p21Haras原核表达载体的构建、表达及纯化的研究

表达载体的构建方法及步骤一、载体的选择及如何阅读质粒图谱目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。

一个合格质粒的组成要素：（1）复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。

原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。

而真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。

（2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+（3）多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段（4）P/E 启动子/增强子（5）Terms 终止信号（6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA 作用选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。

如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。

载体选择主要考虑下述3点：【1】构建DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。

【2】.载体的类型：（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。

如<10kb 选质粒。

（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。

（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。

【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。

综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求：（1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）；（2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。

（3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；（4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。

（5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。

论著??文章编号:1007-8738200505-0557-04BirA酶基因表达载体的构建、原核表达及表达产物的活性鉴定李青吴雄文3熊敏翁秀芳卢小玲梁智辉龚非力华中科技大学同济医学院免疫学系湖北武汉430030收稿日期:2004-08-23修回日期:2004-10-27基金项目:国家自然科学基金资助项目No.30271201国家重点基础研究发展规划973资助课题No.2001CB510008作者简介:李青1975-女湖北蕲春人博士生.3CorrespondingauthorTel:027********Email:Prokaryoticex pressionofBirAenzymeandidentificationofthebioactivityofexpressedproductLIQingWUXi ong2wen3XIONGMinWENGXiu2fangLUXiao2lingLIANGZhi2huiGONGFei2liDepart mentofImmunologyTongjiMedicalCollegeofHuazhongUniversityofSciencesandTechnolo gyWuhan430030ChinaAbstractAIM:Toconstructtheexpressionvectorofbiotin2proteinligaseBirAenzymegeneandexpresst heBirAenzymewithbioactivityinE.coliBL221DE3.METH2ODS:TheBirAgenewasamplifi edfromE.coligenomebyPCRandclonedintopGEX24T22toconstructtherecombi2nantplasmi dpGEX2BirA.AfterbeingverifiedbyDNAse2quencingthefusionproteinwasexpressedunder IPTGin2ductionintheE.coliBL221DE3.TheexpressedproductwaspurifiedthroughGlutathio ne2agarosechromatographycolumn.Theenzymeactivityoftheexpressedproductwasidentifie dbyELISAandWesternblot.RESULTS:There2combinantprokaryoticexpressionvectorpGE X2BirAwasconstructedandthefusionproteinGST2BirAwasexpressedsuccessfully.Theresul tsofELISAandWesternblotshowedthatthepurifiedBirAenzymebiotinylatedHLA2A2peptid ecomplex.CONCLUSION:BirAenzymewithbioactivityispreparedsuccessfullywhichcanbe usedforstudyingtheinteractionbetweenproteinandprotein.Keywords BirAenzymebiotinylationHLA2A2peptidecomplex摘要目的:构建生物素2蛋白连接酶BirA酶基因的表达载体并在大肠杆菌BL221DE3中表达具有生物学活性的BirA 酶。

人B7h基因原核表达载体的构建和表达的开题报告1. 研究背景和意义基因表达载体是生物技术领域中重要的工具，可以用于基因转染、基因治疗和基因编辑等研究方向。

B7-H家族成员是一类共刺激分子，在肿瘤免疫疗法和移植免疫方面有重要作用。

当前，研究B7-H分子的功能和调控机制已成为免疫治疗领域的热点问题之一。

在此背景下，构建一个高效的原核表达载体是必要的。

2. 研究内容和方法（1）选择适合的重组质粒载体。

在构建原核表达载体时，选择适合的质粒非常重要。

根据目的和实验条件，选择pET 系列、pGEX 系列或者 pMAL 系列等重组质粒，同时还要考虑表达宿主菌株和打靶蛋白的产量等因素。

（2）选取适合的宿主菌株。

在原核表达中，一般选择大肠杆菌作为宿主菌株，因为其易于培养和大量生产。

在菌株选取中，还要注意质粒的拷贝数、菌株生长速度和表达产物的稳定性。

（3）扩增目的基因。

获取目的基因需要进行PCR扩增。

在PCR反应中，应根据目的基因的大小、GC含量等因素，合理设置反应体系，同时需要对PCR产物进行分离纯化。

（4）将目的基因克隆到载体中。

构建目的载体需要进行双酶切和连接，通过T4 DNA连接酶、限制酶和琼脂糖凝胶电泳等技术进行原核表达载体的构建。

（5）转染表达宿主菌株。

将构建好的重组质粒转染大肠杆菌中，并通过平板筛选、PCR等方法鉴定获得含有目的基因的表达宿主菌株。

（6）表达和纯化目的蛋白。

在菌株表达达到最优条件时，通过感光性吸附树脂、金属离子亲和树脂、凝胶过滤等不同的分离纯化方法获得目的蛋白。

3. 预期结果通过以上研究内容和方法，预期可以成功构建出一个高效的原核表达载体，实现目的基因在大肠杆菌中的表达。

同时，可以获得表达产物，通过不同的纯化方法获得目的蛋白，为后续的功能研究提供基础支持。

4. 参考文献1. Huang R, et al. B7-H3 and B7-H4 expression in non-small-cell lung cancer. Lung cancer, 2009.2. Huang R, et al. B7-H4 overexpression potentiates immune evasion of cancer cells. Cancer biomedicine, 2014.3. Kretz-Rommel A, et al. B7-H3 and B7-H4 expression in glioblastomas: correlation with tumor proliferation and patient survival. Clinical Cancer Research, 2004.。

原核表达载体构建步骤一、前期准备1. 首先呢，咱们得把要用的材料都找齐喽。

像目的基因啦，原核表达载体还有各种酶，比如说限制性内切酶之类的。

这一步看起来简单，可千万别小瞧它哦！要是少了啥，后面就麻烦了。

我就有次忘记检查有没有足够的载体，结果做到一半才发现，那叫一个懊恼啊！2. 对了，关于目的基因，你得确定它的序列是正确的。

这一点真的很重要，真的！我通常会再检查一次，毕竟如果基因序列错了，后面做的可能都是白搭。

你是不是也担心这个问题呢？二、载体和目的基因的处理1. 接下来就要处理原核表达载体和目的基因了。

先用限制性内切酶去切割载体和目的基因。

这个过程得小心点儿哦！酶切的条件要设置好，像温度呀、反应时间啥的。

我一般会按照说明书上的推荐值来设置，不过有时候也会根据实际情况微调一下。

这一步其实还蛮关键的，如果酶切不完全，后面连接的时候就容易出岔子。

2. 酶切完之后呢，要对产物进行纯化。

这个纯化的步骤你可以根据自己实验室现有的设备和试剂来选择合适的方法。

我觉得只要能把想要的东西纯出来就行啦，不用太纠结具体用哪种方法。

三、连接反应2. 在这个连接反应进行的时候，要注意反应的环境。

温度要保持稳定，最好放在专门的恒温设备里。

不然的话，连接反应可能就不能很好地进行啦。

这一点大家一定要注意哦！四、转化1. 连接产物弄好之后，就可以进行转化了。

把连接产物导入到感受态细胞里面。

这个感受态细胞的制备也是个重要的事儿。

不过如果你不想自己制备的话，也可以买现成的。

导入的时候呢，要按照操作规程来，可不能马虎。

我记得我刚开始做的时候，就因为没严格按照步骤来，转化效率特别低，那个时候真是欲哭无泪啊。

2. 转化完了之后，要把细胞放到合适的培养基里面培养。

这个培养基的选择也要看你的细胞类型和实验需求哦。

在培养的过程中，要注意观察细胞的生长状态。

如果发现有什么异常，就得想想是不是前面哪个步骤出问题了。

五、筛选阳性克隆1. 等细胞长起来之后，就要开始筛选阳性克隆了。

融合蛋白TAT-HIF-1α-PAS-B原核表达载体的构建、表达及纯化戚华兵;汪仕良;王凤君【期刊名称】《第三军医大学学报》【年(卷),期】2006(28)22【摘要】目的构建蛋白转导结构域TAT和人缺氧诱导因子1αPAS-B结构域融合蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达及纯化。

方法分别构建原核表达质粒pTAT-PAS-B、pET-PAS-B和pTAT-EGFP;在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS内,以IPTG诱导融合蛋白的表达,表达产物经SDS-PAGE及Westernblot分析鉴定,利用镍-亚硝胺乙酸-组氨酸(Ni-NTA-His)亲和层析法对重组蛋白进行纯化。

结果成功构建了PAS-B结构域的原核表达载体,经过优化表达和纯化条件,融合蛋白在IPTG 诱导下获得特异性表达,纯化得到了高纯度的目的蛋白。

结论含人缺氧诱导因子1αPAS-B和TAT结构域融合蛋白的成功表达及纯化,为应用该融合蛋白调控体内HIF-1α的活性奠定了基础。

【总页数】3页(P2213-2215)【关键词】原核表达系统;TAT蛋白转导结构域;缺氧诱导因子1α;PAS—B结构域【作者】戚华兵;汪仕良;王凤君【作者单位】第三军医大学西南医院全军烧伤研究所【正文语种】中文【中图分类】Q503;Q51【相关文献】1.抗凋亡融合蛋白 PTD－Bcl－xL 原核表达载体的构建及表达纯化 [J], 王晓晔;石博妹;王英群;李珣;刘徳玉;李铭;李芳芳;胡传活2.β分泌酶原核表达载体的构建、表达及融合蛋白纯化 [J], 朱爱华;李敬;陆军;钱进;郑元林3.PML-RARα融合基因相关蛋白原核表达载体的构建、表达和纯化 [J], 杜琴;蔡嘉镜;蒋春萍;徐磊;张国元;王东生4.HIV-1 Tat基因重组原核表达载体的构建及融合蛋白的表达纯化与功能鉴定 [J], 邱会平;程晓东;卢春5.含KSHV vIL-6基因原核表达载体的构建及融合蛋白的表达纯化与鉴定 [J], 葛高霞;王平;卢春因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

rhTL1A基因原核表达载体的构建、表达与纯化杨立彬;李树蕾;谭岩;许淑芬;汪军【期刊名称】《吉林大学学报（医学版）》【年(卷),期】2008(034)003【摘要】目的:构建人肿瘤坏死因子样分子1A(TL1A)原核表达质粒并诱导其表达,纯化及鉴定目的蛋白.方法:人HUVECs总RNA经逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增TL1A基因,克隆到pTA2载体,酶切和测序鉴定正确后构建重组原核表达质粒pQE-TL1A,并转化大肠杆菌M15[pREP4].IPTG诱导目的蛋白表达并进行Western blotting鉴定;镍离子亲和层析柱(Ni2+-NTA)纯化靶蛋白.结果:目的基因经酶切其结果与预期相符,测序结果显示目的基因与GenBank登录的序列(登录号AF520785)完全一致;工程化大肠杆菌M15[pREP4]经IPTG诱导表达相对分子质量约22000的目的蛋白;Western blotting鉴定结果显示,重组蛋白能够与抗His 单克隆抗体特异性结合.结论:成功地构建了重组原核表达质粒pQE-TL1A,并纯化获得高纯度重组TL1A蛋白.【总页数】5页(P415-419)【作者】杨立彬;李树蕾;谭岩;许淑芬;汪军【作者单位】吉林大学第一医院中心实验室,吉林长春130021;吉林大学第一医院儿科,吉林长春130021;吉林大学基础医学院组织与胚胎学教研室,吉林长春130021;吉林大学第一医院中心实验室,吉林长春130021;吉林大学第一医院中心实验室,吉林长春130021;吉林大学第一医院检验科,吉林长春130021【正文语种】中文【中图分类】Q785【相关文献】1.烟草新驱动蛋白基因NtTKR原核表达载体的构建、诱导表达及蛋白纯化 [J], 乔慧聪;任向波;吴秀丽;李芬2.PML-RARα融合基因相关蛋白原核表达载体的构建、表达和纯化 [J], 杜琴;蔡嘉镜;蒋春萍;徐磊;张国元;王东生3.人IL-24基因原核表达载体的构建及蛋白的表达纯化 [J], 喻放;杨忠华;范汉东;左振宇4.云红梨1号HY5基因原核表达载体的构建、表达和纯化 [J], 苏俊;陈璐;马伟荣;杨谨;黄兴龙;陈霞;舒群5.APEC毒力基因ygeG的原核表达载体构建、表达纯化及鉴定 [J], 姜楠;郑倩倩;李倩文;涂健;宋祥军;邵颖;刘红梅;祁克宗因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

胸腺肽αl原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达崔雪志;马凤龙;乔彦良;刘焕奇;任庆娜;刘焕珍【期刊名称】《中国农学通报》【年(卷),期】2008(24)7【摘要】构建胸腺肽αl(Thymosinαl,Tαl)基因原核表达载体,并在大肠杆菌BL21中进行表达,为大量获得胸腺肽αl打下基础。

将人工合成的Tαl三串体基因插入到表达载体pET32a后,CaC12法转化大肠杆菌BL21,经氨苄青霉素筛选后用IPTG 诱导表达,SDS-PAGE检测BL21中胸腺肽αl的表达。

大肠杆菌中检测到与目的蛋白相对分子量(31kD)相符的条带。

成功构建了Tαl原核表达载体,该蛋白能在大肠杆菌中表达。

【总页数】4页(P22-25)【关键词】胸腺肽αl;表达载体pET32a;SDS—PAGE【作者】崔雪志;马凤龙;乔彦良;刘焕奇;任庆娜;刘焕珍【作者单位】青岛农业大学动物科技学院;山东信得科技股份有限公司【正文语种】中文【中图分类】S8【相关文献】1.hISO基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达及鉴定 [J], 邵敏;王新颖;刘星;王燕;周鹤峰;葛正龙2.蜘蛛牵引丝蛋白MaSp1原核表达载体构建及其在大肠杆菌中的表达与纯化 [J],乔鑫;王妍;李俊杰;段翠密;王海滨;周瑾;杜芝燕;王常勇;3.蜘蛛牵引丝蛋白MaSp1原核表达载体构建及其在大肠杆菌中的表达与纯化 [J], 乔鑫;王妍;李俊杰;段翠密;王海滨;周瑾;杜芝燕;王常勇4.铜绿假单胞菌外膜蛋白Opr Ⅰ原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达 [J], 刘潇;李文桂;罗广旭5.中介蝮蛇毒纤溶酶基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达 [J], 刘玉芬;于德涵;刘鹏;陈辉;赵文阁因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

PCR产物测序步骤材料：要灭菌的：三种枪头两套，甘油，水，10个50ml小瓶，10个平板，牙签，小量筒，200ml液体和固体LB，1.5，2ml小管很多，几个200ul小管还要准备：Amp/IPTG/X-Gar，pGEM-T Easy载体，连接酶，Eco RⅠ提取质粒试剂（1) STE：0.1 mol/L NaCl；10 mmol/L Tris-Cl（pH 8.0）；1 mmol/L EDTA（pH 8.0），在0.1Mpa压力下蒸汽灭菌20 min，保存于4 ℃。

（也可以不用）（2）SolutionⅠ：50 mmol/L 葡萄糖；25 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）；10 mmol/L EDTA（pH 8.0），保存于4 ℃。

(如配100ml SolutionⅠ可加0.991g葡萄糖，2ml 0.5MEDTA，2.5ml 1M Tris-HCl，95.5ml水)（3）SolutionⅡ：0.2 mol/L NaOH；1％(m/V) SDS，溶液Ⅱ要现用现配，室温下使用。

（这是终浓度，如可配10%SDS 100ml（100ml加10gSDS），1M NaOH 200ml(200ml加8g)。

若配5ml SolutionⅡ可加0.5ml10%SDS，1ml1M NaOH，及3.5ml 水）（4）SolutionⅢ（100ml）：5 mmol/L乙酸钠60.0 mL；11.5 mL 冰乙酸；28.5 mL 水，保存于4 ℃。

（5）TE缓冲液（pH 8.0）：100 mmol/L Tris-Cl（pH 8.0）；10 mmol/L EDTA （pH 8.0）分装后在0.1Mpa压力下蒸汽灭菌20 min，室温保存。

（6）RNA酶A贮存液（10 mg/mL）：100 mg RNase A溶于10 mL含10 mmol/L Tris-Cl（pH 7.5），15 mmol/L NaCl溶液中，于100 ℃煮沸15 min，分装后-20 ℃冻存备用。

原核表达载体pHsaE1αβ的构建和人丙酮酸脱氢酶的表达与
纯化
吴永革;黄昌益;李惟;Ronald Dugglby
【期刊名称】《吉林大学学报（理学版）》
【年(卷),期】2005(43)4
【摘要】以质粒pQE9为原型载体, 将编码hPDH的α和β亚基的cDNA串联克隆到该载体上, 成功地构建了hPDH基因的表达载体pHsaE1αβ. 并在大肠杆菌中表达了hPDH, 通过亲和层析法进行纯化, 对一些生物化学性质进行表征.
【总页数】5页(P533-537)
【作者】吴永革;黄昌益;李惟;Ronald Dugglby
【作者单位】吉林大学,生命科学学院疫苗研究中心,长春,130012;澳大利亚昆士兰大学,生物化学系,布里斯班,QLD,4072;吉林大学,生命科学学院疫苗研究中心,长春,130012;澳大利亚昆士兰大学,生物化学系,布里斯班,QLD,4072
【正文语种】中文
【中图分类】Q782
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1.人B型钠尿肽原核表达载体的构建、表达及蛋白纯化 [J], 许淑芬;刘磊;孙牧男;赵帅;方艳秋;谭岩
2.人快速型肌球蛋白结合蛋白C原核表达载体的构建及表达纯化 [J], 冯利强;刘幸卉;陈荣;曾慧君;黄维一;廖华
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4.人β肌动蛋白基因原核表达载体的构建及其表达和纯化 [J], 宋烨琼;郭靖;徐小洁;李玲;梁迎春;洪甜;纪贝贝;叶棋浓;吕朝晖
5.人野生型S100A10原核表达载体的构建、蛋白表达纯化及鉴定 [J], 王德利;尹显贵;杨华;李赫
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