当前位置：文档之家 › 棕榈酸诱导H9C2心肌细胞脂毒性损伤模型的建立

棕榈酸诱导H9C2心肌细胞脂毒性损伤模型的建立

  • 格式：pdf
  • 大小：1.50 MB
  • 文档页数：5

棕榈酸诱导H9C2心肌细胞脂毒性损伤模型的建立5周宇U，刘涛L2,鲍翠玉(1.湖北科技学院药学院，湖北咸宁437100;2.湖北科技学院糖尿病心脑血管病变湖北省重点实验室)摘要：目的探讨棕榈酸（P A)对H9C2心肌细胞造成的影响，建立H9C2心肌细胞脂毒性损伤模型。

方法不同浓度(〇.〇25、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 111111〇1/1〇?入刺激119€2心肌细胞24}1，用]\/[11比色法检测细胞增殖情况;选择浓度为0.4 m m o l/L的P A刺激H9C2心肌细胞12、24、4811，用]\/[11比色法检测细胞增殖情况；不同 浓度P A刺激H9C2心肌细胞24h后用R O S试剂盒检测细胞活性氧发生情况、用T u n e l试剂盒检测细胞凋亡情况。

结果〇.4m m o l/L P A刺激H9C2心肌细胞24h时，细胞增殖水平明显被抑制。

与control组相比，P A浓度为0.2m m o l/L时，细胞R O S水平及T u n e l凋亡水平均有所增加，另外，细胞出现轻微凋亡相关形态学改变；当0. 4m m o l/L P A刺激H9C2心肌细胞24h时，细胞R O S和T u n e l水平均出现明显增加，细胞质与细胞核均发生明显的细胞凋亡现象。

结论P A浓度为0.4m m o l/L刺激H9C2心肌细胞24h时即可建立起脂毒性心肌损伤模型。

关键词：糖尿病心肌损伤;棕榈酸;高脂;H9C2心肌细胞中图分类号:R961文献标识码:A文章编号=20954646(2018)02-0102-04D O I：10.16751/j. cnki. 20954646.2018.02.0102Establishment of a Model of Lipotoxic Injury Induced byPalmitic Acid in H9C2 CardiomyocytesZ H O U Y u,L I U T a o,B A0 Cui-yu{School of Pharmacy, H ubei University of Science and Technology ,Xianning Hubei 431100 y China)ABSTRACT：Objective T o investigate the effect of palmitic acid ( P A) o n H9C2cardiomyocytes a n d to establish a m o d e l of lipotoxic injury in H9C2 cardiomyocytes. Methods H9C2 cardiomyocytes w e r e stimulated with different concentrations of P A(0. 025,0.05,0. 1,0. 2,0. 4a n d 0. 8m m o l/L)for different t i m e,a n d the cell viability w a s detected b y M T T assay. T h e occurrence of reactive o x ygen species in cells w a s detected with R O S kit,and the cell apoptosis w a s detected with T u n e l kit. Results T h e cell viability of H9C2 w a s significantly decreased after stimulation with palmitic acid at the concentration of 0. 4m m o l/L for 24h. C o m p a r e d with the control group,the R O S level in H9C2cardiomyocytes a n d the n u m b e r of apoptotic cells, w e r e increased aftertreatment with 0. 2 m m o l/L P A for 24 h,a n d the effects w e r e m o r e obvious with 0.4 m m o l/L P A stimulation. Conclusion T h e m o d e l of lipidtoxic cardiomyocyte injury ca n establish b y palmitic acid at the concentration of0. 4m m o l/L for 24 h in H9C2 cell line.KEY WORDS：Myocardial injury；Palmitic a c i d；High-fat；H9C2 cardimyocytes糖尿病是以慢性高血糖为特征的代谢性疾 病[1]，目前人类生活水平提高，糖尿病发病率出现 逐年增多的趋势[2]。

糖尿病可诱发一系列并发 症，包括心脏、血管、肾脏、神经、足部等部位发生病理性改变[3]，其中，糖尿病心肌病会改变心脏功 能，会引起心肌缺血和心衰，最终发生患者死亡[4]〇大量研究表明，心肌细胞糖脂代谢异常[5]、炎症[6]、氧化应激[7]、心肌细胞凋亡都会导致糖尿* 基金项目：国家自然科学基金资助项目（51703055);湖北省自然科学基金资助项目（2017C F B99,2015C F C773);湖北省教育厅科 学研究计划项目（B201696);湖北科技学院糖尿病专项基金(2016-18X Z09，14Z X42)* *通讯作者，E-mail:cuiyu_bao@163. co m病心肌病的发生。

本实验选择了 PA刺激H9C2 心肌细胞诱导心肌细胞损伤，模拟糖尿病心肌损 伤中的脂毒性损伤模型，为糖尿病性心肌细胞损 伤的防治提供基础。

1材料与方法1.1实验材料1.1.1细胞系H9C2心肌细胞购自武汉大学细胞典藏中心。

1.1.2主要试剂高糖DMEM培养基（Hyclone公司，美国）；胎 牛血清（Gibco公司，美国）；MTT粉末（Gibco公 司，美国）；棕榈酸（PA，Sigma公司，美国）；DAPI 细胞核染液(武汉谷歌生物有限公司，武汉）；细胞 活性氧R0S试剂盒（Thermo Scientific公司，美 国）；Tunel试剂盒（Roche公司，美国）。

1.1.3主要设备超净工作台（苏州安泰公司）；C02细胞培养 箱（德国Hemeus公司）；HVE-50高压灭菌器（日本Hirayama公司）；倒置荧光显微镜（日本Olym­pus株式会社 ） ；电子分析天平 （德国 Sartorius 公 司）；3-18K高速冷冻离心机（德国Sigma公司）；酶标仪(美国Bio-Tek公司）。

1.2 实验方法1.2.1细胞培养H9C2心肌细胞培养在含10%胎牛血清和100U/mL双抗的高糖DMEM中，静置于37T、5% C〇2的条件下细胞培养箱中孵育24h，细胞充分贴壁生长融合至80%时用含0•25%EDTA胰酶进 行消化传代培养，取对数生长期的细胞进行本次 实验。

1.2.2 PA的配制准备EP管装有lmL无水乙醇，用分析天平 精准称取PA粉末25.642mg，把称好的PA粉末倒 入无水乙醇中，将EP管放入371水浴锅中轻摇 震荡至完全溶解。

然后使用孔径为〇.22pm的滤 膜过滤，过滤后的储存液浓度为l〇〇mmol/L，使用 前用371水浴锅将PA储存液完全溶解至无沉淀 物方可使用。

给药时，用含有5%BSA的DMEM 稀释使用。

1.2.3实验分组不同浓度PA刺激H9C2心肌细胞的增殖情 况:正常对照组（control)，含 0• 025、0. 05、0. 1、0•2、0.4、0. 8 mmol/L PA 的高糖 DMEM培养 24h;0•4mmol/L PA刺激H9C2心肌细胞不同时间的细 胞增殖情况:正常对照组（control)、含0.4mmol/L PA的高糖DMEM培养12h、24h、48h。

不同浓度高脂刺激对细胞形态学的影响：正常对照组（con­trol)，含 0• 05、0. 1、0. 2、0. 4 mmol/L PA 的高糖DMEM培养24h后采用R0S与Tunel试剂盒进行 检测。

1.3检测指标1.3.1 MTT比色法检测H9C2心肌细胞增殖率在96孔板中接种H9C2心肌细胞悬液(每孔1 xlO6细胞，每孔10(VL)，每组设置6个复孔。

将96孔板放回细胞培养箱中培养24h待细胞完全贴 壁，向每孔加入不同浓度含PA的培养基继续培养 相应时间。

弃去孔内所有上清液，向每孔加入 2(^L0•5%MTT溶液放回细胞培养箱继续培养4h，用酶标仪读取在570nm处的吸光度值。

1.3.2化学荧光法检测细胞活性氧R0S在24孔板中接种H9C2心肌细胞，向每孔分别 加入不同浓度含PA的高糖DMEM培养基继续培 养24h，弃去孔内培养基用不含胎牛血清的DMEM 清洗2遍，按1:500的比例用不含胎牛血清的DMEM配制R0S试剂盒试剂，每孔加入50(V L配 制好的试剂放回细胞培养箱中培养20min，弃去孔 内培养基用1x PBS清洗2遍，向每孔滴加1滴 DAPI细胞核染液，避光室温静置10min，l x PBS清 洗2遍后收集细胞爬片，用抗荧光淬灭封片剂封 片。

在倒置荧光显微镜20倍镜下观察，拍照并将 两种荧光图片进行组合。

1.3.3 Tunel法检测细胞凋亡情况在24孔板中接种H9C2心肌细胞，向每孔分别 加入不同浓度含PA的高糖DMEM培养基继续培 养24h，弃去孔内培养基1x PBS清洗2遍，4%多聚 甲醛室温固定lh，3%过氧化氢封闭10min，0. 1% Triton X-100渗透孵育2min，1x PBS清洗2遍后每 孔加入50卟Tunel检测试剂，放回细胞培养箱培养 lh。

用1x PBS清洗2遍，向每孔滴加1滴DAPI细 胞核染液，避光室温静置l〇min，1x PBS清洗2遍 后收集细胞爬片，用抗荧光淬灭封片剂封片。

在倒 置荧光显微镜20倍镜下观察，拍照并将两种荧光 图片进行组合。

1.4统计学方法本实验数据均使用GmphPad Prism7软件处 理，两组数据间差异采用（检验进行计算，P<〇.05 表示差异具有统计学意义。

2结果2.1高脂刺激对H9C2心肌细胞增殖率的影响PA浓度分别为 0•025、0.05、0.1、0•2、0.4 和 0•8mmol/L，刺激时间设定为24h时它们的增殖率为 101.4%、106. 6%、102. 2%、106. 6%、71. 7%和 54.0%。

合集下载

Prokineticin 2对高糖高脂诱导的心肌细胞损伤的保护作用

Prokineticin 2对高糖高脂诱导的心肌细胞损伤的保护作用

Prokineticin 2对高糖高脂诱导的心肌细胞损伤的保护作用崔伟力;王敏;余薇【摘要】目的探讨Prokineticin 2(PK 2)对高糖高脂环境下心肌细胞损伤的保护作用.方法通过体外H9c2大鼠心肌细胞培养,采用33 mmol/L的葡萄糖合并使用150 μmol/L的棕榈酸刺激12、24、36、48h不同的时间造成心肌细胞高糖高脂损伤,给予不同浓度的PK 2干预治疗,通过MTT检测PK 2对高糖高脂诱导的心肌细胞损伤的作用.结果 0.1、1、10、100 nmoL/L的PK 2可致正常的心肌细胞存活率增加,与正常对照组比较具有明显差异;高糖高脂刺激H9c2心肌细胞24 ～48 h后细胞存活率开始明显下降,且具有时间依赖性.0.1、1、10nmol/L的PK2可逆转存活率的降低.结论 PK 2对高糖高脂诱导的心肌细胞损伤有显著的保护作用,其机制有待进一步的研究.【期刊名称】《湖北科技学院学报（医学版）》【年(卷),期】2018(032)001【总页数】4页(P5-7,11)【关键词】糖尿病;心肌病;Prokineticin 2;心肌细胞;细胞存活率【作者】崔伟力;王敏;余薇【作者单位】湖北科技学院药学院,湖北咸宁437100;湖北科技学院药学院,湖北咸宁437100;湖北科技学院药学院,湖北咸宁437100【正文语种】中文【中图分类】R961糖尿病(diabetes mellitus)是一种由遗传和环境因素共同作用、以胰岛素分泌缺陷或/和胰岛素作用障碍导致的一组以慢性高血糖为特征的代谢性疾病。

近年来，随着人们生活水平的提高，糖尿病的发病呈快速增长和低龄化的态势，到目前为止，全世界糖尿病的患病人数大概是4.2亿，推测到2040年，该数目将达到6.42亿[1]；我国糖尿病患者人数约占世界糖尿病人群总数的五分之一，患病率居世界第二位，给家庭和社会带来极大的负担。

糖尿病主要危害全身大、小血管，心血管并发症已成为50%～80%糖尿病患者的主要死因[2]。

棕榈酸诱导的C2C12肌管胰岛素抵抗模型的建立

棕榈酸诱导的C2C12肌管胰岛素抵抗模型的建立

棕榈酸诱导的C2C12肌管胰岛素抵抗模型的建立作者：贾章志徐晓阳赵秀峰来源：《当代体育科技》2018年第15期摘要：梯度浓度棕榈酸（Palmitate，PA）孵育的C2C12肌管胰岛素抵抗模型的建立。

研究方法：将分化5天小鼠骨骼肌肌母细胞的肌管用不同浓度的PA培养液孵育16h后，寻找孵育结束后培养液中葡萄糖剩余量比对照组显著高，胰岛素刺激也不能使糖明显吸收，肌管内有明显脂质积累的浓度作为C2C12肌管胰岛素抵抗建立的合适浓度。

研究结果：分化5天的C2C12肌管利用0.5mmol/L的棕榈酸溶液孵育16h，会致胰岛素抵抗的发生。

关键词：C2C12 棕榈酸胰岛素抵抗中图分类号：G80-32 文献标识码：A 文章编号：2095-2813（2018）05（c）-0001-02胰岛素抵抗（ Insulin Resistance，IR）是指一定量的胰岛素与受体结合后生物效应低于正常，表现为外周组织尤其是脂肪、肌肉组织对葡萄糖的摄取障碍及肝葡萄糖输出增多[1]。

国家卫生部统计显示我国新增糖尿病患者绝大多数为2型糖尿病患者。

被认为是2型糖尿病的发病基础的IR，是当今影响人身体健康最主要的代谢性疾病。

随着社会发展、饮食习惯的改变，肥胖人群不断壮大，肥胖和胰岛素抵抗的关系也成为当今研究热点。

大量研究表明，血液中高游离脂肪酸与胰岛素抵抗的发生关系十分密切。

高游离脂肪酸较为敏感的影响着胰岛素抵抗现象，是其发生的主要原因之一[2]。

1 研究材料与方法1.1 研究材料和基本培养方法小鼠骨骼肌肌母细胞株（C2C12细胞）购买于由南方医科大学。

细胞复苏：将细胞从液氮中取出后迅速放入38℃～40℃的水中，快速摇晃使其解冻。

解冻后用酒精对冻存管表面消毒，移入超净工作台，将含有细胞的冻存液吸出移入到60mm培养皿中，加入增殖培养液后混匀，静置5min后转移到恒温培养箱（37℃，5%CO2+95%空气，饱和湿度）。

4h后更换培养液，此后每隔48h换液一次，及时观察细胞生长状态。

棕榈酸对骨骼肌细胞脂质沉积的诱导作用

棕榈酸对骨骼肌细胞脂质沉积的诱导作用

第47卷第6期2021年11月吉林大学学报（医学版）Journal of Jilin University（Medicine Edition）Vol.47No.6Nov.2021DOI：10.13481/j.1671‑587X.20210606棕榈酸对骨骼肌细胞脂质沉积的诱导作用何勇,洪莉,黄国涛,赵芷涵（武汉大学人民医院妇产科，湖北武汉430060）［摘要］目的目的：探讨棕榈酸（PA）对骨骼肌细胞脂质沉积的作用及其最佳作用浓度和时间。

方法：在C2C12细胞生长至70%~80%时分为对照组和不同浓度（50、75、100和125μmol·L－1）PA组。

不同浓度PA组细胞采用含不同浓度PA的生长培养基培养，对照组细胞不给予PA（0μmol·L－1PA）。

CCK-8法检测各组细胞增殖活性，定量检测细胞中甘油三酯（TG）水平，油红O染色观察细胞中脂滴形成情况，2%马血清诱导细胞分化并评价各组C2C12细胞分化状态。

结果结果：与对照组比较，50、75和100μmol·L－1PA组C2C12细胞增殖活性差异无统计学意义（P>0.05），125μmol·L－1PA组C2C12细胞增殖活性明显降低（P<0.01），50、75和100μmol·L－1PA组细胞中TG水平升高（P<0.01），100μmol·L－1PA组C2C12细胞中TG水平升高最明显（P<0.01）；与培养24h比较，100μmol·L－1 PA培养48h后，C2C12细胞中TG水平升高（P<0.01）。

分化培养后，PA组和对照组C2C12细胞中均有较多肌管形成。

结论结论：100μmol·L－1PA作用48h可有效促进C2C12细胞脂质沉积。

［关键词］盆底功能障碍；肥胖；高脂；棕榈酸；脂质沉积［中图分类号］R711.4［文献标志码］AEffect of palmitic acid on induction of lipid deposition inskeletal muscle cellsHE Yong,HONG Li,HUANG Guotao,ZHAO Zhihan（Department of Obstetrics and Gynecology，People’s Hospital，Wuhan University，Wuhan430060，China）ABSTRACT Objective：To explore the effect of palmitic acid（PA）on the lipid deposition in the skeletal muscle cells，and to discuss the optimum action concentration and time.Methods：The C2C12cells were divided into control group and different concentrations（50，75，100，and125μmol·L－1）of PA groups when the C2C12cells grew to70%－80%.The C2C12cells in different concentrations of PA groups were given growth media containing different concentrations of PA，while the C2C12cells in control group were not treated with PA（0μmol·L－1PA）.CCK-8method was used to detect the cell proliferation activities of cells in various groups，the triglyceride（TG）levels in the C2C12cells in various groups were detected，Oil Red O staining was used to observe the formation of lipid droplets in the C2C12cells in various groups，and2% horse serum was used to induce the cell differentiation and evaluate the differentiation of C2C12cells in various groups.Results：Compared with control group，there were no significant differences in the proliferation activities of the C2C12cells in50，75，and100μmol·L－1PA groups（P>0.05），the [文章编号]1671‑587X(2021)06‑1380‑06[收稿日期]2021‑02‑03[基金项目]国家自然科学基金面上项目（81971364，81771562）[作者简介]何勇（1994－），男，湖北省恩施州人，在读硕士研究生，主要从事女性盆底功能障碍性疾病和妇科肿瘤方面的研究。

雷公藤红素在棕榈酸诱导心肌细胞凋亡中的协同作用

雷公藤红素在棕榈酸诱导心肌细胞凋亡中的协同作用

雷公藤红素在棕榈酸诱导心肌细胞凋亡中的协同作用安琪;杨晓松;张雪洁;吴基良【摘要】目的评价雷公藤红素(celastrol,Cel)在棕榈酸诱导心肌细胞凋亡中的协同毒性作用及其可能的机制,为雷公藤红素进入临床实验,降低心脏毒副反应提供理论依据.方法心肌细胞H9C2生长至汇合度达到约80％时,用不同浓度雷公藤红素(100、200、400、800、1600nmol/L)处理或与棕榈酸(PA,0.1 mmol/L)联合作用于心肌细胞H9C2.检测心肌细胞活力、胞内激活型Caspase3以及ROS水平的变化.结果雷公藤红素单独作用H9C2,且浓度在800 nmol/L及以下时,对心肌细胞活力和激活型Caspase3产物没有明显影响(P＞0.05),浓度达到1600nmol/L时,表现出明显毒性作用(P＜0.05).而当雷公藤红素与棕榈酸共同处理时,200nmol/L的雷公藤红素就能够明显下调心肌细胞的活力,增加胞内激活型Caspase3积累,并呈现出雷公藤红素剂量依赖性增加.且联合作用时,ROS含量是雷公藤红素单独作用时的5倍,是棕榈酸单独作用时的3倍,差异有统计学意义(P＜0.05).结论低剂量的雷公藤红素与高脂对心肌细胞存在协同心肌毒性作用,其可能的机制是通过增加胞内的氧化应激反应进一步放大Caspase3信号通路介导的心肌细胞凋亡.【期刊名称】《湖北科技学院学报（医学版）》【年(卷),期】2018(032)002【总页数】6页(P93-97,封2)【关键词】雷公藤红素;高脂;心肌细胞;协同作用;氧化应激【作者】安琪;杨晓松;张雪洁;吴基良【作者单位】湖北科技学院药学院,湖北咸宁437100;湖北科技学院糖尿病心脑血管病变湖北省重点实验室;湖北科技学院糖尿病心脑血管病变湖北省重点实验室;湖北科技学院药学院,湖北咸宁437100;湖北科技学院糖尿病心脑血管病变湖北省重点实验室【正文语种】中文【中图分类】R961目前，肥胖已成全球流行趋势，我国肥胖人口及其增长率已位居世界第一[1]。