【资料】酶与蛋白质工程-第4章-基因表达与蛋白质分离纯化汇编

酶工程与蛋白质工程酶工程与蛋白质工程是现代生物技术的重要领域，它们以分子水平为基础，通过基因工程技术来改造酶和蛋白质。

酶工程主要研究酶的结构与功能关系以及酶催化反应机理，以此来优化酶的性质和功能；而蛋白质工程则致力于蛋白质的高表达、纯化和改造，进而实现分子水平的控制和利用。

两者交叉融合，共同应用于工业、医药、环保和食品等各个领域，促进了生物技术的发展和推广。

一、酶工程简介酶是一种生物催化剂，具有极高的选择性和催化效率。

酶工程旨在通过对酶的分子结构和催化机理的研究，优化酶的性质和功能，使其在特定条件下能够更高效地催化反应。

比如，通过改变酶的氨基酸序列，可以实现酶催化活性和稳定性的提高。

再比如，通过引入新的催化中心或变异剂，可以改变酶的底物特异性和反应特性。

这些优化方法可以显著提高酶的效率和选择性，为实现工业生产和科学研究提供了有效手段。

酶工程的具体步骤如下：1. 酶的筛选和分离。

这个步骤是酶工程的基础，通常需要从自然界中分离出能够催化特定反应的酶。

现代酶工程技术一般采用高通量筛选法，通过分子筛、高速离心、色谱法等方法来分离出酶的纯品。

2. 酶的分子结构分析。

这个步骤是为了了解酶的分子结构和功能关系，找到优化方案的基础。

目前，常用的酶的分析方法有X射线晶体学和核磁共振法。

3. 酶的基因工程改造。

通过基因工程技术，改变酶的氨基酸序列和三维结构，使其获得更高的活性和稳定性。

常用的方法有扩展、交换和修饰等方法。

4. 酶的活性和特性检测。

通过活性酶测定、底物特异性、pH和温度对酶催化反应的影响等方法来检测酶的改造效果。

5. 酶的产量提高。

通过使用表达载体、调节生产菌株的生长条件等方法，使酶的产量达到最高。

二、蛋白质工程简介蛋白质工程是将目标蛋白基因从生物体内放大、纯化、定位和表达，以达到高效率和高纯度的目的。

主要应用于药物研发、工业化生产、分子诊断和分子工业等领域，对于制造可溶性蛋白、表达蛋白、纯化蛋白和修饰蛋白等方面都发挥着重要作用。

蛋白质和酶的分离纯化及鉴定蛋白质是生命体中的重要物质基础之一。

从分子水平上认识生命现象，已成为现代生物学发展的主要方向。

要研究蛋白质，首先要得到高度纯化的目的蛋白。

蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质。

要想从成千上万种蛋白质混合物中纯化出目的蛋白，就要根据蛋白质的理化性质不同设计出合理的分离方法。

目前研究为止酶除核酶外本质都是蛋白质，因此酶的分离纯化方法基本是采用蛋白质的分离纯化方法，但是酶的活性受到多种因素的影响，因此酶的分离纯化比一般的蛋白质要求更高。

一、质分离纯化的一般原则1. 原料的选择原则：来源方便，成本低，易操作、安全的原料。

蛋白分布：体液、组织、细胞定位2. 破碎方法：(1) 机械方法：通过机械运动产生的剪切力的作用，使细胞或组织破碎的方法。

如：捣碎法、研磨、匀桨法(2) 物理方法：通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法。

如：反复冻融、渗透压、超声破碎(3) 化学方法：通过各种化学试剂对细胞膜的作用，使细胞破碎的方法.如：甲苯、丙酮、氯仿和非离子型的表面活性剂（Triton和Tween）(4) 酶促法：溶菌酶、蜗牛酶等3. 目的蛋白或酶的特异、快速、精确的定性或定量方法4. 先粗后细，分级分离粗分：将得到的蛋白溶液先利用简单、快速、易处理的方法除去大部分杂蛋白。

如: 盐析、离心、有机溶剂沉淀等。

精制：利用蛋白质性质的差异，采用不同的方法，如:离子交换层析、分子筛、吸附层析、亲和层析、电泳、离心、结晶等方法进一步纯化。

5. 避免蛋白质的变性（pH、适合的温度和缓冲体系等）二、常用的蛋白质的分离纯化技术可以根据各种蛋白质的结构、理化性质不同设计分离方法。

（一）根据蛋白质的溶解度不同进行分离1. 蛋白质盐析蛋白质属于生物大分子之一，分子量从1万至100万之巨，其分子的直径可达1-100nm，为胶粒范围之内。

蛋白质的表面电荷和水化膜是其主要的稳定性因素。

蛋白质与酶的分离与纯化摘要本文主要介绍蛋白质与酶的分离与纯化方法，包括一些常用的技术和步骤。

首先介绍蛋白质和酶的定义和特性，然后探讨蛋白质与酶分离和纯化的重要性。

接着分析了三种常用的分离与纯化方法，包括盐析、层析和电泳。

最后总结了每种方法的特点和适用范围，并对未来的研究方向进行了展望。

1. 引言蛋白质和酶是生物体内最重要的分子之一，参与了生命体的许多重要生物学过程。

为了研究和了解蛋白质和酶的功能和结构，分离和纯化方法至关重要。

2. 蛋白质与酶的定义和特性蛋白质是由氨基酸残基组成的大分子化合物，具有多种功能，如催化反应、传递信号和提供结构支持等。

酶是一类特殊的蛋白质，能够催化生物体内的化学反应。

3. 蛋白质与酶分离和纯化的重要性蛋白质与酶的分离和纯化是研究其功能、结构和性质的基础。

只有纯化后的蛋白质和酶才能够进行进一步的研究和分析。

4. 盐析方法盐析是利用蛋白质和酶与盐的相互作用进行分离的方法。

通过控制溶液中的盐浓度，可以使蛋白质和酶从溶液中沉淀出来。

5. 层析方法层析是利用分离剂在固定的层析材料上进行分离的方法。

根据蛋白质和酶的性质和大小，可以选择不同类型的层析材料进行分离。

6. 电泳方法电泳是利用蛋白质和酶在电场中的迁移率差异进行分离的方法。

根据蛋白质和酶的电荷、大小和形状等特性，可以选择不同类型的电泳方法进行分离与纯化。

7. 方法比较与应用盐析、层析和电泳方法各有其优势和适用范围。

根据具体的实验目的和条件，可以选择合适的方法进行蛋白质与酶的分离与纯化。

8. 未来展望随着科学技术的不断发展，蛋白质与酶的分离与纯化方法也在不断改进和创新。

未来的研究方向包括开发更高效、更精确的方法和技术，以及应用新的纯化剂和材料等。

结论蛋白质与酶的分离与纯化是研究其结构和功能的基础，对于深入理解生物体内重要的生物学过程具有重要意义。

盐析、层析和电泳等方法可以有效地分离和纯化蛋白质与酶，并根据实验的需要选择合适的方法。

实验一、蛋白质的表达、分离、纯化和鉴定第一部分蛋白质的表达、分离、纯化1、目的要求（1）了解克隆基因表达的方法和意义。

（2）了解重组蛋白亲和层析分离纯化的方法。

2、实验原理克隆基因在细胞中表达对理论研究和实验应用都具有重要的意义。

通过表达能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理，同时克隆基因表达出所编码的蛋白质可供作结构与功能的研究。

大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统，其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的80%。

本实验中，携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21中，在37℃，IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸（NTA）使镍离子（Ni2+）固相化的层析介质加以提纯，实为金属熬合亲和层析（MCAC）。

蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。

3、试剂和器材一、试剂[1] LB液体培养基：Trytone 10g, yeast extract 5g, NaCl 10g, 用蒸馏水配至1000mL.[2] 氨苄青霉素：100mg/mL[3] 上样缓冲液：100 mM NaH2PO4, 10 mMTris, 8M Urea, 10 mM2-ME, pH8.0[4] Washing Buffer：100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8 M Urea, pH6.3[5] Elution Buffer:100 mM NaH2PO4, 10 mMTris, 8M Urea, 500 mM Imidazole, pH8.0[6] IPTG二、器材摇床，离心机，层析柱（1′10 cm）4、操作方法一、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导1. 接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白的大肠杆菌BL21菌株于5mL LB液体培养基中（含100ug/mL 氨苄青霉素），37℃震荡培养过夜。

第一章酶的分离提取与纯化1.1离心分离和层析分离1.1.1酶的提取方法离心是利用离心机旋转所产生的的离心力以及物质的沉降系数或浮力密度的差异，进行分离浓缩和提纯生物样品的一种方法。

离心分离时，要根据待分离物质以及杂志的颗粒大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。

1.1.1.1离心机的种类与用途常速离心机，高速离心机，超速离心机1)常速离心机：转速<8000r/min用途：分离细胞、细胞碎片、培养基残渣及粗结晶等较大颗粒2)高速离心机：转速：1~2.5*104r/min用途：分离各种沉淀物、细胞碎片及较大的细胞器3)超速离心机：转速：2.5~12*104r/min用途：用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分子以及细胞器、病毒的分离纯化1.1.1.2离心方法差速离心，密度梯度离心，等密度梯度离心1)差速离心：原理：是采用不同的离心速度和离心时间，是沉降速度不同的颗粒分不分离的方法。

用途：分离沉降系数相差较大的蛋白质分子2)密度梯度离心原理：不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。

常用介质：蔗糖、甘油3)等密度梯度离心：原理：当待分离的不同颗粒的密度范围在离心介质的密度梯度范围内时，不同浮力密度的颗粒在离心力作用下一直移动到与各自浮力密度相等的位置，形成区带。

介质：铯盐1.1.1.3层析分离技术又称色谱技术，是一种物理的分离方法。

利用混合物中的各组分的物理化学性质（分子的大小和形状，分子极性，吸附力，分子亲和力）的不同，使各组分以不同的程度分布在两个相中，其中一个相为固定的（固定相），另一个相则流过固定相（流动相）并使各组分以不同速度一定，从而达到分离根据分离原理分类吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析和亲和层析等1)吸附层析原理：是利用吸附剂对不同物质的吸附力不同，而使混合物中各组分分离的方法。

2)分配层析原理：在一个有两相同时存在的溶剂系统中，根据不同物质的分配系数不同而达到分离目的的一种层析技术。

蛋白质和酶的分离纯化及鉴定蛋白质是生命体中的重要物质基础之一。

从分子水平上认识生命现象，已成为现代生物学发展的主要方向。

要研究蛋白质,首先要得到高度纯化的目的蛋白.蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质.要想从成千上万种蛋白质混合物中纯化出目的蛋白，就要根据蛋白质的理化性质不同设计出合理的分离方法。

目前研究为止酶除核酶外本质都是蛋白质，因此酶的分离纯化方法基本是采用蛋白质的分离纯化方法，但是酶的活性受到多种因素的影响，因此酶的分离纯化比一般的蛋白质要求更高。

一、质分离纯化的一般原则1。

原料的选择原则:来源方便，成本低,易操作、安全的原料。

蛋白分布：体液、组织、细胞定位2. 破碎方法：（1）机械方法：通过机械运动产生的剪切力的作用,使细胞或组织破碎的方法.如：捣碎法、研磨、匀桨法（2）物理方法:通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法.如：反复冻融、渗透压、超声破碎（3）化学方法：通过各种化学试剂对细胞膜的作用,使细胞破碎的方法。

如：甲苯、丙酮、氯仿和非离子型的表面活性剂(Triton和Tween）（4）酶促法：溶菌酶、蜗牛酶等3。

目的蛋白或酶的特异、快速、精确的定性或定量方法4. 先粗后细，分级分离粗分：将得到的蛋白溶液先利用简单、快速、易处理的方法除去大部分杂蛋白。

如: 盐析、离心、有机溶剂沉淀等.精制：利用蛋白质性质的差异，采用不同的方法，如:离子交换层析、分子筛、吸附层析、亲和层析、电泳、离心、结晶等方法进一步纯化。

5。

避免蛋白质的变性（pH、适合的温度和缓冲体系等)二、常用的蛋白质的分离纯化技术可以根据各种蛋白质的结构、理化性质不同设计分离方法。

（一）根据蛋白质的溶解度不同进行分离1。

蛋白质盐析蛋白质属于生物大分子之一,分子量从1万至100万之巨，其分子的直径可达1-100nm，为胶粒范围之内。

蛋白质的表面电荷和水化膜是其主要的稳定性因素.大多数蛋白质都溶于水，在低盐条件下，蛋白的溶解度随着盐浓度的升高而增加，这称为蛋白质的盐溶现象,而盐浓度达到一定以后,蛋白质水化膜被破坏，电荷被中和，蛋白质的溶解度会随着盐浓度的升高而降低，并且析出，这就是盐析现象。