血假阳性。

故在做相应检验时，应对食物有一定的控制。

3. 过度空腹：一般血液生化检验要求病人晚餐后禁食，至次日晨采血，空腹约8-12h。

但过度空腹，某些检验会有异常结果。

例如血清胆红素可因空腹48h而增加240%；血糖可因空腹过长而减少为低血糖；血脂空腹过度，甘油三酯、游离脂肪酸反有增加，故空腹并非越长越好。

4. 饮酒：饮酒后使血浆乳酸、尿酸盐增加。

长期饮酒者高密度脂蛋白胆固醇偏高，平均红细胞体积增加，甚至可以将这项作为嗜酒者的筛选检查。

5. 吸烟：瘾烟者血液一氧化碳血红蛋白含量可达8%，而不吸烟者含量在1%以下。

血液学方面亦有变化，白细胞数增加，嗜酸粒细胞减少，中性粒细胞及单核细胞增多，血红蛋白偏高，平均红细胞体积偏高。

6. 药物：药物对检验的影响非常复杂，15000多种药物对检验有干扰作用。

众所周知，抗生素、磺胺类药物，对肝功能有大小不一的影响，甚至几片常用药物可以引起严重的药物反应，故在采样检查之前，暂停各种药物是为上策，如不可停用，则应了解可能对检验结果产生的影响。

第二节㊀胆红素测定1913年v a nd e nB e r g h 根据胆红素是否直接与重氮试剂反应,将其分为直接胆红素和间接胆红素㊂后来利用高效液相色谱技术将血清胆红素细分为以下四类:①α组分胆红素:即未结合胆红素,它通过与血清清蛋白可逆结合将其运输到肝㊂②β组分胆红素:即单葡萄糖醛酸结合胆红素;③γ组分胆红素:即双葡萄糖醛酸结合胆红素;④δ组分胆红素:即和清蛋白以非酶促共价键结合,反应性与结合胆红素相似,正常时在血中含量极低㊂一㊁测定方法概述临床上常测定血清总胆红素(t o t a l b i l i r u b i n ,T B I L ,T B )和直接(结合)胆红素(d i r e c t b i l i r u -b i n ,D B I L ,C B ),两者之差即为间接(未结合)胆红素(i n d i r ec tb i l i r u b i n ,I D B I L ,U B )㊂胆红素的测定方法分为化学法和酶法:酶法主要利用胆红素氧化酶(详见第26章);化学法分为两类㊂重氮试剂法和化学氧化法㊂重氮试剂法可测定总胆红素和直接胆红素,又根据加速剂的不同建立了很多种方法,广泛使用的是改良J G ㊂化学氧化法是采用适当的无机氧化剂,在一定的条件下,将胆红素氧化,使胆红素的特有黄色消失,通过测量黄色的消退程度进行胆红素定量检测㊂总胆红素测定需要把所有的直接和间接胆红素都氧化,在氧化剂的选择上很容易㊂而测定直接胆红素不能不氧化间接胆红素,所以选择合适的氧化剂和反应最适p H 是化学氧化法的关键㊂二㊁重氮试剂法重氮法测定血清胆红素由J e n d r o s s i k 和G r o f 于1938年建立,后经D o u m a s 改良,采用安钠咖(苯甲酸钠咖啡因)作为加速剂,又称改良J G 法㊂1.测定原理㊀血清中的D B I L 和I D B I L ,由于其结构和性质不同,对重氮试剂的反应也不一样㊂D B I L 与重氮试剂直接起反应,I D B I L 由于其侧链上的两个羧基之间和两个吡咯环羟基之间均可形成氢键,不能和重氮试剂直接起反应,必须在加速剂破坏分子内氢键后,才与重氮试剂反应,生成偶氮胆红素㊂碱性酒石酸钠使红色偶氮胆红素变为蓝绿色偶氮胆红素,增加测定的灵敏度和特异性㊂测定原理的反应式如下:(1)重氮试剂的生成(2)胆红素的重氮反应:生成紫红色偶氮二吡咯化合物㊂㊃093㊃第二十二章㊀化学法测定生物化学物质2.方法性能评价㊀改良J G 法是测定血清胆红素的经典方法,反应在近中性条件(pH6.5)下,采用安钠咖作为加速剂,促进I D B I L 内氢键的解离,并加速其与重氮试剂反应,在强碱溶液(p H13.0)中,生成偶氮化合物,大大提高了摩尔吸收系数,比传统重氮法更灵敏和准确㊂检测灵敏度达1.7μm m o l /L ,检测上限结合胆红素(D B I L )为171μm m o l /L ,总胆红素达513μm m o l /L ㊂该法缺点是重氮试剂稳定性较差,且需三次加入试剂,一般无法在全自动生化分析仪中使用㊂现在有些商品试剂盒称咖啡因法或改良J G 法,但不加碱性酒石酸钠,即不在碱性条件下显色,其灵敏度和特异性均受到了影响㊂溶血可使测定值偏低,原因是血红蛋白与重氮试剂反应形成的产物可破坏偶氮胆红素㊂脂血及脂溶性色素对测定也有干扰,应尽量空腹采血㊂其他重氮法有2，4二氯苯胺重氮盐法㊁二甲亚砜法等㊂2，4二氯苯胺重氮盐法是在表面活性剂存在的条件下,胆红素与2，4二氯苯胺重氮盐形成重氮化合物,酸性条件下呈红色,对脂血的抗干扰性较好,但易受溶血干扰㊂二甲亚砜法试剂组成简单,可做成单一试剂,反应p H 和显色p H 都在酸性,对脂血的抗干扰性也较强㊂三、钒酸氧化法1.测定原理㊀在p H3条件下,在钒酸盐㊁加速剂和表面活性剂的作用下,血清总胆红素被氧化成胆绿素,使胆红素所特有的黄色减少,由此测定钒酸作用前后450n m 吸光度的变化,并求出血清中总胆红素浓度㊂当试剂中缺少表面活性剂时,钒酸只与血清中D B I L 作用,使之氧化成胆绿素,反应式如下:㊃193㊃第二节㊀胆红素测定㊃293㊃第二十二章㊀化学法测定生物化学物质㊀㊀2.方法性能评价㊀钒酸氧化法是测定血清T B I L㊁D B I L的常规方法,线性上限分别达684.0μm o l/L㊁342.0μm o l/L,比改良J G法要宽㊂抗干扰能力较强,H b<6.0g/L,T G< 8.0m m o l/L时对钒酸氧化法无明显干扰㊂可采用液体双试剂直接上机使用,试剂稳定,国内有许多实验室采用钒酸氧化法进行胆红素的测定㊂。

血清总胆红素微分光谱法测定
孙明洪
【期刊名称】《江西医学检验》
【年(卷),期】1996(014)002
【摘要】目前检测血清总胆红素．实验室广泛采用改良J-G法及BOX法。

直接分光光度法测定胆红素主要受血清中HbO2等色索的严重干扰。

我们根据微分光谱法的原理，用国产723型分光光度计直接比色测定血清总胆红素．计算其一阶导数的近似值。

能有效地清除Hb等色素的干扰。

【总页数】3页(P12-14)
【作者】孙明洪
【作者单位】新钢公司第一医院，336513
【正文语种】中文
【中图分类】R446
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2.KHC3法测定血清总胆红素的方法学评价 [J], 杨晓东;卢建明
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实验十六血清胆红素测定（改良J-G法）【目的】1.熟悉血清胆红素测定的原理和方法；２.掌握胆红素测定的正常参考范围及临床意义。

【原理】血清中结合胆红素可直接与重氮试剂反应，生成偶氮胆红素；未结合胆红素需要在加速剂（咖啡因-苯甲酸钠）作用下，分子内氢键破坏后，才能与重氮试剂反应生成偶氮胆红素。

醋酸钠缓冲液保持反应的pH，反应完成后加入终止试剂（叠氮钠）以破坏重氮试剂，最后加入碱性酒石酸钠溶液，使颜色不稳定的紫红色偶氮胆红素在咖啡因存在下转化为稳定的蓝色偶氮胆红素，在600nm波长比色，从标准曲线查找总胆红素和结合胆红素含量。

【器材】试管及试管架、吸管、恒温水浴箱、分光光度计、秒表。

【试剂】1．咖啡因试剂称取无水水醋酸钠41.0g，苯甲酸钠38.0g，乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）0.5g，溶于约500ml去离子水中，再加入咖啡因25.0g，搅拌使溶解（加入咖啡因后不能加热溶解），用去离子水补足至1L，混匀。

过滤后置棕色瓶，室温保存。

2．碱性酒石酸钠溶液称取氢氧化钠75.0g，酒石酸钠（Na2C4H4O6·2H2O）263.0g，用去离子水溶解并补足至1L，混匀。

置塑料瓶中，室温保存。

3．5g/L亚硝酸钠溶液称取亚硝酸钠0.5g，用去离子水溶解并定容至100ml，混匀，置棕色瓶，冰箱保存，稳定期不少于2周。

若发现溶液呈淡黄色，应废弃重配。

4．5g/L 对氨基苯磺酸溶液称取对氨基苯磺酸（NH2C6H4SO3H·H2O）5.0g，溶于800ml去离子水中，加入浓盐酸15ml，用去离子水补足至1L。

5．重氮试剂临用前取上述亚硝酸钠溶液0.5ml和对氨基苯磺酸溶液20ml，混匀即成。

6．5.g/L叠氮钠溶液7．胆红素标准液（1）目前一般用未结合胆红素配制标准液，此标准品须用含白蛋白的溶剂配制，常用人混合血清，对此血清的要求如下：收集无溶血、无黄疸、无脂浊的新鲜血清，混合，必要时可用过滤器过滤。

血清胆红素可在加速剂（甲醇、咖啡因）的作用下，与重氮试剂反应生成偶氮胆红素，出现颜色反应，颜色的深浅与胆红素的浓度成正比，IF-CC推荐目前总胆红素测定采用偶氮反应方法。

参考值：l.7～20μmol／L（0.1～1.2mg／dl）临床意义：（1）判断有无黄疸。

（2）根据血清胆红素分类，判断黄疽类型。

血清总胆红素和以间接血清总胆红素增多为主的是溶血性黄疸，例如溶血性贫血，严重大面积烧伤等；血清总胆红素和以直接胆红素增高为主者是梗阻性黄疽，例如胆石症，尿胆原可呈间歇性减少或消失，如为肿瘤压迫所致，尿胆原可进行性减少或消失；血清总胆红素、直接胆红素及间接胆红素皆增高为肝细胞性黄疸，如病毒性肝炎等。