日本刺参胶原肽对B16黑素瘤细胞黑素合成的影响
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日本刺参胶原肽对B16黑素瘤细胞黑素合成的影响王 奕，王静凤，张 瑾，崔凤霞，薛长湖（中国海洋大学食品科学与工程学院，青岛 266003）【摘 要】目的：研究不同分子量日本刺参胶原肽A1（6 000U<Mr<10 000U）、A2（Mr<6 000U）对小鼠B16黑素瘤细胞黑素生成、酪氨酸酶活性及酪氨酸酶基因表达的影响。
方法：采用MTT法测定细胞增殖活性，NaOH裂解法测定黑素生成量，多巴氧化法测定酪氨酸酶活性，逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）测定酪氨酸酶mRNA表达。
结果：不同分子量日本刺参胶原肽均能显著促进B16细胞增殖，抑制B16细胞黑素合成和酪氨酸酶活性，下调酪氨酸酶mRNA表达，且剂量效应关系明显。
结论：不同分子量日本刺参胶原肽均具有显著抑制B16黑素瘤细胞黑色合成的作用。
其中，A1的抑制效果较A2显著。
[[营养学报，2007，29（4）：401－404 ]关键词：日本刺参胶原肽；B16黑素瘤细胞；黑素合成；酪氨酸酶活性；mRNA表达中图分类号：R282.77.5 文献标识码：A 文章编号：0512-7955(2007)04-0401-04 EFFECT OF COLLAGEN POLYPEPTIDES FROM APOSTICHOPUS JAPONICUS ONMELANOGENESIS IN B16 MELANOMA CELLSWANG Yi， WANG Jing-feng，ZHANG Jin，CUI Feng-xia，XUE Chang-hu(College of Food Science and Technology, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)【Abstract】 Objective：To study the effects of different molecular weight of collagen polypeptides from Apostichopus japonicus (A1:6 000U <Mr<10 000U, A2: Mr<6 000U) on melanogenesis, trosinase activity and mRNA expression in B16 melanoma cells. Method: Cell proliferation rate was detected by MTT assay, the tyrosinase activity by dopa oxidase assay, the melanin content by NaOH assay, and the mRNA level of tyrosinase by RT-PCR assay. Results:The proliferation rate of B16 cells was stimulated significantly, and melanogenesis, tyrosinase activity were inhibited remarkably, and the tryrosinase mRNA level was decreased evidently in dose dependent manner by both A1 and A2 respectively. Conclusion：Different molecular weight of collagen polypeptides from Apostichopus japonicus can inhibit melanogenesis in B16 melanocytes significantly, A1 better than A2. [ACTA NUTRIMENTA SINICA, 2007, 29(4)：401－404]Key words：collagen polypeptide from Apostichopus japonicus； B16 melanoma cells； melanogenesis；tyrosinase activity； mRNA expression胶原蛋白多肽具有降血压、调血脂、抗氧化、提高免疫力、活化细胞机能和抑制肿瘤活性等作用[1]。
此外，胶原蛋白多肽还具有护肤功效。
津田友香等[2]从鱼皮中得到水解胶原三肽，并证明具有促进人皮肤成纤维细胞胶原和透明质酸的生成、改善皮肤弹性的作用。
Matsuda等[3]报道用胶收稿日期：2006-11-03基金项目：国家自然科学基金(No.30471319)；新世纪优秀人才支持计划项目（No.NCET-04-0642）作者简介：王奕（1982－），女，硕士研究生, E-mail：yiwang0504@；通讯作者, 薛长湖，教授，博士生导师原蛋白多肽灌胃猪62 d(0.2 g/kg bw),能显著提高猪真皮内纤维原细胞的密度，促进胶原纤维原的形成和提高硫酸皮肤素的含量。
山田英幸[4]研究证实丝胶肽能抑制酪氨酸酶活性从而抑制皮肤黑素合成。
海参是海洋中重要的食物和药物资源，含有海参多糖、海参皂苷、胶原多肽等多种生物活性物质，具有抗肿瘤、抗衰老和降血脂等多种生理功效[5],但目前有关其对皮肤的功效及作用机制少有报道。
本研究以日本刺参为研究对象，利用酶工程技术，制备了日本刺参胶原蛋白多肽，探讨其对B16黑素瘤细胞黑素合成、酪氨酸酶活性及酪氨酸酶mRNA表达的影响，为海参深加工及其综合利用提供科学依据。
1 材 料 与 方 法1.1 材料1.1.1 小鼠B16黑素瘤细胞株：山东省医学科学院细胞生物学研究所提供，于RPMI-1640培养液（含10%小牛血清，105U/L青霉素，105µg/L链霉素）,37 ℃、5% CO2孵箱中培养，每3 d 传代一次。
1.1.2 主要药品和仪器：酶标仪（Bio-Rad），CO2培养箱（Heraeus）， PCR热循环仪（Eppendorf mastercycle），凝胶灰度扫描仪（UVP）；RPMI-1640培养基、小牛血清、Trizol、反转录试剂盒Superscript II（Gibco）；Triton-100、MTT （Amresco），L-Dopa（Sigma），MMLV 逆转录酶、RNasin 抑制剂、Taq 酶(Promega)，其余试剂均为国产分析纯。
1.2 方法1.2.1 日本刺参胶原肽的制备：称取干参50 g，60℃水发2 d，每天换水4～5次，再于500 ml 乙醇中40℃下连续浸提，每天更换新鲜乙醇，最后于常温下晾干。
取一定量的处理刺参在适宜酶解条件下反应4 h（风味酶与底物比为1:4、pH6.5、温度45℃），煮沸5 min灭酶活,迅速冷却至室温，5 000 r/min离心30 min，上清液加乙醇沉淀过夜。
离心后，上清液依次用截留分子量为10 000U 和6 000U的超滤膜进行超滤处理，得到不同分子量的海参胶原多肽酶解液（A1：6 000U＜ Mr ＜ 10 000U，A2：Mr＜6000U）。
40℃旋转挥发、浓缩，冻干得粉末。
A1、A2分别用D-Hanks配成 2 mg/ml母液，过滤除菌、分装，―20℃保存，临用时用培养液调制。
1.2.2 细胞增殖活力测定：取对数生长期的B16细胞,经0.25%胰酶消化, 以RPMI-1640完全培养基配成密度为4×104/ ml的细胞悬液 , 接种于96孔培养板, 200 µl/孔 , 置于37 ℃ 、5%CO2 的培养箱内培养。
贴壁24 h之后, 弃培养液，分别加入含A1、A2（浓度为6.25、12.5、25、50、100 µg/ml）的完全培养液， 对照组加等体积的完全培养基。
每孔200 µl, 每一浓度设4个复孔,分别培养24 h和48h。
MTT法于酶标仪570 nm 处测定吸光度（A）值，以A值表示细胞增殖活性。
1.2.3 黑素含量测定：调整细胞浓度至5×105个/ml,接种于6孔板, 每孔2 ml。
贴壁后细胞的处理及培养条件同 1.2.2，每个处理组实验至少重复3次。
48 h后收获、计数细胞，按文献[6]方法并稍作修改， 以含10%DMSO的1 mol/L NaOH 溶液裂解细胞,超声波破碎30min,90℃水浴2 h。
于酶标仪450 nm处测A值，计算细胞黑素合成相对含量。
黑素合成相对含量（%）=[（处理组A值／处理组细 胞密度）／（对照组A值／对照组细胞密度）]×100 1.2.4 酪氨酸酶活性测定：细胞的接种密度、处理、培养条件及收获、计数方法同 1.2.3。
以L-Dopa为反应底物，参见文献[6]方法，酶标仪450nm处测A值（0 min的OD值A1及第10 min 的OD值A2），计算细胞酪氨酸酶相对活性。
酪氨酸酶相对活性(%)=[处理组（A2-A1）/处理组细胞数]/[对照组（A2-A1）/对照组细胞数]×100 1.2.5 酪氨酸酶mRNA表达的测定： 细胞的处理及培养条件同1.2.3。
收获及计数细胞，采用Trizol一步法提取总RNA。
引物设计：β-Actin primer：(+) 5'-TCA GAA GGA CTC CTA TGT GG-3',(-) 5'-TCT CTT TGA TGT CAC GCA CC-3'，预期扩增片段长度500bp；m-Tyr primer：(+) 5'-TTC AAA GGG GTG GAT GAC CG-3'，(-)5'-GAC ACA TAG TAA TGC ATC CG-3'，预期扩增片段长度319bp。
逆转录反应按试剂盒操作说明进行。
PCR反应混合物总体积为25 µl，PCR 优化条件为：94℃ 1 min，54℃ 1 min，72℃ 1 min，35个循环，72℃延伸7 min。
扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳并进行光密度扫描，以β-actin校正作相对量分析。
酪氨酸酶mRNA的相对含量(%) = [处理组（TYR酶/β-actin）A值/空白对照组（TYR酶/β-actin）A值] ×1001.3 统计学处理采用SPSS11.0软件进行单因素方差分析，并以SNK法进行组间比较，P＜0.05为差异显著。
2 结 果2.1 不同分子量日本刺参胶原肽对B16黑素瘤细胞增殖活力的影响（图1）A1、A2均能显著促进B16细胞生长（P＜0.05, P＜0.01），且剂量效应关系明显，表明不同分子量的日本刺参胶原肽对B16黑素瘤细胞均无细胞毒作用。
