溶血空斑实验_PPT幻灯片

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溶血的检验 ppt课件

二、参考范围：健康人：阴性。
2

膝关节周围滑膜囊的分布蔗糖溶血试验

一、原理：根据PNH患者的红细胞，在低离子强度的蔗糖溶液中对补体敏感性增强，经孵育后可使补体与红细胞膜结合加强，蔗糖溶液进入补体敏感的红细胞内，导致渗透性溶血。二、参考值：定性试验：正常为阴性；定量试验：正常溶血率<5%. 三、临床意义： PNH患者为阳性或溶血率增加，可作为PNH
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膝关节周围滑膜囊的分布血浆高铁血红素白蛋白检测

原理：血浆中游离的血红蛋白可被氧化为高铁血红蛋白，再分解为珠蛋白和高铁血红素，后者先与血红蛋白结合，血红蛋白消耗完后，再与白蛋白结合形成高铁血红素白蛋白，与硫化铵形成一个易识别的铵血色原，用光谱仪观察结果，于绿光区 558nm处有一最佳吸收区带。

原理：血红蛋白可催化过氧化氢释放新生态氧，使邻苯氧化为蓝紫色。根据显色深浅，与同时测定标准血红蛋白液对照，可测出血浆游离血红蛋白的量。

参考范围：0-40mg/L
应用评价： 1.明显增高是判断血管内溶血的指征。蚕豆

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膝关节周围滑膜囊的分布血清结合珠蛋白检测

原理：血清结合珠蛋白检测（Hp）是在待测血清中加入一定量的血红蛋白液，使之与待测血清中的结合珠蛋白形成Hp-Hb复合物。通过电泳法将结合的Hp-Hb复合物与未结合的Hb分开，测定Hp-Hb复合物的量，可测得血清中结合珠蛋白的含量。参考范围：0.5-1.5gHb/L 应用评价：1.减低：常见于各种溶血，尤其是血管内溶血。严重肝病、先天性无珠蛋白血症、传染性单核细胞增多症等Hp也明

参考范围：阴性
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膝关节周围滑膜囊的分布尿含铁血黄素试验

医学免疫学实验课件-溶血实验

在实验过程中，需要观察并记录每个试管的变化情况，如有无溶血、凝集等。
在实验结束后，需要对每个试管进行拍照并记录实验结果，如红细胞有无凝集、有无溶血等。这些结果将用于后续的分析和讨论。
03
实验数据分析
溶血反应阳性率计算
计算每个样本的溶血反应阳性率，即阳性样本数除以总样本数。
判断溶血反应阳性率的参考范围为：健康人群 < 5%，患者 < 10%。
当红细胞表面抗原与相应抗体结合后，可形成抗原-抗体复合物，激活补体，导致红细胞溶解破裂，释放出血红蛋白；
通过检测血清中游离的抗体或红细胞抗原，可对相关疾病进行诊断和鉴别诊断。
实验试剂与器材
试剂
抗A、抗B标准血清、A型、B型、O型试剂红细胞、生理盐水等；
器材
试管、移液管、离心管等。
02
实验步骤
THANKS
感谢观看
数据解读需遵循医学伦理和职业道德，保证患者隐私和医疗安全。
05
相关应用
临床应用场景
溶血实验是医学免疫学中一个重要的实验，常用于检测红细胞表面抗原和抗体，以及红细胞表面受体的检测。
溶血实验还用于检测血清中游离的抗体或抗原，以及红细胞表面受体的激活状态，对于诊断多种疾病具有重要意义。
其他领域应用
溶血实验在生物学、药理学、病理学等领域也有一定的应用。
在生物学中，溶血实验可以用于研究生物膜的结构和功能，探究生物膜与细胞之间的关系等。
未来发展趋势
溶血实验未来的发展趋势主要集中在提高实验的灵敏度和特异性，以及寻找新的溶血方法等方面。
此外，溶血实验还可以应用于研究肿瘤细胞对红细胞的作用，以及在药物筛选等领域的应用也有待于进一步拓展。
实验数据统计分析

医学免疫学实验：溶血空斑形成实验

溶血空斑形成实验一、实验目的学习溶血空斑形成实验的实验原理与步骤，掌握用溶血空斑形成实验检查动物的抗体产生功能。

二、实验原理溶血空斑试验，又称空斑形成细胞（Plague Forming Cel , PFC ）试验，是一种体外检测抗体形成细胞的方法。

将一定量洗涤过的绵羊红细胞注射入小鼠腹腔，四天后将小鼠杀死，取脾脏制成脾细胞悬液，内含抗体形成细胞。

然后将脾细胞、绵羊红细胞，补体混合孵育。

由于脾细胞所分泌的抗体和绵羊红细胞表面抗原结合形成抗原抗体复合物，在补体作用下可使红细胞溶解，于特制的小室内形成肉眼可见的溶血空斑。

一个空斑即代表一个抗体形成细胞。

三、实验材料1.解剖器械、试管、1ml 吸量管2.载玻片、石蜡盘、酒精灯、微量加样器3. BALBC 小鼠（北京大学医学部实验动物中心提供）4.5％和10％绵羊红血球（SRBC )5.补体（豚鼠血清，经SRBC 吸收，临用时稀释成合适浓度）四、实验步骤1.腹腔注射0.5mlSRBC,4天后拉颈椎处死，取出脾放在已加入6ml Hank液的平皿中，用100目不锈钢网研磨过滤混匀。

2.吸取1ml加入试管中，加满Hank液混匀，离心1000rpm，10min。

3.吸取1ml Hank液加入试管中，重悬脾细胞沉淀，细胞密度约1 ×107/ml。

4.取1 ×107/ml 脾细胞100μl；10%SRBC 200 μl；补体200 μl；Hank液1ml。

5.混匀后，用尖吸管灌小室、封蜡、标记、平放于玻片盘，37 ℃孵育30min。

五、实验结果肉眼观察空斑，计数小室出现的溶血空斑数，对于模糊不清的空斑，可以在低倍镜下观察。

注意区分气泡和溶血空斑，真正的溶血空斑中心必有一个淋巴细胞。

加试管1混合液的小室有多个透明的溶血空斑形成，加试管2混合液的小室（对照）没有。

一个空斑即代表一个空斑形成细胞（抗体形成细胞）。

六、讨论1.在小室注入液体时不要留有气泡。

实验二溶血空斑meng

6.将沉积的红细胞用乳头吸管吹吸悬起混匀。吸取此悬液0.1ml 放小试管中，再加 0.9mlHank′s 液，即为500 倍稀释的脾细胞悬液。
眼球取血 → 处死小鼠 → 取脾→用10ml洗液冲脾→离心2000r/min 8min→弃上清，加裂解液2ml，混匀，2min后离心（转数、时间同上）→弃上清加洗液10ml，混匀，离心（同上）
2.用100μl的微量进样器吸取被检细胞混合悬液，于小室一端轻轻将液体注满两个小室。记录实际注入的悬液微升数。
3. 将做好的标本水平放置37℃温箱中，孵育30 分。
【结果分析】
结果观察及溶血空斑计数。
1.肉眼观察空斑，计数两个小室出现的溶血空斑数。对模糊不清的空斑，可在低倍镜下检查。真正的溶血空斑，必须中心有一个淋巴细胞，周围为透明区。
加样
10ul 细胞悬液
玻片小室的制作
取洁净的载玻片按下图贴二条宽约5mm 和一条10mm 的双面胶，然后用小镊子取二片盖玻片分别放在其上，做成两个小室，用小镊子尾部将盖玻片压平贴牢。
细胞混悬液的配制及灌注
1.取小试管一支，用1ml吸管取0.2ml指示细胞悬液；0.2ml 500倍稀释的脾细胞悬液，混匀后即为被检的细胞混合悬液。
计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25 个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。但无论是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方格数都是相同的，即16×25=400小方格。
示意图
细胞计数板的使用
1mm
A
2.计算出全脾脏中抗体产生细胞总数：
脾细胞悬液总毫升数（即为50ml）
抗体产生细胞总数＝

溶血空斑试验PFC试验PPT课件

3、制备小室：用双面胶将2张载玻片两端及中间粘起，形成两个小室
4、制备灌注液：
实验组：脾细胞悬液100μl＋15％SRBC 100 μl＋补体 100 μl＋Hank’s液500 μl
对照组：脾细胞悬液100μl＋15％SRBC 100 μl＋Hank’s 液600 μl
5、灌注小室: 2管分别灌注2个小室，石蜡密封小室的两侧 6、孵育： 37℃培养箱中40min
（三）材料与器材
1、小鼠，5％和15％SRBC，补体，Hank’s液 2、解剖器械，试管，载玻片，石蜡，100目不锈钢
网，双面胶带 3、37℃培养箱
（四）实验方法
1、免疫小鼠：4天前5％SRBC腹腔注射免疫小鼠
2、制备脾细胞悬液：颈椎脱臼处死小鼠，取脾在不锈钢网上研磨（7 ml Hank’s液），1000 rpm离心6 min，去上清，加1 ml Hank’s液悬浮脾细胞
溶血空斑试验
PFC实验
（一）实验目的
掌握PFC实验原理、实验操作和结果观察；
（二）实验原理
溶血空斑试验或空斑形成细胞试验（ Plague forming cell, PFC)，体外检测抗体形成细胞。 1、SRBC＋B细胞＝记忆性B细胞（抗体形成细胞） 2、SRBC＋抗体形成细胞＝（抗原＋抗体复合物）注意事项
（1）小室注入液体时不要留有气泡；（2）小室边缘需用石蜡封严；（3）37℃孵箱孵育时，必须放平，不可倾斜；
（六）实验结果
观察溶血空斑现象区分：溶血空斑：比周围颜色浅，折光性差，边缘不整齐。气泡：比周围亮，折光性好，边缘整齐。
讨论
• 分析溶血空斑形成的原因

实验五新生儿溶血病PPT课件

临床研究进展
诊断技术
开发和应用新的诊断技术，提高新生儿溶血病的早期诊断准确率。
治疗方法
研究新的治疗策略和方法，如免疫抑制剂、免疫调节剂等，以改善患儿的预后。
并发症防治
针对新生儿溶血病可能引发的并发症，如贫血、黄疸、肾功能不全等，开展防治措施的研究。
研究展望与挑战
深入探索发病机制
进一步揭示新生儿溶血病的发病机制，为疾病防治提供理论依据。
案例三分析
ABO溶血病导致贫血的原因是母子血型不合，母体产生的抗体通过胎盘进入胎儿体内，引发胎儿红细胞破坏，导致贫血。
案例总结与启示
总结
新生儿溶血病是由于母子血型不合，母体产生的抗体通过胎盘进入胎儿体内，引发胎儿红细胞破坏而导致的。
启示
对于新生儿溶血病的预防和治疗，需要加强产前检查和监测，及时发现和处理问题。同时，加强宣传教育，提高公众对新生儿溶血病的认识和重视程度。
02
新生儿溶血病的治疗
药物治疗
免疫抑制剂
通过抑制免疫反应，减少红细胞的破坏，从而控制溶血过程。常见的免疫抑制剂包括环孢素、他克莫司等。
糖皮质激素
具有抗炎、抗过敏和免疫抑制作用，可以减轻溶血过程，缓解黄疸和贫血等症状。常用的糖皮质激素包括泼尼松、地塞米松等。
光照疗法
光照疗法是一种物理治疗方法，通过特定的波长和强度的蓝光照射皮肤，使皮肤中的胆红素转化为水溶性的物质，从而降低血清胆红素水平，缓解黄疸症状。
光照疗法通常在医生的指导和监测下进行，需要确保光疗的安全性和有效性。在光疗过程中，需要注意保护宝宝的眼睛和生殖器等敏感部位。
换血疗法
当新生儿溶血病严重时，可能需要采用换血疗法来快速降低血清胆红素水平，改善贫血症状，预防并发症的发生。

溶血的检验PPT课件

参考范围：阴性
应用评价：血管内溶血时，血浆中游离血红蛋白大量增加，血浆中可检测出高铁血红素白蛋白，血清中出现高铁血红素白蛋白是溶血严重的指标。
尿含铁血黄素试验
实验原理：尿含铁血黄素试验又称Rous试验。当血红蛋白通过肾滤过时，部分铁离子以含铁血黄素的形式沉积于上皮细胞，并随尿液排出。尿中含铁血黄素是不稳定的铁蛋白聚合体，其中的高铁离子与亚铁氰化钾作用，在酸性环境下产生普鲁士蓝色的亚铁氢化铁沉淀。尿沉渣肾小管细胞内可见直径1~3um的蓝色颗粒。
参考范围：半寿期25-32天
应用评价： 1.溶血性贫血：红细胞寿命缩短，约为14天。
2.再生障碍性贫血：红细胞寿命缩短，约为15-29天。
血浆游离血红蛋白检测
原理：血红蛋白可催化过氧化氢释放新生态氧，使邻苯氧化为蓝紫色。根据显色深浅，与同时测定标准血红蛋白液对照，可测出血浆游离血红蛋白的量。
参考范围：0-40mg/L
应用评价： 1.明显增高是判断血管内溶血的指征。蚕豆病、PNH、冷
凝集素综合征、阵发性寒冷性血红蛋白尿、溶血性输血反应等明显增高；自身免疫性溶血性贫血、珠蛋白生成障碍性贫血可轻到中度增高。 2.血管外溶血、红细胞膜缺陷不增高。
SUCCESS
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二、参考范围：健康人：阴性。
三、临床意义：阳性主要见于PNH，敏感度较低，有30% 以上患者呈阴性反应。自身免疫性溶血性贫血发作严重时可呈阳性。
蔗糖溶血试验
一、原理：根据PNH患者的红细胞，在低离子强度的蔗糖溶液中对补体敏感性增强，经孵育后可使补体与红细胞膜结合加强，蔗糖溶液进入补体敏感的红细胞内，导致渗透性溶血。

溶血空斑实验..

（四）加补体 • 从温箱中取出平皿，每皿加入1:5稀释的新鲜豚鼠血清1ml，继续放37℃ 温箱中温育30min后取出，观察溶血空斑。也可在室温下放置1h，4℃冰箱过夜，次日观察结果。
结果判定
观察时，将平皿对着光亮处，用肉眼或放大镜观察每个溶血空斑的溶血状况，并记录整个平皿中的空斑数，同时求出每百万个脾细胞内含空斑形成细胞的平均数。
●一个空斑代表一个抗体形成细胞（即B
细胞），空斑的数量反映机体的体液免疫功能。 ●空斑大小表示抗体生成细胞产生抗体的多少。由于溶血空斑试验具有特异性高，筛选力强，可直接观察等优点，故可用做判定免疫功能的指标，观察免疫应答的动力学变化，并可进行抗体种类及亚类的研究。
实验材料与试剂
• 器材：平皿、37℃水浴箱、离心机、显微镜 • 试剂： ①SRBC悬液：取无菌脱纤维羊血，用NS或PBS 离心洗涤3次，每次以2000rpm，5min，用 PH7.2的PBS（含Ca2+、Mg2+）悬成细胞浓度为2.00×109个/mL
②Hanks液（含Ca2+、Mg2+ ） ③底层基（1.4%）和表层基（0.7% ）：将琼脂糖用Hanks液配成1.4%和0.7%两种浓度。将表层基分装于小试管中，每管 2ml ④补体：新鲜豚鼠血清 ⑤小牛血清：56℃灭活 30min
实验步骤
㈠免疫脾细胞悬液的制备 ①小鼠免疫：每只小鼠经尾静脉注入上述SRBC悬液2.00×104个/0.2ml或者腹腔注射4.00×108 个 /1ml。 ②单个脾细胞悬液的制备：将免疫后第四天的小鼠拉颈处死，解剖取出脾脏，放入PH7.2的PBS 中漂洗，去掉结缔组织，加入适量的PBS，用镊子挤压脾脏，稍静置，吸上清液至离心管中， 2500r/min离心5min，弃上清后，定量加入PBS 液1ml，混匀，再用PBS液稀释10倍（浓度约为 5×106个/ml）

溶血检验PPT课件

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六、阵发性睡眠型血红蛋白尿检测
• 〔二〕蔗糖溶血试验 • [原理]蔗糖溶液离子浓度低，经孵育可加强补体与
红细胞膜的结合，使PNH患者的红细胞膜上形成小孔，遂使蔗糖进入红细胞而导致溶血。 • [参考值] • 阴性 • [临床意义] • PNH常为阳性。也可见于巨幼细胞贫血、AA、 AIHA和遗传性球形细胞增多症。可作为PNH的筛选试验，阴性可排除PNH, 阳性应再做Ham试验。 • 〔三〕蛇毒因子溶血试验 • 蛇毒因子是以眼镜蛇毒中提取的一种分子量为 31
二、红细胞膜缺陷的检测
〔一〕红细胞渗透脆性试验
[原理] 红细胞在低渗氯化钠溶液中细胞逐渐膨胀甚至破裂而溶血。该试验是测定红细胞对不同浓度低渗氯化钠溶血的抵抗力，即红细胞渗透脆性。将患者的红细胞加至按比例配置的不同浓度低渗氯化钠溶液中观察其溶血的情况，结果以被检红细胞最小抵抗力〔开场溶血时氯化钠溶液的浓度〕和最大抵抗力〔完全溶血时氯化钠溶液的浓度〕
7
一、溶血性贫血的筛查试验：
〔二〕血浆结合珠蛋白：〔Hp〕 [参考值]0.7-1.5g/L(70-150mg/dL) [临床意义] 减低：见于各种溶血时，以血管内溶血减低为显
著。肝脏疾病、传单、先天性无结合珠蛋白血症。增高：见于感染、创伤、恶性肿瘤、SLE、糖皮
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一、溶血性贫血的筛查试验
〔三〕血浆高铁血红素清蛋白测定 [正常值] 阴性 [临床意义] 阳性表示为严重血管内溶血〔四〕红细胞寿命测定用51Cr标记红细胞检测红细胞半衰期。正常红
• [临床意义]
• 1、阳性见于新生儿溶血病、AIHA、SLE、RF、恶性淋巴瘤、甲基多巴等药物性溶血反响。
• 2、AIHA大多属于温抗体型〔即于37℃条件下作用最强，主要为IgG),但也有小局部属冷抗体型〔IgM〕,必要时应用于4 ℃条件下进展试验，排除假阴性反响。

溶血空斑试验

溶血空斑试验溶血空斑试验一、原理溶血空斑试验是体外检测单个抗体形成细胞(B淋巴细胞)的一种方法，即将经绵羊红细胞(SRBC)免疫过的家兔淋巴结或小鼠脾脏制成细胞悬液，与一定量的SRBC结合，于37℃作用图3131琼脂平板溶血空斑溶血空斑试验溶血空斑试验试验原理示意图下，免疫活性淋巴细胞能释放出溶血素，在补体的参与下，使抗体形成细胞周围的SRBC溶解，从而在每一个抗体形成细胞周围，形成肉眼可见的溶血空斑。

每个空斑表示一个抗体形成细胞，空斑大小表示抗体生成细胞产生抗体的多少。

由于溶血空斑试验具有特异性高，筛检力强，并可直接观察等优点，故可用作判定免疫功能的指标，观察免疫应答的动力学变化，并可进行抗体种类及亚类的研究。

溶血空斑试验溶血空斑试验目前有关溶血空斑试验的具体方法很多，现仅将琼脂平板溶血空斑试验的操作方法简介如图3131。

溶血空斑试验溶血空斑试验二、材料和方法(一) 材料平皿(直径55×15cm)，温箱(37℃)，水浴箱(45℃)，离心机，显微镜及白细胞计数器，18～25g昆明系小鼠等。

溶血空斑试验溶血空斑试验(二) 试剂1．SRBC悬液取无菌脱纤绵羊血(或阿氏液保存的血液)，用灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗3次，每次 2 000r/min离心5min，最后取压积红细胞，悬于灭菌pH值7 2 P BS(含Ca2+、Mg2+)中，使成为20%浓度，经细胞计数后，调整细胞浓度为2×10 9/ml。

溶血空斑试验溶血空斑试验2．01mol/L pH值7 2 PBS(含Ca2+、Mg2+)。

3．底层和顶层琼脂取抗补体作用小的琼脂(日本琼脂粉或旅大水产制品厂的产品)用PBS配成14%和07%两种浓度。

将07%的琼脂分装小试管，每管15ml备用。

4．DEAE右旋糖酐分子量5万，用蒸馏水配成1%浓度备用。

5．补体采集3只以上豚鼠血清，应用时用PBS稀释成1:30浓度(如不加DEAE右旋糖酐，可采用原补体或作1:5稀释)。

溶血空斑试验(PFC测定)PPT课件

实
验
用双面胶在中间和两端各粘一条，将
流
两张玻片黏在一起即成2个小室
程
3.配制小室灌注液
取两只洁净试管，标记
实
验
实验管（μl）对照管（μl）
流
脾细胞悬液
50
50
程
15%SRBC
50
50
补体
50
-
Hank’s液
250
300
混匀，灌注小室，石蜡封口，37度，40min.
实验组
对照组
实验组
对照组
结果：
溶血空斑试验（PFC测定）
(Plaque forming cell assay)
小鼠B细胞溶血空斑形成试验
➢ 溶血空斑试验是基于抗原抗体反应可活化补体，溶解靶细胞的原理来检测抗体形成细胞的一种体外试验方法，用于检测动物的抗体产生功能的经典试验。
➢ 将SRBC免疫过的小鼠脾细胞制成细胞悬液，与一定量的SRBC混合，在补体参与下，使抗体产生细胞周围的SRBC溶解，形成一个肉眼可见的溶血空斑。主要用于测定B细胞抗体产生能力。
实验组出现无数个透明的溶血空斑，而对照组无。溶血空斑边缘不规则，而气泡透亮、边缘规则。
实验组
对照组
气泡空斑
B细胞浆细胞
• 【注意事项】 1.灌注时试验的基本原理及实验方法
实验原理
➢ 抗原刺激B细胞活化分泌特异性抗体 ➢ 抗原抗体复合物经典途径激活补体系统
实验材料
• 小鼠18～22g， • 5％、15％SRBC，补体，Hank’s液， • 解剖器械（剪刀、镊子）， • 空平皿、筛网、组织研磨器、吸管、试管、离心
机， • 载玻片、双面胶、微量加样器、Tip头、棉签、石

实验二溶血空斑

实验二溶血空斑实验目的：了解血液抗原与抗体的作用，掌握血凝反应的基本原理和实验方法，了解溶血空斑试验的原理，探讨影响溶血空斑的因素。

实验原理：人和动物的血液表面都有各种化学物质，其中最明显的有抗原和抗体。

血型抗原通常是在红细胞的表面，而血型抗体则在血清中。

在正常情况下，抗原与抗体之间不会产生相互作用，但是在体外与不同类型的血液混合时就会出现反应。

在血凝反应过程中，当同种抗体与同种抗原相遇时，它们会结合起来形成一个可见的团块。

抗体对于外来抗原有着高度的选择性，即其能够选择性的结合到特定的抗原，而不涉及其他抗原类型。

通常存在四种血型：A、B、AB、O。

每一种血型都有特定的抗体和抗原。

溶血是指红细胞破裂释放出细胞内物质的过程。

红细胞的膜结构具有半渗透性，并且固定量的抗体或淀粉样物质能与它们结合。

当不兼容的血液混合时，体内的抗体结合到血型抗原表面，从而导致血细胞的破裂和血液中出现游离的血红蛋白，也称为溶血现象。

溶血空斑试验是一种检测抗体特异性和浓度的试验。

在试验中，试管中的血浆加入已知抗原类型的红细胞悬液，然后让其稀释，最终加入悬液的红细胞浓度足以产生溶血空斑。

抗体与相应抗原结合时会在红细胞表面形成网状结构，称为空斑。

空斑在显微镜下呈现为圆形透明的结构，其大小和数量取决于抗体浓度和特异性。

抗体浓度越高，抗体与红细胞结合的位置越小，空斑越大。

实验步骤：设计课题：本实验选择 ABO 血型系统，探究不同抗体浓度对溶血空斑的影响。

器材：平滴管5ml，离心机，显微镜，石蜡片，波茨玻璃吸管，无菌吸球，超声波清洗器。

试剂：离心管，血型鉴定血清（A、B、O）、丙酮、0.9％生理盐水、0.3％凝血酶液、4％牛血清蛋白、洗涤缓冲液。

操作流程：1.实验器材的清洗：取下一个 50 毫升的玻璃容器，加入浓度为 10% 的氢氧化钠溶液，用玻璃棒搅拌，再洗净，然后反复用蒸馏水洗净。

之后，使用超声波清洗器清洁吸球。

将使用密闭器前的所有仪器和试剂清洗，使其无残留物和干净。

溶血空斑

溶血空斑————————————————————————————————作者：————————————————————————————————日期：ﻩ溶血空斑试验学号：2姓名:买可热古丽。

玉素甫班级:生物技术班实验目的：１.掌握PＦC试验的基本原理及实验方法；2. 了解ＰFC试验的临床意义。

原理:溶血空斑试验 (plaquｅｆoｒminｇ cｅｌl ａssａｙ , PFC）是 Jernｅ于 1９６３年设计的用于体外检查和计数某种抗体形成细胞的一种方法。

该方法是将经绵羊红细胞(SRＢC）免疫过的小鼠脾脏制成细胞悬液，与一定量的ＳＲBC结合，于37℃作用下，免疫活性淋巴细胞能释放出溶血素，在补体的参与下，使抗体形成细胞周围的SＲBC溶解，从而在每一个抗体形成细胞周围,形成肉眼可见的溶血空斑。

每个空斑表示一个抗体形成细胞，空斑大小表示抗体生成细胞产生抗体的多少。

由于溶血空斑试验具有特异性高,筛选力强,可直接观察等优点，故可用做判定免疫功能的指标,观察免疫应答的动力学变化,并可进行抗体种类及亚类的研究。

材料与试剂:１．动物 C5７ BL/6小鼠2．补体豚鼠新鲜血清 3.主要试剂：琼脂，绵羊血红细胞（SRBC）,PBS(ｐH７.2)4.仪器设备：37°C恒温箱，平皿（5.5cm＊1．5ｃm)水浴箱,离心机,显微镜，细胞计数板方法：1.小鼠免疫及脾细胞悬液的制备（1) SＲBC悬液制备:取无菌脱纤维绵羊血，用PBS洗涤３次（1500r ／ｍiｎ，离心5mｉn)，取积压红细胞悬于PBS中，使成20％浓度，细胞计数后调整浓度2．０×109/ｍl。

（2)小鼠免疫:实验组每只小鼠腹腔注射上述SRBC悬液0.2ml，对照组注入等剂量的PBＳ。

（3)脾细胞悬液制备：将免疫后四天的小鼠断颈处死,取脾脏,PBS洗涤后置于小烧杯上2０0目不锈钢筛网,用注射器针芯研磨成悬液,洗涤两次(１200r／ｍｉn,离心5min)，调整细胞数为１.0×107／ｍl，置4℃冰箱备用。

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（四）加补体
• 从温箱中取出平皿，每皿加入1:5稀释的新鲜豚鼠血清1ml，继续放37℃ 温箱中温育30min后取出，观察溶血空斑。也可在室温下放置1h，4℃冰箱过夜，次日观察结果。
结果判定
观察时，将平皿对着光亮处，用肉眼或放大镜观察每个溶血空斑的溶血状况，并记录整个平皿中的空斑数，同时求出每百万个脾细胞内含空斑形成细胞的平均数。
（二）倾注底层琼脂
• 将1.4%琼脂凝胶加热融化后，倾注于水平位置的平皿内，每皿6ml，凝固后，用前置55℃水浴锅中预温。
（三）表层琼脂的制备
• 将0.7%的琼脂融化后，置于55℃恒温水浴箱中，依次加入以下试剂：
• ⑴ 20%SRBC悬液0.1ml。
• ⑵ 小牛血清0.1ml。
• ⑶ 5.00×106/ml脾细胞悬液0.1ml。迅速混匀后，倾注于已铺好底层琼脂的平皿内，使之均匀铺平凝固后，静置约15min，放37℃温育2h。
注意事项
⒈ 对SRBC的要求：因为SRBC既是免疫原，也是靶细胞和指示细胞，故要求SRBC应新鲜，洗涤不超过3次，每次2 000r/min离心5min，细胞变形或脆性增大者均不能使用。
2．免疫所用SRBC的数量：尾静脉注射以 2.00×104 个/0.2ml为宜。腹腔注射为 4.00×108 个 /ml，用量小，如低于1.00×107个 /ml注射0.5ml，空斑形成极少；用量过大，超过2.50×109个/ml，不能形成空斑。
实验目的
• 掌握溶血空斑试验检测原理 • 掌握溶血空斑的操作方法
实验原理
●溶血空斑实验（plaque forming cell assay,PFC ）体外检测单个抗体形成细胞（B淋巴细胞）的一种方法。
●其原理是将绵羊红细胞（S细胞制成细胞悬液，与一定量的SRBC结合，在37℃条件下免疫活性淋巴细胞释放出溶血素，在补体的参与下，可溶解周围的绵羊红细胞，从而在每个抗体形成细胞周围形成一个可见的溶血空斑。
③底层基（1.4%）和表层基（0.7% ）：将琼脂糖用Hanks液配成1.4%和0.7% 两种浓度。将表层基分装于小试管中，每管2ml
④补体：新鲜豚鼠血清
⑤小牛血清：56℃灭活 30min
实验步骤
㈠免疫脾细胞悬液的制备
①小鼠免疫：每只小鼠经尾静脉注入上述SRBC悬液2.00×104个/0.2ml或者腹腔注射4.00×108 个 /1ml。
3．采取免疫脾的时间：无论是经尾静脉还是腹腔免疫，均以免疫后第四天取脾为宜，过早或过晚空斑都形成极少。
4．脾细胞的活力：为了保证脾细胞的活力，制备脾细胞过程中所用PBS（或Hank’s液），最好临用时方从4℃冰箱中取出，或整个操作过程应在冰浴中进行。
5．倾注平板的要求：底层要平，表层要把握好温度。不要有气泡，表层基要求混合均匀。
• SRBC可大致计数，但脾细胞计数必须准确。
• 免疫动物必须用纯系动物，杂种动物个体差异大，难以比较，最好先作几次预实验，使每个玻片空斑数控制在100200个为宜。
思考题
• 溶血空斑实验的意义？
6．补体的活力：补体活力的大小，对溶血空斑的形成关系很大。如出现抗体或补体的活力低下，将不能形成空斑。所以补体要新鲜，并宜将3只以上豚鼠血清混合。试验中加入Ca2+、Mg2+是为了活化补体。
7．空斑计数：要求判读准确，避免辨认造成的误差。遇可疑空斑时，应镜检，对肉眼结果进行核对。
• 所以器皿和各种试剂在加入表层基前均需预温。
②单个脾细胞悬液的制备：将免疫后第四天的小鼠拉颈处死，解剖取出脾脏，放入PH7.2的 PBS中漂洗，去掉结缔组织，加入适量的PBS，用镊子挤压脾脏，稍静置，吸上清液至离心管中，2500r/min离心5min，弃上清后，定量加入PBS液1ml，混匀，再用PBS液稀释10倍（浓度约为5×106个/ml）
●一个空斑代表一个抗体形成细胞（即B 细胞），空斑的数量反映机体的体液免疫功能。
●空斑大小表示抗体生成细胞产生抗体的多少。由于溶血空斑试验具有特异性高，筛选力强，可直接观察等优点，故可用做判定免疫功能的指标，观察免疫应答的动力学变化，并可进行抗体种类及亚类的研究。
②Hanks液（含Ca2+、Mg2+ ）