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溶血空斑形成实验一、实验目的学习溶血空斑形成实验的实验原理与步骤，掌握用溶血空斑形成实验检查动物的抗体产生功能。
二、实验原理溶血空斑试验，又称空斑形成细胞（Plague Forming Cel , PFC ）试验，是一种体外检测抗体形成细胞的方法。
将一定量洗涤过的绵羊红细胞注射入小鼠腹腔，四天后将小鼠杀死，取脾脏制成脾细胞悬液，内含抗体形成细胞。
然后将脾细胞、绵羊红细胞，补体混合孵育。
由于脾细胞所分泌的抗体和绵羊红细胞表面抗原结合形成抗原抗体复合物，在补体作用下可使红细胞溶解，于特制的小室内形成肉眼可见的溶血空斑。
一个空斑即代表一个抗体形成细胞。
三、实验材料1.解剖器械、试管、1ml 吸量管2.载玻片、石蜡盘、酒精灯、微量加样器3. BALBC 小鼠（北京大学医学部实验动物中心提供）4.5％和10％绵羊红血球（SRBC )5.补体（豚鼠血清，经SRBC 吸收，临用时稀释成合适浓度）四、实验步骤1.腹腔注射0.5mlSRBC,4天后拉颈椎处死，取出脾放在已加入6ml Hank液的平皿中，用100目不锈钢网研磨过滤混匀。
2.吸取1ml加入试管中，加满Hank液混匀，离心1000rpm，10min。
3.吸取1ml Hank液加入试管中，重悬脾细胞沉淀，细胞密度约1 ×107/ml。
4.取1 ×107/ml 脾细胞100μl；10%SRBC 200 μl；补体200 μl；Hank液1ml。
5.混匀后，用尖吸管灌小室、封蜡、标记、平放于玻片盘，37 ℃孵育30min。
五、实验结果肉眼观察空斑，计数小室出现的溶血空斑数，对于模糊不清的空斑，可以在低倍镜下观察。
注意区分气泡和溶血空斑，真正的溶血空斑中心必有一个淋巴细胞。
加试管1混合液的小室有多个透明的溶血空斑形成，加试管2混合液的小室（对照）没有。
一个空斑即代表一个空斑形成细胞（抗体形成细胞）。
六、讨论1.在小室注入液体时不要留有气泡。
溶血空斑试验溶血空斑试验一、原理溶血空斑试验是体外检测单个抗体形成细胞(B淋巴细胞)的一种方法，即将经绵羊红细胞(SRBC)免疫过的家兔淋巴结或小鼠脾脏制成细胞悬液，与一定量的SRBC结合，于37℃作用图3131琼脂平板溶血空斑溶血空斑试验溶血空斑试验试验原理示意图下，免疫活性淋巴细胞能释放出溶血素，在补体的参与下，使抗体形成细胞周围的SRBC溶解，从而在每一个抗体形成细胞周围，形成肉眼可见的溶血空斑。
每个空斑表示一个抗体形成细胞，空斑大小表示抗体生成细胞产生抗体的多少。
由于溶血空斑试验具有特异性高，筛检力强，并可直接观察等优点，故可用作判定免疫功能的指标，观察免疫应答的动力学变化，并可进行抗体种类及亚类的研究。
溶血空斑试验溶血空斑试验目前有关溶血空斑试验的具体方法很多，现仅将琼脂平板溶血空斑试验的操作方法简介如图3131。
溶血空斑试验溶血空斑试验二、材料和方法(一) 材料平皿(直径55×15cm)，温箱(37℃)，水浴箱(45℃)，离心机，显微镜及白细胞计数器，18～25g昆明系小鼠等。
溶血空斑试验溶血空斑试验(二) 试剂1．SRBC悬液取无菌脱纤绵羊血(或阿氏液保存的血液)，用灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗3次，每次 2 000r/min离心5min，最后取压积红细胞，悬于灭菌pH值7 2 P BS(含Ca2+、Mg2+)中，使成为20%浓度，经细胞计数后，调整细胞浓度为2×10 9/ml。
溶血空斑试验溶血空斑试验2．01mol/L pH值7 2 PBS(含Ca2+、Mg2+)。
3．底层和顶层琼脂取抗补体作用小的琼脂(日本琼脂粉或旅大水产制品厂的产品)用PBS配成14%和07%两种浓度。
将07%的琼脂分装小试管，每管15ml备用。
4．DEAE右旋糖酐分子量5万，用蒸馏水配成1%浓度备用。
5．补体采集3只以上豚鼠血清，应用时用PBS稀释成1:30浓度(如不加DEAE右旋糖酐，可采用原补体或作1:5稀释)。
