生物技术制药试验

生物技术制药实验

武汉大学药学院 生物技术实验室

湖北·武汉 1 / 23

目 录

实验一 质粒DNA的小量制备 ·················································································· 2

实验二 质粒DNA电泳鉴定 ··················································································· 4

实验三 感受态细胞的制备和转化 ············································································ 5

实验四 目的基因的表达及表达产物的初步提取 ·························································· 8

实验五 蛋白质纯化—盐析沉淀法 ·········································································· 10

实验六 凝胶过滤层析 ························································································· 14

实验七 蛋白质免疫印迹实验（Western Blotting） ······················································· 16

实验八 HRP结合物的过碘酸钠交联法 ····································································· 19

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实验一 质粒DNA的小量制备

【目的】

学会最常用的碱裂解法小量制备质粒DNA的方法。

【原理】

根据共价闭合环状质粒DNA与线性DNA在拓扑学上的差异来分离。在pH12.012.5这个狭窄的范围内，线性DNA双螺旋结构解开而被变性。尽管在这样的条件下共价闭合环状质粒DNA也会变性，但两条互补链彼此互相盘绕，仍会紧密结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快，而线性的染色体DNA复性缓慢，经过离心与蛋白质和大分子RNA等发生共沉淀下去而被去除。

【器材】

超净工作台，接种环，酒精灯，台式离心机，旋涡混合器，微量移液器，1.5ml微量离心管，恒温摇床，试管，双面微量离心管架，试管架，标签纸，磁力搅拌机。

【试剂】

pET-28a质粒载体菌, LB培养基1000ml（含10g/ml卡那霉素），葡萄糖/Tris/EDTA 溶液（溶液 I），NaOH/SDS溶液 （溶液 II），KAc溶液（pH4.8）（溶液 III），RNase A，95%乙醇，70%乙醇，TE buffer（pH8.0）。

【实验准备】

1. 配制卡那霉素储存液（无菌水配制10mg/ml，分装后-20C保存）。

2. 配制LB培养基

（胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g加200mL 双蒸水搅拌完全溶解，用约200L 5N NaOH调pH至7.0，加双蒸水至1L，121C灭菌20min）。

3. 溶液I（50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris HCl pH8.0，10mmol/L EDTA pH8.0）。

溶液Ｉ可成批配制，每瓶约100ml,在高压下蒸气灭菌15分钟，贮存于4℃。

溶液II（0.2mol/L NaOH，1% SDS）；

溶液III（60mL 5mol/L Kac，加冰乙酸调pH4.8，补双蒸水至100ml）。

4. 70%乙醇（-20C保存）。 3 / 23 5. TE buffer（10mmol/L Tris HCl pH8.0，1mmol/L EDTA ，pH8.0）。

6. 试管洗净并塞上棉塞，1.5ml离心管装入灭菌盒，移液器吸头装入相应的吸头盒，高压灭菌（121C， 30min）。

【操作步骤】

1. 在超净工作台中取5ml LB（Amp+），加入灭菌的试管中。

2. 取出保存的携带pET-28a质粒的菌种, 在超净工作台上用接种环移取少量菌种至5ml无菌的LB培养液（含10ug/ml卡那霉素）中，37C摇床中振荡培养20h。

3. 取1ml的菌液至1.5ml离心管中，12000 rpm离心1min，弃上清液（尽量弃干净），留沉淀备用。

4. 在沉淀中加入预冷的100l 溶液I，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀，室温下静置5min。须确使细菌沉淀在溶液Ｉ中完全分散。

5. 加入200l 溶液II，盖紧管口，快速颠倒离心管５次。应确保离心管的整个内表面均与溶液Ⅱ接触。切勿剧烈振荡。冰浴中放置5min。

6. 加入预冷的150l 溶液III，盖上盖后上下颠倒几次混匀，冰浴放置5min。

7. 12000 rpm离心5min，小心吸取400l 上清液于另一个干净的1.5ml离心管中，（不要将白色沉淀物带入！），加入800l 95% 乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀，室温下静置5min。

8. 12000 rpm离心10 min，小心弃掉上清液，加入500l 70% 乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀。12000 rpm离心10 min，小心弃掉上清液，倒置尽量流尽。

9. 再加入500l 70% 乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀。12000 rpm离心10

min，小心弃掉上清液，尽量倒置弃干净，可将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。

10. 离心管倒置于37C温箱中（或室温）空气干燥10分钟。

11. 加入10LTE缓冲液，涡旋混合器上轻微振荡混匀，离心机中瞬时离心将溶液收集于管底。用记号笔标记后放入冰箱中冷藏待电泳确认。

12. 在剩余的菌液中倒入少许新洁尔灭，待溶液变清亮后随废液和剩余的冰块一起倒入下水池。清理桌面，清洗仪器。

13. 撰写实验报告。

【思考】

影响本实验结果的主要因素有哪些？

4 / 23 实验二 琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒DNA

【目的】

学会常用的琼脂糖凝胶电泳法分离和鉴定DNA。

【原理】

DNA双螺旋分子骨架两侧带有含负电荷的磷酸根，在电场中会向正极方向移动。不同长度的DNA由于受到凝胶介质的阻力不同，表现为不同的迁移率而被分开。

【器材】

电泳仪，水平凝胶电泳槽和梳子及其制胶模块，250ml三角瓶，微波炉，台式离心机，旋涡混合器，凝胶成像系统，分光光度计，微量移液取样器，1.5ml离心管，双面微量离心管架，试管架等。

【试剂】

pET-28a，TAE电泳缓冲液，1000溴化乙锭储存液，电泳级琼脂糖粉，10加样缓冲液（或6加样缓冲液），DNA分子量标准（DNA Ladder:100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000，1500 bp）。

【实验准备】

配制TAE电泳缓冲液（50储存液，pH约8.5：Tris碱 242g，57.1ml冰乙酸，37.2g

Na2EDTA.2H2O，dd water 定容至1L）；

1000溴化乙锭储存液（0.5mg/ml：50mg溴化乙锭溶于100mL 双蒸水，4C避光储存）；

10加样缓冲液（20% Ficoll 400，0.1mol/L Na2EDTA pH8.0，1.0% SDS，0.25%溴酚蓝）；

6加样缓冲液；

1.5ml离心管装入灭菌盒，移液器吸头装入相应的吸头盒，灭菌。

【操作步骤】

1. 称取0.5g琼脂糖粉，放入三角瓶，加入50ml TAE电泳缓冲液(1)，放入微波炉中加热溶解（1min）。注意观察烧瓶中的琼脂糖粉末，待完全熔化后停止微波（切不可让胶溶液溢出到微波炉中！）。

2. 戴上线手套，从微波炉中取出三角瓶，置桌面上冷却致50-60C（手接触瓶壁不感觉烫）。

3. 把梳子插到凝胶灌制模具的正确位置后缓缓倒入胶溶液。胶溶液倒至与模具的矮边缘相平即可，不要把胶溶液溢到外面。静置10-20分钟待胶完全凝固。在水平5 / 23 电泳槽中加满1TAE电泳缓冲液。根据电泳槽的长度把电泳仪的电压调至170V(10V/cm)，注意正负电极的位置连接正确。

4. 待胶完全凝固后（15-20分钟），小心拔出梳子。用手指捏住模具两侧的高边缘取出模具和凝胶放入电泳槽中间的平台上，凝胶要没入电泳液中。凝胶上有样品孔的一侧要朝向电泳槽的负极。

5. 剪1片光面纸（或封口膜），点6l蒸馏水、1l 10加样缓冲液，再加入3l质粒DNA溶液制成10l DNA样品。

6. 在凝胶上选择相邻的加样孔。用10l的吸液头分别将管中的样品加入凝胶的加样孔中（如果需要时，在相邻的加样孔中加入1.5-3l DNA分子量标准物）。加样时持移液器的手以肘部固定在桌上，用另一只手扶住这只手的手腕，以减少移液器的抖动。看到蓝色的样品吸管尖头伸进加样孔后（不能伸得太深，以免穿破凝胶的底部）缓缓将蓝色的样品压入加样孔中。切不可使蓝色样品流到孔外。

7. 打开电源开关，样品将形成一条蓝色的横带向前移动（如果发现蓝色向后移动，立即关闭电源，调换电极）。电泳将进行约30min。

8. 当蓝色的溴酚蓝迁移到距凝胶边缘1cm时，关闭电源。取出模具和凝胶。

9. 把凝胶小心反扣放入盛有EB的搪瓷盒中。放置约10分钟后，取出用自来冲洗两次。

10. 清理垃圾。染有EB的凝胶要放到专用的垃圾袋中作专门处理，以免污染环境。

11. 撰写实验报告。

【思考】

（1） 泳道中的质粒DNA有几条带？为什么？

（2） 影响本实验结果的因素有哪些？

实验三 感受态细胞的制备和转化

【目的】

了解和掌握感受态细胞制备与转化的原理和操作步骤，获得转化有质粒pGEX-6p的转

化菌株。

【原理】