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生物制药技术试验

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生物制药技术实验

实验一 多粘菌素E发酵及管碟法测定生物效价

一、目的要求

了解抗生素发酵的基本过程。

了解管碟法测定抗生素生物效价的基本原理。

学会管碟法测定抗生素效价方法，并学习抗生素发酵过程一些重要生理生化指标分析。

二、基本原理

多粘菌素E是由多粘芽孢杆菌产生的一种碱性多肽类抗生素，由10个氨基酸和1个脂肪酸衍生物

构成。结构如图5-1。

多粘菌素E主要对绿脓杆菌、百日咳杆菌、大肠杆菌等革兰氏阴性细菌有显著的杀菌作用(是作用

于细胞膜的抗生素)。是治疗烫伤、肠道疾病、呼吸道疾病、尿路感染、眼部感染及外科手术感染时较

好的药物。

抗生素液体发酵共分三大工序：菌种、发酵、提炼。配合三个工序进行分析化验和有关产物测定。

(一) 菌种

图5-1 多粘菌素E的结构式 生物制药技术实验

种子质量指标：无杂菌，全部形成芽孢，摇瓶发酵效价达35 000 u/mL以上（30℃，48 h培养，

方可用于生产。

（二） 发酵

抗生素发酵过程除需经常镜检排除杂菌污染外，接种12 h后，每2 h进行一次pH、生物量、总糖、

还原糖、氨基氮测定。多粘菌素E发酵一级种子同时需检测2，3-丁二醇，发酵需检测糊精和抗生素效

价。

一级种子质量指标：无杂菌，全部杆菌，粗壮整齐，无噬菌体；pH 5.5~6.0；刚刚出现2,3-丁二醇。

二级发酵质量指标：菌体粗壮整齐，无噬菌体和杂菌感染；pH 6.0；糊精刚刚消失；多粘菌素E

效价10000~35000 u／mL。

(三) 提炼

衡量抗生素发酵液中抗菌物质的含量称效价。抗生素效价测定可采用化学法或生物效价测定法。

生物效价测定有稀释法、比浊法、扩散法三大类。管碟法是扩散法的一种。本实验采用管碟法测定抗

生素的效价。

管碟法就是利用有一定体积的不锈钢制的小管，叫牛津杯，将抗生素溶液装满小杯，并在含有敏

感试验菌的琼脂培养基上进行扩散渗透作用，经过一定时间后，抗生素扩散到适当的范围，产生透明

的抑菌圈。抑菌圈的半径与抗生素在管中的总量(单位)、抗生素的扩散系数(cm2/h)、扩散时间(即抗生

素溶液注入钢管至出现抑菌圈所需的时间)、培养基的厚度(mm)和最低抑菌浓度(u／mL)等因素有关。

抗生素总量的对数和抑菌圈直径的平方呈直线关系。因此，抗生素效价可以由抑菌圈的大小来衡量。

将已知效价的多粘菌素E硫酸盐标准液先制成标准曲线，比较已知效价标准液与未知效价的被检品溶

液的抑菌圈的大小，就可算出样品中抗生素的效价。

三、实验材料

(一) 菌种

多粘芽孢杆菌19、大肠杆菌A1.543、检测多粘菌素E敏感指示菌。

(二)培养基(见附录)

1．麸皮培养基(保存和活化菌种用)

配制麸皮培养基100 mL，分装30支试管、每管约3mL培养基，100Pa灭菌20 min．冷凉

摆斜面，供全班同学使用。

2．种子培养基 砂子孢子

（4℃±1℃冰箱保存） 第一代孢子（试管斜面）

（28℃麸皮培养基，培养5 d） 第二代孢子（茄瓶或克氏瓶）

（28℃麸皮培养基，培养5 d）

种子罐发酵（一级，种子培养基）

（30℃±2℃，培养12～16 h） 发酵罐发酵（二级，发酵培养基）

（28～30℃，培养48 h） 放罐

发酵液 滤液 中和滤液 饱和树脂 解吸液

白色粉末（成品）多粘菌素E硫酸盐 多粘菌素游离碱 中和氧化滤液 草酸酸化

板框压滤 加NaOH中和

板框压滤

中和、氧化、过滤 加氨水沉淀

离心甩干，洗去氨 加6 mol/L H2SO4,调pH

6.0~6.5, 溶解 加NaOH及KMnO4 解吸

喷雾干燥 1 mol/L H2SO4

吸附 上离子交换柱 生物制药技术实验

配制200 mL(实际160 mL)种子培养基，分装于250mL锥形瓶，每瓶装30mL。100 Pa灭菌20 min，

供4人使用。

3．发酵培养基

配制300 ml(实际240 mL)发酵培养基，分装于500mL 锥形瓶，每瓶装30 mL。100Pa灭菌20min，

供4人使用。

4．效价捡测用的底层培养基(含2％琼脂)

配制200mL底层培养基，分装于250 mL锥形瓶，每瓶装50 mL。100Pa灭菌20min，供4人使用。

5．效价检测用的上层培养基

配制300 mL上层培养基，分装于250 mL锥形瓶，每瓶装50 mL。100 Pa灭菌20 min,供4人使用。

6．大肠杆菌A1.543保存和活化培养基

配制100 mL培养基，分装30支试管，每管约3 mL培养基，100 Pa灭菌20 min，灭菌后摆成斜

面，供全班同学使用。

7．无菌生理盐水

每管5 mL，每人2管。

(三) 试剂

1. 2，3-丁二醇测定试剂(V．P．试剂) 见附录。

2. 糊精测定试剂(碘液) 见附录。

3. 多粘菌素E测定试剂 见附录。

(1)1/15mol/L pH 6.0磷酸缓冲液 见附录。分别配制500 mL 1／15 mol/L pH 6.0 KH2PO4溶液；

l00mL 1/15mol/L pH 6.0 Na2HPO4·2H2O溶液。将上述二种溶液按KH2PO4:Na2HPO4＝9:1比例混合，然

后分装于250 mL锥形瓶中，每瓶装100 mL，100 Pa灭菌20 min，供全班同学使用。

(2) 多粘菌素E标准液 见附录。先用1/15mol/L pH 6.0 磷酸缓冲液配制1mL含10 000单位多粘

菌素E母液，贮于冰箱中。临用前再稀释至每mL含1000单位。

(四) 仪器

恒温箱、摇床、水浴锅、台式离心机、台秤等

(五) 其他物品

1. 每组两人，洗涤、包扎、灭菌物品

移液管(1mL)8只、滴管(长管细口)8支、镊子4把、培养皿10套、陶瓷盖10个，洗涤挑选规格相

同的牛津杯(8个/每皿) 4套。

2. 每组两人，洗涤备用玻璃器皿

大试管4支，小试管8支，离心管4支，玻璃小漏斗4个，5 mL移液管4支，1 mL 移液管4支，

10 mL移液管8支，250 mL锥形瓶4个，载玻片8张等。

四、实验内容

(一) 发酵

1. 种子培养

将多粘芽孢杆菌E由斜面接入盛有种子培养基的锥形瓶内，于转速为220~240 r/min 旋转式摇床

上振荡培养12~16 h，进行镜检、pH和2,3-丁二醇测定。以2,3-丁二醇出现时间为转移种子的最适时间。

本实验只选用培养16 h的种子接入发酵瓶。同时进行镜检、pH和丁二醇测定。

2. 发酵

本实验发酵在锥形瓶内进行。

分别吸取培养好的种子液3.5 mL，接入盛有发酵培养基的多个发酵瓶内(500 mL 锥形瓶盛发酵培

养基30 mL，30℃振荡培养36~48 h，一般培养至40 h取出1 瓶发酵液，镜检并测定pH和糊精，其余

发酵瓶继续振荡培养，以后每隔1 h检测一次，直至无糊精时发酵结束。本实验采用培养48 h的发酵

液进行镜检、pH、糊精和多粘菌素E效价测定。 生物制药技术实验

(二) 提取(发酵液中多粘菌素E粗品提取)

抗生素可分泌胞内或胞外，分泌于细胞内的抗生素通常采用加热酸化处理，使细胞壁破裂，抗生

素释放。本实验采用此法。

取发酵液25mL，加入0.5 g 草酸，放在沸水浴中煮沸0.5 h，使菌体内的多粘菌素E迅速释放，然

后用冷水迅速冷却，经滤纸过滤，此滤液即含多粘菌素E的样品。

(三) 测定

1. 镜捡

在油镜下观察简单染色涂片后的各生长期多粘芽孢杆菌个体形态，辨别有无杂菌和噬菌体污染，

菌体被噬菌体感染后，往往染色不匀，菌体变形。包括麸皮斜面、种子液和发酵液。

2. pH 测定

用精密pH试纸测定种子液转移和发酵终止时发酵液的pH。

3. 2,3-丁二醇测定

种子瓶从12 h开始就检测2,3-丁二醇，以后每2 h 测定一次。取发酵液2 mL，用蒸馏水稀释5倍，

3000 r/min 离心10 min，取上清液约0.5 mL，加40%KOH溶液约1mL，再加5% α-奈酚3滴，加5%

碳酸胍3滴，摇动几分钟，或水浴加热5 min，出现粉红色即可移种。

4. 糊精测定

发酵瓶36~40 h后，就开始测定糊精。取发酵液1mL，用蒸馏水稀释至25 mL，加3滴碘液，蓝

紫色消失就可终止发酵。

5. 多粘菌素E效价测定

本实验用不同浓度的多粘菌素E溶液作标准曲线，以抑菌圈直径的平方值为横坐标，多粘菌素E

标准品效价的对数值为纵坐标，绘制标准曲线作为定量依据。具体作法如下：

(1) 大肠杆菌菌悬液制备 取活化的大肠杆菌A1.543菌种接种于大肠杆菌活化培养基斜面，37℃

培养24 h，然后每支斜面加无菌生理盐水10 mL，刮下菌苔，搓匀。

(2) 倒底层平板 将灭菌的2%琼脂水底层培养基加热融化后，冷凉至45~50℃左右，倾倒入培养

皿制成底层平板，每人2～3个，凝固后于皿底贴上标签。

(3) 制备混菌上层平板 将检测用上层培养基加热融化后，冷凉至50℃左右，50 mL上层培养基

加入大肠杆菌菌悬液0.5mL，轻轻摇匀。在每一培养皿底层平板上加入10 mL混菌上层培养基(动作迅

速，以免培养甚中琼脂凝固；倾倒上层培养基时不要有气泡。若有气泡应赶到平板边缘)，凝固后成上

层平板即为双碟备用。制备双碟时必须在水平的桌面上，并选择平底的培养皿。贴好标签的培养皿，

放于白瓷盘上。

(4) 滴加多粘菌素E标准品和样品 先将10 000 u／mL的标准多粘菌素E，用1/15mol／L pH 6.0

磷酸缓冲液稀释成800、1000、1200 u／mL。根据酸化后滤液颜色粗略估计发酵样品效价，用1/15 mol/L

pH 6.0的磷酸缓冲液稀释至1000 u／mL。

每人取制备好的2～3个双碟，打开皿盖，用无菌镊子夹取已灭菌的钢管(牛津杯)，每个双碟中放

置钢管6个(如图5－1～2所示)。其中相间隔的3个钢管滴加多粘菌素E标准液。另外3个钢管滴加

发酵液样品。A管中用无菌滴管滴加多粘菌素E 800 u／mL的标准液，B管滴加多粘菌素E 1000 u/mL

的标准液，C管滴加多粘菌素E 1200 u／mL的标准液，D管滴加发酵样品稀释液。滴加时必须仔细小

心，勿在小钢管中形成气泡，勿使溶液流出管外，加的量各管要一致，恰好滴满。滴加完毕后，加上

灭菌陶瓷盖。将放双碟的白瓷盘小心平端于37℃恒温箱内，培养6～8 h后取出。

(5) 抑菌圈直径的测量及校正 将双碟中的钢管倒入白瓷缸中，加洗涤灵和水，然后煮沸0.5 h，

清水冲洗晾干。用玻璃皿盖换下白陶瓷盖，然后用卡尺测量双碟中每管抑菌圈的直径。

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《生物制药技术》实验五

《生物制药技术》实验五

1 《生物制药技术》实验指导

实验五、四环素生物效价测定（选作）

一、实验目的

1、了解杯碟法测定抗生素生物效价的基本原理。

2、掌握杯碟法测量抗生素效价的方法。

二、实验原理

衡量发酵液中抗生素的含量称效价(titer或titre)，效价是评价抗生素效能的标准，也是衡量抗生素活性成分含量的尺度，它代表抗生素对微生物的抗菌效力，人们以1µg金霉素或四环素标准品为1个单位，0.6µg青霉素G钠盐为1个单位。抗生素的生物测定方法有三大类：稀释法、比浊法以及扩散法。扩散法中杯碟法(cup and plate method)或称管碟法(tube and plate method) 一种是常用的方法。它是将已知浓度的标准抗生素溶液与未知浓度的样品溶液分别加到牛津杯

(Oxford cup，一种标准的不锈钢小管)中，置于含有敏感试验菌的琼脂平板上进行扩散渗透，一定时间后抗生素在菌层培养基形成浓度由高到低的自然梯度，当抗生素浓度达到或高于MIC（最低抑制浓度）时，试验菌就被抑制而不能繁殖，从而呈现透明的抑菌圈。测量出抑菌圈的大小，以计算抗生素的浓度。在一定的浓度范围内，抗生素总量的对数值与抑菌圈直径的平方成线性关系，且在一定的试验条件下，可直接利用抑菌圈的直径近似地代替其平方，因而从样品的抑菌圈直径可在标准曲线上求得样品的生物效价。将已知效价的金霉素标准液先制成标准曲线，根据被检品溶液的抑菌圈的大小，就可从标准曲线上查出效价的对数值，从中计算出相应效价，再乘以稀释倍数，即计算出待测样品中抗生素的效价。因杯碟法是利用抑制敏感细菌的直接测定方法，所以符合临床使用的实际情况，而且灵敏度很高，不需要特殊的设备，故多被采用。但此法也有缺点，即操作步骤多，培养时间长，获得结果慢。尽管如此，由于它的独特优点，仍然被世界各国所公认，作为国际通用的方法被列入各国药典中。

三、实验材料及设备

（一）实验材料 2 1、菌种：

生物制药技术实验中的动物试验操作指南

生物制药技术实验中的动物试验操作指南

生物制药技术实验中的动物试验操作指南

在生物制药技术的研究和开发过程中，动物试验是不可或缺的一环。动物试验可以提供关于新药安全性、疗效和副作用的重要信息，为药物研发提供科学依据。然而，动物试验必须在合乎伦理和道德规范的前提下进行，以保证动物的福利和尊严。本文将为您提供生物制药技术实验中的动物试验操作指南，以确保您的实验能够合规进行。

一、实验前准备

在进行动物试验之前，首先需要制定详细的试验方案和实验操作程序，并获得相关的伦理审批。确保试验有明确的目的和预期结果，并制定相应的实验步骤和数据收集方法。

同时，为了确保试验的准确性和可靠性，需要选择合适的动物种类和数量，并提供适当的饲养和养护环境。动物饲养的环境应具备以下条件：温度适宜、湿度控制、通风良好、噪音和干扰最小化。

二、试验操作步骤

1. 动物采集和准备

在试验开始前，需要选择合适的动物品系和年龄，并确保动物的健康状况良好。动物的采集和准备应遵循以下步骤：

- 从可靠的供应商获得动物，确保他们遵循动物保护法规；

- 调查动物的饲养历史和健康状况；

- 对动物进行身体检查，确保它们没有任何潜在疾病或异常。

2. 注射和给药 注射和给药是动物试验中常见的操作。在进行注射和给药前，需要遵循以下步骤：

- 确定注射或给药的途径和剂量；

- 使用无菌器械和药品，以减少感染的风险；

- 确保注射或给药操作准确，避免对动物造成过度伤害。

3. 采集样本和观察指标

动物试验的目的是收集关于药物效果和安全性的数据。为了确保数据的准确性和可比性，需要注意以下操作：

- 采集样本时，应按照规定的时间点和方法进行，并记录好样本信息；

- 观察和记录动物的行为、生理指标和体重变化等重要指标，以评估药物的疗效和毒性。

4. 术后护理和观察

在进行手术试验时，需要给予动物适当的术后护理和观察，以确保它们的恢复和福利：

生物技术制药

生物技术制药

生物技术制药

从第一家生物技术制药公司的成立(1971)到2004年，生物技术制造工业已走完33年的路程，全球研制中的生物技术药物共有２２００多种，进入临床试验的１７００余种，已投放市场的约１４０种，估量５年内投放市场的药物将达到２００种以上。生物药品已广泛应用于治疗癌症、多发性硬化症、贫血、发育不良、糖尿病、肝炎、心力衰竭、血友病、囊性纤维变性和一些罕见的遗传性疾病。差不多上市的生物药品一样分为三大类：即：重组的治疗用蛋白质，重组疫苗和诊断或治疗用的单克隆抗体(Mabs)。 2000年以来，我国相继出台了一系列相关政策，对医药行业以后几年的进展指出了明确的战略性进展方向，生物制药业面临良好的进展机遇，真正立足于生物制药业并有一定高技术产品支持的医药企业已表现出良好的增长趋势。估量在今后几年，我国生物制药业将会保持20-30%的年增长率，到2005年生物制药业的市场销售额将达到130-150亿元，利润将达到40-48亿元。与发达国家相比，尽管国内生物医药技术仍存在明显的差距，但生物医药业无疑正处在加速上升时期，市场潜力庞大。

目前，中国国内已将生物医药产业作为经济中的重点建设行业和高新技术中的支柱产业来进展，在一些科技发达或经济发达的地区建立了国家级生物医药产业基地，比如上海浦东生物医药开发基地，广东中山健康产业基地等，在深圳、上海、长春、厦门、杭州等地，一些生物技术骨干企业差不多迅速崛起。我国生物制药产业尽管进展较快，但也存在严峻的问题，如资金投入少，研制开发力量薄弱，技术创新落后；在药品开发与生产上重复建设现象严峻；力量分散，企业规模小，整体生产现代化水平不高，设备落后；市场开发理念失常，缺乏品牌意识；企业治理相对滞后，技术兼经营性人才匮乏；企业相互之间缺乏交流和合作。

第一课、 知识融合推动生物医药产业进展

被誉为 〝朝阳工业〞的生物医药产业，已成为众多投资者与企业家专门关注的热门领域之一。有识之士竞相投资兴办药厂，通过采取购买具有知识产权的高附加值产品、参与生物医药产品的前期科学研究等举措，以求猎取企业的连续快速进展。然而面对竞争强手的挑战，其经营者必须具有战略家的眼光，将企业的进展与当前科学技术的进展相融合，探究企业长期稳固进展的道路。

生物制药实验(1)

生物制药实验(1)

实验一 芦丁的提取精制与鉴定

芦丁（Rutin）亦称芸香苷（Rutinoside），在植物界广泛存在，其中以槐米、荞麦叶、蒲公英和烟叶中含量较多，可作为提取芦丁的原料。

槐花米系豆科植物Sophora japonica 的未开放花蕾，具有调节毛细血管渗透性之作用，临床用作毛细血管止血药，如复方芦丁，也作为高血压的辅助治疗药物。除此之外，还可作为制药原料，用于制造槲皮素（Quercetin）、羧乙基槲皮素、羧乙基芦丁、二羧丙基芦丁、β-乙基吗啡芦丁、6-而乙基氨基芦丁等。

槐花米中芦丁的含量高达12%~16%,另含少量皂苷。芦丁水解后得到槲皮素，皂苷水解后可得到白桦酯醇（Betulin）及槐花二醇（Sophoradiol）。

芦丁为淡黄色细小针状结晶，含三个结晶水，熔点177~178℃。；芦丁溶于热水（1:200），难容于冷水（1:8000）；溶于热甲醇（1:7），冷甲醇（1:100）；热乙醇（1:30），冷乙醇（1:300），难溶于乙酸乙酯、丙酮，不溶于苯、三氯甲烷、乙醚及石油醚等溶剂。易溶于碱液中呈黄色，酸化后又析出。

其结构如下图：

一、实验目的

1、通过芦丁的提取与精制掌握碱酸法提取黄酮类化合物的原理及操作。

2、通过芦丁的结构检识，了解苷类结构研究的一般程序和方法

二、实验原理

芦丁为浅黄色粉末或极细的针状结晶，含有三分子的结晶水。溶解度：冷水1:10000；热水1:200；冷乙醇1:650；热乙醇1:60；冷吡啶1:12。微溶于丙酮、乙酸乙酯，不溶于苯、乙醚、氯仿、石油醚，溶于碱而呈黄色。

芦丁为黄酮苷，分子中具有酚羟基，显酸性，可溶于稀碱液中，在酸液中沉淀析出，可利用此性质进行提取分离。利用芦丁易溶于热水、热乙醇，较难溶于冷水、冷乙醇的性质选择重结晶方法进行精制。 三、实验器材

研钵，500mL烧杯，广泛试纸，四层纱布，滤纸，漏斗，10mL试管，5mL移液管，波棒，洗耳球，温控烘箱