质粒构建流程
一、引物设计
1）取得目的基因序列，可选用数据库NCBI
2）软件分析目的基因可用酶切位点。使用primer5分析出序列不包含的酶切位点，即为可用没切位点。
3）选择载体。根据转染细胞和实验室资源，选择合适载体。如pcDNA3.1(+)，
4）选择酶切位点。对照目的基因可用酶切位点和载体上的酶切位点，选择二者共有的作为备选。载体上两个酶切位点的距离应有几十bp以上，选实验室常用酶切位点。
5）使用primer5设计目的基因引物，目的产物应包含从启动子到终止子全部碱基。
6）根据选择的酶切位点，查找对应的酶切位点保护碱基，将对应片段添加到设计的引物两端，注意酶切位点的前后顺序。一般选择三个保护碱基。
7）引物设计完成，送公司合成。
二、目的片段获取
1. RNA提取
试剂盒：Bioteke 高纯总RNA快速提取试剂盒离心柱型（裂解液RL 4℃、漂洗液RW -20℃保存）
准备：冰盒、4℃预冷离心机、EP管2套、吸附柱RA一套
操作步骤：
1）将1000μl裂解液RL加入细胞中，混合5min。
2）加200μl氯仿混合，震荡15s，室温孵育3min。
3）4℃，12000rpm离心10min。
4）最上层水相转移至新EP管中（体积约550μl）
5）加入1倍体积（550μl）70%乙醇，混匀
6）全部转移到套收集管的吸附柱RA中，4℃，10000rpm离心45s
7）弃废液，重套收集管，加500μl去蛋白液RE，12000rpm离心45s
8）弃废液，重套收集管，加700μl去漂洗液RW，12000rpm离心60s
9）弃废液，重套收集管，加500μl去漂洗液RW，12000rpm离心60s
10）弃废液，重套收集管，12000rpm空离2min
11）吸附柱放入新EP管，加50μl RNase free water于膜上，室温放置2min
12）4℃，12000rpm离心60s
13）点样：5μl RNA+ 1μl 10×buffer，1.5%琼脂糖凝胶电泳，100V，3min，可见3条亮带。14）-20℃保存
2.RNA反转录
试剂盒：TaKaRa primescript RT reagent kit with gDNA eraser（-20℃保存）
准备：冰盒，②④⑤⑥取出解冻，①③为酶不可取出，预冷离心管
操作步骤：
1）基因组DNA去除（10μl体系）
② 5×gDNA eraser buffer 2μl
① gDNA eraser 1μl
Total RNA 4μl(可根据RNA浓度调整)
⑥ RNase free water 3μl
PCR仪中进行，程序：42℃，2min→4℃
注：RNA的量可根据浓度调整，混合液冰上配制，酶最后加入
2）反转录反应（20μl体系）
④ 5×primerScript buffer 2 4μl
③ primerScript RT enzyme mix I 1μl
⑤ RT primer mix 1μl
⑥ RNase free water 4μl
1）反应液10μl
PCR仪：37℃，15min→85℃，5s→4℃
注：可直接将第2步反混合液好后加入到第1步反应液中
3）1.5mlEP管收集，-20℃长期保存
3. PCR扩增
高保真酶primerstar扩增，50μl
5×PS buffer 10μl
dNTP 4μl
dH2O 32.5μl
Primerstar 0.5μl
cDNA 1μl(可变)
R-primer 1μl
F-primer 1μl
点样：5μl PCR产物+ 1μl 6×buffer，
4.PCR产物纯化
1）液相纯化（产物电泳结果只含目的条带）
试剂盒：Microelute cycle-pure spin protocol(OMEGA bio-tek) D6293-01
①将PCR产物加入1.5mlEP管，加入5倍体积buffer CP，混匀。
②转移至HiBind MicroElution DNA 柱（套收集管），室温离心10000g，1min。
③弃废液，加700μl DNA wash buffer（含乙醇）到柱子，室温离心10000g，1min。
④弃废液，重复③
⑤弃废液，空管离心13000g，1min
⑥柱子放入新EP管，加10-20μl Elution buffer到膜上，室温孵育3-5min，离心10000g，1min
⑦电泳检测
2）割胶回收（产物电泳结果含杂带）
①将含目的条带的琼脂糖凝胶切下（切得尽量小），放入1.5ml EP管。
②加等体积（1g=1ml）binding buffer（XP2）,60℃金属浴7min左右至胶溶解（溶液为淡黄色），混匀2min
③溶液加入离心柱，离心10000g，1min，废液倒回再离一次
④弃废液，加300μl binding buffer（XP2），离心10000g，1min
⑤弃废液，加700μl SPW washing buffer，离心10000g，1min
⑥重复⑤
⑦空管离心13000g，2min，弃废液，柱子转移到新EP管
⑧加入30-50μl elution buffer 于膜上，室温孵育1min ，离心13000g ，1min
⑨ 电泳检测
三、双酶切
30μl 反应体系如下：
PCR 纯化产物 15μl
10×M/L/K buffer 3μl
3dH2O 10μl
酶A 1μl
酶B 1μl
反应条件：takara 酶30℃水浴1h →65注：buffer 类别依使用的酶具体选择，见附表
四、连接
1）双酶切后，可将质粒酶切产物琼脂糖电泳1-2μl
2）酶切产物液相纯化
3）20μl 连接体系（皆可）
PCR 产物 5μl
pcDNA3.1 2μl
10×T4buffer 2μl
T4 ligase 1μl
3dH2O 10μl
PCR 仪中进行：22℃，30min →4注：连接产物-20℃可长期保存
五、转化
准备：碎冰，灭菌EP 管、LB 空液体培养基，带抗性培养板，超净工作台，移液枪，水浴锅加热42℃
1）将感受态细胞置于冰上，待其融化
2）超净工作台中，将连接产物10μl 加入100μl 感受态细胞，或质粒1-3μl 加入100μl 感受态细胞
3）轻混匀，冰浴30min
4）热击水浴42℃，45s ，冰浴1min
5）加900μl LB 空培养基，摇菌150rpm ，37℃，1h
6）浓缩离心13000rpm ，1min ，上清液留约200μl 重悬菌体，部分涂板（50-100μl ）
7）完全吸收后，37℃倒置培养12-16h
六、菌落PCR
1）以rTaq 酶50μl 体系配制PCR 反应液，每个PCR 管分装15μl ，体系如下：
3dH2O 35.7μl PCR 程序：
95℃ 5min
