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第3章蛋白质的通性、纯化和表征详解

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蛋白质的通性、纯化与表征

蛋白质的通性、纯化与表征
离子交换层析、吸附层析、亲和层析、疏水层析（反相HPLC）； ④电泳法； ⑤密度梯度离心。
3.1.4 浓缩与保存
结晶方法：使溶液略处于过饱和状态。降低温度、盐析、 加有机溶剂、调节pH等。
冻干粉保存：在冷冻状态下让样品中的液体升华。 溶液保存：加入抗冻剂（50%甘油）后-20~-70℃保存。
3.2 常见蛋白质分离纯化的方法与原理
亲水性有机溶剂加入溶液后降低了介 质的介电常数，使溶质分子之间的静 电引力增加。
水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度，减少了溶 质分子表面原有水化层的厚度，导致溶质分子脱水凝聚。
特点
有机溶剂沉淀法的优点在于其分辨率高于盐析，加入的有机溶 剂易除去，且有机溶剂密度低，利于沉淀物分离。其缺点主要是比 盐析更易使蛋白变性，需低温操作。
• 蛋白质分子的大小：透析、超滤、密度梯度离心、凝胶过滤 • 蛋白质溶解度：盐析、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀 • 蛋白质电荷状况：凝胶电泳、等电聚焦、离子交换层析 • 蛋白质吸附性质：羟基磷灰石吸附层析、疏水作用层析 • 蛋白质生物学亲和性：亲和层析
1）透析和超滤
透析：半透膜阻留pro分子，而让小的溶 质分子（无机盐）和水通过，以达到 除去蛋白质溶液中小分子（盐、低分 子酸，单糖等）。
特定蛋白组分的含量分析： 酶和激素等：酶活性或激素活性表示（比活性） 其它蛋白：抗原抗体反应(western blot)
5.2 纯度鉴定（均一性）
基本手段：电泳分析：单条带。
选用手段：沉降分析、溶解度分析、结晶分析（能结晶的一般 比较纯，具有活性）
本章重点知识
• 蛋白质溶液的酸碱性和等电点的大小主要与什么有关？ • 蛋白质胶体能保持稳定的主要原因。5种蛋白质沉淀方法的主要原理（主要破坏蛋白质胶体

第3章蛋白质的通性

第3章蛋白质的通性

4、可逆变性和不可逆变性： 、可逆变性和不可逆变性： 可逆变性：变性初期， 分子构象未深度破坏 分子构象未深度破坏， 可逆变性：变性初期，Pr分子构象未深度破坏，当除去 变性因素后，还可以恢复原来构象，表现出生物活性， 变性因素后，还可以恢复原来构象，表现出生物活性， 这种变性叫可逆变性。 这种变性叫可逆变性。 不可逆变性： 分子构象被彻底破坏 分子构象被彻底破坏， 不可逆变性：Pr分子构象被彻底破坏，当除去变性因素 后，也不能恢复原来构象，使生物活性彻底丧失，这种 也不能恢复原来构象，使生物活性彻底丧失， 变性叫不可逆变性，多数蛋白质的变性属不可逆变性。 变性叫不可逆变性，多数蛋白质的变性属不可逆变性。 变性蛋白质分子互相凝集为固体的现象称凝固 凝固。 变性蛋白质分子互相凝集为固体的现象称凝固。如煮鸡 做豆腐。 蛋、做豆腐。
一、蛋白质的酸碱性质 2、蛋白质的等电点 Pr COONH2
+H+ +OH-
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
COOPr NH3+
等电点 pH=pI
+H+ +OH-
COOH Pr NH3+
阳离子 pH＜ pH＜pI
阴离子 pH＞ pH＞pI
★蛋白质等电点定义，用pI 表示。 蛋白质等电点定义， 表示。 ★蛋白质在等电点时的特点
蛋白质的pI可在实验室测得， pI可在实验室测得 ★蛋白质的pI可在实验室测得，也与组成蛋白质 的氨基酸种类有关。 的氨基酸种类有关。
三、 蛋白质的沉淀反应
2、有机溶剂沉淀法： 、有机溶剂沉淀法： ★与水互溶的有机溶剂（极性有机溶剂如甲醇、乙醇、丙 与水互溶的有机溶剂（极性有机溶剂如甲醇、乙醇、 有机溶剂如甲醇 能使蛋白质在水中的溶解度降低而沉淀析出。 酮等 ）能使蛋白质在水中的溶解度降低而沉淀析出。 ★有机溶剂能引起蛋白质沉淀主要原因是：加入有机溶剂 有机溶剂能引起蛋白质沉淀主要原因是： 会降低溶液的介电常数； 会降低溶液的介电常数；溶质分子间的作用增加会使蛋 白质分子表面可解离基团的离子化程度减弱，水化程度 白质分子表面可解离基团的离子化程度减弱， 降低，引起蛋白质脱去水化层。 降低，引起蛋白质脱去水化层。 ★用酒精沉淀蛋白质时低温快速沉淀的蛋白质不变性，属 用酒精沉淀蛋白质时低温快速沉淀的蛋白质不变性， 可逆沉淀，室温下用酒精沉淀蛋白质属不可逆沉淀。 可逆沉淀，室温下用酒精沉淀蛋白质属不可逆沉淀。

蛋白质的通性、纯化和表征

蛋白质的通性、纯化和表征

加入样品，待分离物与配基结合 吸附在载体表面，其它分子不被 吸附而流出柱外
用自由配基分子洗脱，蛋白质 从柱上洗脱下来（亲和洗脱） 返回
氮川三乙酸镍（Ni-NTA） 金属亲和层析
Spacer arm ligand His6 tag
样品的浓缩、干燥和保存
常用的浓缩方法：
蒸发浓缩（如空气流动蒸发浓缩 ）
第五节
蛋白质的通性、纯化和表征
一、蛋白质的通性
（一）蛋白质的酸碱性质
蛋白质是两性电解质。 可解离集团主要来自侧链上的功能团。
蛋白质的等电点（一般在4.6-6.7之间）
应用：
利用蛋白质在pI溶解度最小 --- pI沉淀法 利用各种蛋白质pI不同 --- 电泳法、离子交换层析法
Table1-4
Tyr及蛋白质定性
二、蛋白质的分离提纯
选材
一般原则
前处理 粗分级 细分级
层析 盐析 等电点沉淀 有机溶剂分级沉淀 凝胶过滤 离子交换层析 亲和层析
电泳
脱盐、浓缩、干燥和保存
选材：
生物原料：植物、动物器官与组织、微生物。
选择生物原料的原则：
富含所要纯化的蛋白质、 容易获取与处理
前处理
机械方法：研磨法、组织捣碎法、匀浆器破碎法
f / f0＝1.0 f / f0 1.0 分子近球形 分子不对称，值越大，不对称程度越高
（三）蛋白质的胶体性质与蛋白质沉淀
1. 蛋白质是亲水胶体（hydrophilic colloid） 水化层与双电层使蛋白质成为稳定的亲水胶体。 2. 蛋白质的 体的稳定性而使其沉淀。
沉淀法（如盐析法）
超滤法 吸收法（实验室中最常用的吸收剂有 聚乙二醇、蔗糖、甘油等 ）

【资料】蛋白质的通性纯化和表征详解汇编共41页

【资料】蛋白质的通性纯化和表征详解汇编共41页

16、业余生活要有意义，不要越轨。——华盛顿 17、一个人使已登上顶峰，也仍要自强不息。——罗素·贝克 18、最大的挑战和突破在于用人，而用人最大的突破在于信任人。——马云 19、自己活着，就是为了使别人过得更美好。——雷锋 20、要掌握书，莫被书掌握；要为生而读，莫为读而生。——布尔沃
END
【资料】蛋白质的通性纯化和表征详 解汇编
51、没有哪个社会可以制订一部永远 适用的 宪法， 甚至一 条永远 适用的 法律。 ——杰 斐逊 52、法律源于人的自卫本能。——英 格索尔
53、人们通常会发现，法律就是这样 一种的 网，触 犯法律 的人， 小的可 以穿网 而过， 大的可 以破网 而出， 只有中 等的才 会坠入 网中。 ——申 斯通 54、法律就是法律它是一座雄伟的大 夏，庇 护着我 们大家 ；它的 每一块 砖石都 垒在另 一块砖 石上。 ——高 尔斯华 绥 55、今天的法律未必明天仍是法律。 ——罗·伯顿

第三章蛋白质分离纯化与表征

第三章蛋白质分离纯化与表征

超滤
• 超滤是一种膜分离技术，它的特点是使用不对 称多孔膜，根据分子的大小来分离溶液中的大 分子物质与小分子物质。超滤尤其适用于大分 子溶液的浓缩，不同种类分子的纯化以及溶剂 交换等。超滤法是一种温和的、非变性的物理 分离方法。
超滤离心管
切向流超滤器
离心技术
• 离心技术主要用于各种生物样品的分离和制备，生物 样品悬浮液在高速旋转下，由于巨大的离心力作用， 使悬浮的微小颗粒（细胞器、生物大分子的沉淀等） 以一定的速度沉降，从而与溶液得以分离，而沉降速 度取决于颗粒的质量、大小和密度。 • 密度梯度离心技术是利用每种蛋白质颗粒沉降到与自 身密度相等的密度梯度时即停止不前，最后各种蛋白 质在离心管中被分离成各自的区带。 • 常用的密度梯度有蔗糖梯度，聚蔗糖梯度等。
1. 抗体
• 抗体的制备
免疫荧光技术
• 免疫荧光技术是是将抗原抗体反应的特异性与荧光物质检测的敏 感性和直观性结合起来的一种方法。其基本原理为： • 利用荧光素标记抗体，使之在涂片上或组织切片上与标本中的待 检抗原特异结合，采用高发光效率的点光源，透过滤色板发出一 定波长的光，使结合在标本上的荧光素被激发而产生荧光，借助 荧光显微镜观察底物片上荧光染色形态，来判断有无待检抗原或 抗体。
原理：依赖于蛋白质和它的配体（ligand）之间 的相互作用来分离。配体通常指的是能与另一 个分子或原子结合（一般是非共价结合）的分 子、基团、离子或原子。但在亲和层析中，配 体是通过共价键先与基质结合。配体可以是酶 结合的一个反应物或产物，或是一种可以识别 靶蛋白的抗体，也可以是受体、核酸、细胞器 等。 亲和层析是分离效率最高的分离方法。
高效液相层析（HPLC）
• 高效液相色谱的优点是：检测的分辨率和灵敏 度高，分析速度快，重复性好，定量精度高， 应用范围广。适用于分析高沸点、大分子、强 极性、热稳定性差的化合物。 • 其缺点是：价格昂贵，要用各种填料柱，容量 小，分析生物大分子和无机离子困难，流动相 消耗大且有毒性的居多。目前的发展趋势是向 生物化学和药物分析及制备型倾斜。

第三章 蛋白质的通性、纯化与表征

第三章 蛋白质的通性、纯化与表征

加高浓度盐类（盐析）： ）：加盐使蛋白质沉淀 1. 加高浓度盐类（盐析）：加盐使蛋白质沉淀 析出。 析出。 分段盐析：调节盐浓度， 分段盐析：调节盐浓度，可使混合蛋白质溶 液中的几种蛋白质分段析出。 液中的几种蛋白质分段析出。血清球蛋白 饱和度），清蛋白（ ），清蛋白 （50%(NH4)2SO4饱和度），清蛋白（饱和 (NH4)2SO4)。 2. 加有机溶剂 3. 加重金属盐 4. 加生物碱试剂 单宁酸、苦味酸、钼酸、钨酸、 单宁酸、苦味酸、钼酸、钨酸、三氯乙酸能 沉淀生物碱，称生物碱试剂。 沉淀生物碱，称生物碱试剂。
米伦反应
—OH
Tyr
黄色反应 乙醛酸反应 (Hopking-Cole 反 应lteu 反应) 茚三酮反应
黄色、橘 色 紫色
Tyr、Phe Trp
N
红色 胍基 Arg
碱性CuSO4 及磷 钨酸-钼酸 茚三酮
蓝色
酚基、吲哚基
Tyr
蓝色
自由氨基及羧基
α-氨基酸
5、蛋白质的紫外吸收
• 大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨 酪氨酸和色氨酸。 酸、酪氨酸和色氨酸。 • 这三种氨基酸的在280nm 附近有最大吸 这三种氨基酸的在280nm 因此，大多数蛋白质在280nm 收。因此，大多数蛋白质在280nm 附近 显示强的吸收。 显示强的吸收。 • 利用这个性质，可以对蛋白质进行定性 利用这个性质， 鉴定。 鉴定。 • 初步定量，若精细定量用考马斯亮蓝染 初步定量， 色
电泳
蛋白质在等 电点pH pH条件 电点pH条件 下，不发生 电泳现象。 电泳现象。 利用蛋白质 的电泳现象， 的电泳现象， 可以将蛋白 质进行分离 纯化。 纯化。
自由界面电泳： 1. 自由界面电泳：蛋白质溶于缓冲液中进 行电泳。 行电泳。 2.区带电泳： 2.区带电泳：将蛋白质溶液点在浸了缓冲 区带电泳 液的支持物上进行电泳， 液的支持物上进行电泳，不同组分形成 带状区域。 带状区域。 纸上电泳：用滤纸作支持物。 （1）纸上电泳：用滤纸作支持物。 凝胶电泳：用凝胶（淀粉、琼脂糖、 （2）凝胶电泳：用凝胶（淀粉、琼脂糖、 聚丙烯酰胺）作支持物。 聚丙烯酰胺）作支持物。 （3）双向电泳

第3章 蛋白质的通性、纯化和表征

第3章 蛋白质的通性、纯化和表征

蛋白质的等电点
电荷性质的判断 等电点时溶解度最小
蛋白质的等离子点：在无盐类干扰情况下， 蛋白质的等离子点：在无盐类干扰情况下，一种
蛋白质的质子供体基团解离出来的质子数与质子受体基 团结合的质子数相等时的pH是它的真正等电点 是它的真正等电点， 团结合的质子数相等时的pH是它的真正等电点，称为等 离子点。 离子点。 它是蛋白质的特征常数。 它是蛋白质的特征常数。
P37
④ 高效液相层析
（High-Performance liquid chromatography , HPLC） ）
• 也分为凝胶过滤层析、离子交换层析和 也分为凝胶过滤层析、 亲和层析等 • 特点：固定相支持剂颗粒细 特点： • 采取高压，洗脱速度增大 采取高压，
P38
6 电泳 (Electrophoresis)
P33
介质：凝胶颗粒（多孔的网状结构） 介质：凝胶颗粒（多孔的网状结构） 交联度或孔度（网孔大小） 交联度或孔度（网孔大小）——凝胶的分级 凝胶的分级 分离范围 交联葡聚糖——Sephadex G-50（1500-30000） ） 琼脂糖 ——Sepharose或Bio-Gel A 或 聚丙烯酰胺——Bio-Gel P
P37
氨基酸的定性定量
茚三酮反应： 茚三酮反应： 生成紫色物质 脯氨酸和羟脯氨酸生成黄色物质
③ 亲和层析 (Affinity chromatography )
根据蛋白质与特异的配体相互作用来分离的。 根据蛋白质与特异的配体相互作用来分离的。 蛋白质与特异的配体相互作用来分离的
蛋白质 ＋ 配体 蛋白质配体复合物
5.2 层析的分类
按流动相：气相、液相色谱等； 按流动相：气相、液相色谱等； 按操作形式不同：纸层析、薄层层析、 按操作形式不同：纸层析、薄层层析、柱层 析等； 析等； 按分离机制：凝胶层析、离子交换层析、 按分离机制：凝胶层析、离子交换层析、亲 和层析、吸附层析等。 和层析、吸附层析等。

第3章 蛋白质的分离、纯化和表征

第3章 蛋白质的分离、纯化和表征

三、蛋白质分离纯化的一般原则
总目标：增加制品纯度或比活 总目标： 1.前处理：因动/植物/ 1.前处理：因动/植物/细菌而异 前处理 2.粗分级分离：采用盐析/等电点沉淀/ 2.粗分级分离：采用盐析/等电点沉淀/有 粗分级分离 机溶剂分级分离等方法 3.细分级分离：采用凝胶过滤、 3.细分级分离：采用凝胶过滤、离子交换 细分级分离 层析、 层析、吸附层析以及亲和层析等 4.结晶 4.结晶
盐析（（NH4）2SO4）
盐析
• 向蛋白质溶液中加入大量硫酸铵后蛋白质 会沉淀析出 • 原因？ 原因？
蛋白质脱去水化层而聚集沉淀
2.有机溶剂沉淀 2.有机溶剂沉淀 脱去水化层以及降低介电常数而增 加带电质点间的相互作用
3.等电点沉淀 3.等电点沉淀
4.重金属盐沉淀 4.重金属盐沉淀 与带负电荷蛋白质结成不溶性盐 5.生物碱试剂和某些酸类沉淀 5.生物碱试剂和某些酸类沉淀 与带正电荷蛋白质生成不溶性盐 6.加热变性沉淀 6.加热变性沉淀 天然结构解体，疏水基外露， 天然结构解体，疏水基外露， 破坏水化层及带电状态
沉降系数 S
见书P40 见书P40
蛋白质的沉降系数S 蛋白质的沉降系数S与相对分子 Mr的关系 量Mr的关系 斯维得贝格方程
蛋白质的含量测定与纯度测定
（一）蛋白质的含量测定 1．双缩脲法 ． 双缩脲试剂：称取1.5g CuSO4· 5H2O和6g酒 双缩脲试剂：称取 和 酒 石酸钾钠溶于500ml水中，在不断搅拌下，加 水中，在不断搅拌下， 石酸钾钠溶于 水中 入300ml 10% NaOH，稀释至 ，稀释至1000ml。 。 3ml蛋白质溶液加 蛋白质溶液加2ml双缩脲试剂 ， 540nm 双缩脲试剂， 蛋白质溶液加 双缩脲试剂 比色。 比色。 2．紫外吸收法 ． 280nm比色 ， 测定后蛋白质溶液还能回收 ， 比色， 比色 测定后蛋白质溶液还能回收， 操作简便，但精确度不高。 操作简便，但精确度不高。

第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2

第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2

③ SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法
原理： 蛋白质所带电荷和大小不同，在电场中的泳
动速度各异。 电泳系统中加入SDS和少量巯基乙醇，则蛋 白质的泳动速度主要取决于分子量而与蛋白 质本身的电荷无关。 加入SDS和少量巯基乙醇破坏了蛋白质的原 有的高级结构，有四级结构的蛋白质也都解 离为亚基，且蛋白质都变为椭圆状，并带上 大量的负电荷，电荷的多少只与蛋白质多肽 链的分子大小成正比。
超速离心机
60000~80000 转/分 重力60万～ 80万倍
蔗糖浓度
蔗糖密度梯度
蛋白质的沉淀作用
蛋白质沉淀的概念：蛋白质分子
聚集而从溶液中析出的现象。
蛋白质的沉淀作用
等电点沉淀法 中性盐析沉淀反应 有机溶剂沉淀反应 加热沉淀反应 重金属盐沉淀反应 生物碱试剂沉淀反应
由于蛋白质的分子量很大，它在水中能够形成
胶体溶液。 胶体溶液的性质，如丁达尔现象、布郎运动、 电泳现象、不能通过半透膜等。 蛋白质胶体稳定的因素：具有水化层，非等电 点时带电荷； 应用： 利用透析法或超过滤法可纯化蛋白质：将非 蛋白质的小分子物质除去， 破坏蛋白质胶体的稳定的因素，可以将蛋白 质分离
互溶的有机溶剂，由于这些溶剂与水 的亲和力强，能够破坏蛋白质的水化 层，使蛋白质的溶解度降低而沉淀。 常用的有机溶剂有乙醇、甲醇和丙酮 等。 为了防止蛋白质在分离过程中发生变 性，有机溶剂浓度不能太高(30%-50%)， 而且需要在低温条件下进行。
3.加热沉淀反应
加热可以使蛋白质变性，常常可导
蛋白质的电泳迁移率与其分子量的对数呈
线性关系。 电泳迁移率= 蛋白质移动距离/示踪小 分子移动距离。 用已知分子量的蛋白质制得标准曲线，在 同样条件下测出未知蛋白质的迁移率即可 从标准曲线上求得近似分子量。 对有四级结构的蛋白质，该法测的是蛋白 质亚基的分子量。
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（三） 根据电荷性质的差异
1、电泳法


电泳：带电荷的蛋白质或核酸分子在电场中移动的现象称为电泳。
带正电荷向负极泳动，而带负电荷向正极泳动，分子量小的蛋白质 泳动快，分子量大的泳动慢，于是蛋白质被分离。
影响因素 ①电荷、粒子的大小和溶液的粘本原理 ： 以聚丙烯酰胺凝胶为支持物，根据被分离物质所 带电荷的多少、分子形状、分子大小的不同， 在电场的作用下产生不同的移动速度而分离的 方法。 聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和交联剂甲叉双 丙烯酰胺在催化剂和加速剂的作用下聚合而成。 网状的大小决定于单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯 酰胺的浓度及两者的比例。
SDS(sodium dodecyl sulfate)


若果在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入SDS ，SDS是一种阴离子表面活 性剂， 几乎能破坏蛋白质中所有的非共价键，从而使多亚基蛋白 质解聚，并使多肽链呈伸展状态，消除了蛋白质形状对迁移率的影 响； SDS能以1:2比例与肽链中的氨基酸残基结合，使变性蛋白质带上大 量的净负电荷，多肽链上带的负电荷量远超过蛋白质分子原有的电 荷量，因而掩盖了不同蛋白质间原有的电荷差别，结果所有的 SDS—蛋白质复合物，电泳时都以几乎同样的电荷质量比向正极移 动并具有相同的构象，所以同一电泳条件下，分子量成为决定蛋白 质泳动速率的唯一因素。分子量越大，受到阻力越大，泳动越慢。
透析法：将样品装在 透析袋里，半透膜 阻留pr分子，而让 小的溶质分子和水 通过，以达到除去 蛋白质溶液中小分 子（盐、低分子酸 等）。
超过滤法：施以一定的压力强迫 小分子物质通过半透膜，而 按半透膜的筛孔大小截留相 应的蛋白质分子。
②凝胶过滤法（分子筛层析法）
凝胶过滤常用的介质：
在层析柱内装填带有小孔的凝胶颗粒。
④生物碱试剂和某些酸类沉淀法：pH小于pI时，蛋白质带正电荷，易与生物 碱试剂和酸类的负离子生成不溶性沉淀。生物碱试剂：单宁酸、苦味酸、 钨酸。酸类：三氯乙酸、磺基水杨酸； ⑤加热变性沉淀法。
三、蛋白质分离纯化的一般原则

纯化的实质：增加制品的纯度或比活性

一般程序：前处理、粗分级分离、细分级分离、结晶保 存
交联葡聚糖（Sephadex，是由葡聚糖与环氧氯丙烷 交联形成的有三维空间的网状结构物）。
聚丙烯酰胺凝胶 琼脂糖凝胶
凝胶过滤的原理
（二）根据溶解度差异的分离法
蛋白质的盐溶与盐析 盐溶：是指在适当的中性盐浓度溶液中，蛋白质溶解度会提高的现象， 称盐溶。 盐析：向蛋白质溶液中加入大量中性盐（高盐浓度）时，会破坏蛋白 质分子表面的水化层（即破坏了蛋白质在水溶液的稳定性因素）导 致蛋白质的溶解度降低发生沉淀析出，称盐析。 常用的饱和硫酸铵沉淀法分离纯化蛋白质就是利用盐析的原理，不同 的蛋白质对饱和硫酸铵的要求不同，所以，可以通过饱和硫酸铵的 分级沉淀法分离各种蛋白质。
2、 沉淀蛋白质的方法
①盐析法: 大量的中性盐（（NH4）2SO4、Na2SO4、NaCl），使蛋白质脱去 水化层而聚集沉淀；不引起变性。 ②有机溶剂沉淀法： 破坏水化膜，降低介电常数，丙酮、乙醇等； ③重金属盐沉淀： pH＞pI 时，蛋白质颗粒带负电荷，与重金属离子（ Hg2+. Pb2+. Cu2+ 等）结成不溶性沉淀；
4、结晶（晶体保存）
结晶过程本身也伴随着一定程度的提纯。能否结晶不仅是纯度 的一个 指标，也是判断制品是否有活性的指标。纯度越高，溶液越浓，越 容易结晶。 结晶方法：使溶液略处于过饱和状态。降低温度、盐析、加有机溶剂、 调节pH。
四、 蛋白质的分离纯化方法
（一）根据分子大小的差异
①透析和超过滤法：都是利用蛋白质不能通过半透 膜 的性质除去样品中的小分子非蛋白物质
③如果提取膜蛋白：超声波或去污剂使膜解聚，然后用适当的介质提取。
2、粗分级分离（rough fractionation)
一般用选择性沉淀法。 ①（NH4）2SO4分级沉淀法（盐析） ②等电点选择性沉淀法 ③有机溶剂分级沉淀法
3、细分级分离（fine fractionation) )
★层析法：凝胶过滤层析、离子交换层析、吸附层析、亲 和层析、疏水层析（反相HPLC） ★电泳法：自由界面电泳、区带电泳（凝胶电泳、滤纸和 薄膜电泳等）、等电聚焦、双向电泳 ★密度梯度离心
第3章
蛋白质的通性、纯化和表征
一、 蛋白质的酸碱性质和等电点
蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。

等电点：蛋白质所带净电荷为零的pH值称为等电点。
在等电点时，蛋白质在电场中不移动,溶解度最小，粘度
最大。可以用溶解度法，聚焦电泳法等测定等电点。
二、 蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀
蛋白质分子直径在 1-100nm 之间，在水溶液中具有胶体溶液 的通性。 1、 稳定蛋白质胶体溶液的主要因素： ①蛋白质表面极性基团形成的水化膜将蛋白质颗粒彼此隔开， 不会互相碰撞凝聚而沉淀； ②两性电解质非等电状态时，带同种电荷，构成稳定的双电 层，互相排斥不致聚集沉淀。 由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应 用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。 一旦电荷被中和或水化膜被破坏，蛋白质颗粒聚集，便从 溶液中析出沉淀。
前 处 理
生物组织
破碎、溶 解、差速离心
无细胞提取液
粗 分 离
选择性沉淀法
电泳
细 分 离
离子交 换层析
凝胶 过滤
亲和 层析
疏水 层析
吸附 层析
精制后的蛋白质
1、前处理（pretreatment）： ①将组织和细胞破碎 动物组织和细胞：电动捣碎机 、匀浆器、超声波处理； 植物组织和细胞：石英砂+提取液研磨或用纤维素酶处理； 细菌：超声波震荡、与砂研磨、高压挤压、溶菌酶处理（分解肽聚糖） ②如果所要蛋白质集中在某一细胞组分，用差速离心法收集细胞的某一组 分（表7－5）；
3.等电聚焦
（1）基本原理
根据蛋白质分子的等电点进行分离。利用这种技术分离蛋白质混合物 是在具有pH梯度的介质中进行，在外加电场作用下，各种蛋白质 将移向并聚集（停留）在等于其等电点的pH梯度处，并形成一个 很窄的区带。