结核分枝杆菌(1)
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结核分枝杆菌
耐药性变异：
耐异烟肼及其他抗结核药物的结核菌株日益增多
二、致病性和免疫性
（一）致病物质
1. 脂质：磷脂（phosphatide） 索状因子 (cord factor） 硫酸脑苷脂 (sulfatide) 蜡质 D (wax-D脂质：
磷脂：能促进单核细胞增生,增强菌体蛋白质的 致敏作用,抑制蛋白酶对病灶组织的溶解,形成 干酪样坏死；使炎症中的巨噬细胞转变为类上 皮细胞，从而形成结核结节。
疫功能低下者；艾滋病；肿瘤；用过免疫抑制剂 者。
5. 实际应用
(1) 选择接种BCG对象，了解BCG接种是 否成功
(2) 流行病学调查 (3) 婴幼儿结核病诊断的参考 (4) 细胞免疫功能的测定
四、微生物学检查法
1．采集标本（痰液） 集菌（4g/L NaOH处理15min）
2. 涂片镜检：抗酸染色法 3. 分离培养（罗氏培养基，3-4周） 4. 动物试验（豚鼠） 5. 快速诊断
结核分枝杆菌
(M. tuberculosis)
• 分枝杆菌属的主要特点：
– 直或微弯曲，分枝状生长 – G+,但不易着色:细胞壁含有大量脂质 – 又称抗酸杆菌 (acid-fast bacilli)
常用抗酸染色鉴定，呈抗酸染色阳性
• 分枝杆菌属细菌种类繁多，可分为：
– 结核分枝杆菌 – 牛分枝杆菌 – 麻风分枝杆菌
索状因子：抑制白细胞游走引起慢性肉芽肿。 蜡质D：具有佐剂作用,可激发机体产生迟发型
超敏反应。 硫酸脑苷脂：使细菌在吞噬细胞中长期存活。
2.蛋白质
与蜡质D结合产生迟发型超敏反应,并 引起组织坏死病理过程及全身中毒症状, 促进结核结节形成。
(二)所致疾病
所致疾病
结核病 以肺结核（痨病）常见
耐异烟肼及其他抗结核药物的结核菌株日益增多
二、致病性和免疫性
（一）致病物质
1. 脂质：磷脂（phosphatide） 索状因子 (cord factor） 硫酸脑苷脂 (sulfatide) 蜡质 D (wax-D脂质：
磷脂：能促进单核细胞增生,增强菌体蛋白质的 致敏作用,抑制蛋白酶对病灶组织的溶解,形成 干酪样坏死；使炎症中的巨噬细胞转变为类上 皮细胞，从而形成结核结节。
疫功能低下者；艾滋病；肿瘤；用过免疫抑制剂 者。
5. 实际应用
(1) 选择接种BCG对象，了解BCG接种是 否成功
(2) 流行病学调查 (3) 婴幼儿结核病诊断的参考 (4) 细胞免疫功能的测定
四、微生物学检查法
1．采集标本（痰液） 集菌（4g/L NaOH处理15min）
2. 涂片镜检：抗酸染色法 3. 分离培养（罗氏培养基，3-4周） 4. 动物试验（豚鼠） 5. 快速诊断
结核分枝杆菌
(M. tuberculosis)
• 分枝杆菌属的主要特点：
– 直或微弯曲，分枝状生长 – G+,但不易着色:细胞壁含有大量脂质 – 又称抗酸杆菌 (acid-fast bacilli)
常用抗酸染色鉴定，呈抗酸染色阳性
• 分枝杆菌属细菌种类繁多，可分为：
– 结核分枝杆菌 – 牛分枝杆菌 – 麻风分枝杆菌
索状因子：抑制白细胞游走引起慢性肉芽肿。 蜡质D：具有佐剂作用,可激发机体产生迟发型
超敏反应。 硫酸脑苷脂：使细菌在吞噬细胞中长期存活。
2.蛋白质
与蜡质D结合产生迟发型超敏反应,并 引起组织坏死病理过程及全身中毒症状, 促进结核结节形成。
(二)所致疾病
所致疾病
结核病 以肺结核（痨病）常见
结核病学
结核病学1. 男性，50岁，患肺结核3年曾正规抗结核治疗1年余，但痰菌一直阳性，此病人应考虑为A. 非结核分枝杆菌感染或原发耐药菌感染B. 可能合并重度感染C. 获得耐药菌感染D. 可能合并冠心病E. 无反应性结核病答案：A；患结核3年，而正无偏见治疗无效，可能为非结核分枝杆菌感染当耐药，非结核分枝杆菌的痰菌可以呈假阳性，并且可对抗结核治疗无反应，而原发耐药对于一线抗结核治疗也无效。
获得性耐药是指由于治疗失当造成的耐药。
无反应性结核是机体免疫力极度低下，发生的暴发性结核性败血症，病情危重。
2. 按Runyon分类法，在非结核分枝杆菌中，属Ⅲ型不产色分枝杆菌是A. 鸟胞内分枝杆菌复合群B. 瘰疬分枝杆菌C. 堪萨斯分枝杆菌D. 龟分枝杆菌E. 马尔摩分枝杆菌答案：A3. 肺结核的化学治疗需坚持联合用药的原则，其目的在于A. 延缓或防止耐药性的产生，发挥药物的协同作用B. 提高血药浓度C. 减少药物的副反应D. 减少复发E. 减少传染性，保护结核病接触者答案：A4. 结核菌素皮肤试验中的助强效应，即第一次PPD皮试阴性者，1～2周复试时则呈现阳性反应，其可能机制是A. 机体免疫反应低下B. PPD作为致敏原，使T淋巴细胞致敏C. PPD作为抗原第二次进入机体诱导体液免疫反应D. PPD第二次进入，增强机体的免疫回忆反应E. PPD第二次进入，诱导树突状细胞的活化答案：D；助强试验阳性的意义在于以前曾经感染结核的患者，随着时间的推移，免疫反应逐渐减弱，其主要原因在于免疫回忆反应的下降。
在助强试验时，第二次PPD进入增强了机体的免疫回忆反应，因而出现皮试阳性。
5. 抗结核药物中具有高度灭菌活性的药物为A. RFP、PZAB. INH、RFPC. SM、INHD. PZA、EMBE. INH、PZA答案：A；抗结核菌药物的作用最强者为INH，次强者为RFP。
但是INH对于胞内的作用很差。
PZA则对于胞内菌具有强大的杀菌作用。
结核分枝杆菌
结核病预防
• 发现和治疗痰菌阳性者 • 新生儿接种卡介苗
结核分枝杆菌核酸检测
• PCR-荧光探针法
• 操作简便，快速高效，重复性好，具有很 高的灵敏性和特异性，能大大提高结核分 枝杆菌的检出率 • 精确定量检测，为临床治疗效果提供参考
• 肺部感染 - 原发感染 多发生于儿童 原发综合性 形成结核结节（即结核肉芽肿） - 原发后感染（继发性结核） • 肺外感染 - 部分患者结核分枝杆菌可进入血液循环引起肺内、外播散，如 脑、肾结核
- 痰菌被咽入消化道或食入了消毒不严格的牛奶也可引起肠结核、 结核性腹膜炎等
- 大多与结核分枝杆菌L型有关
结核分支杆菌
结核分枝杆菌
• • • • • 俗称结核杆菌，引起人类结核病 致病菌主要为人结核分枝杆菌和牛分支杆菌 世界上约1/3人感染，约70%在亚洲 世界防治结核病日：3月24日 致病物质：荚膜、脂质、蛋白质
所致疾病
• 感染方式 呼吸道、消化道或皮肤损伤等多途径侵入 机体 •
结核分枝杆菌的鉴定要点
结核分枝杆菌的鉴定要点结核分枝杆菌是一种引起结核病的病原体，它有着很高的致病性和感染性。
为了正确认识和鉴定结核分枝杆菌，以下是一些重要的鉴定要点：1. 镜检-结核分枝杆菌可以通过显微镜下观察到。
使用酸性染色法，如抗酸染色和荧光染色可以使细菌显现出红色（抗酸染色）或绿色（荧光染色）。
2. 培养-分枝杆菌在固体或液体培养基上生长缓慢，通常需要2-6周的时间才能形成可见的菌落。
固体培养基上的菌落呈干燥而扁平的形态，有橘黄色的色素。
液体培养基上的培养物通常呈黄绿色或橙黄色。
培养时应该注意对临床样本进行适当的稀释以避免过多的其他细菌的干扰。
3. 生化鉴定-利用一系列特殊的生化试剂，可以鉴定结核分枝杆菌的生化反应。
这些试剂包括硝基硝酸盐、尼龙红、呋喃四羧酸等。
结核分枝杆菌在这些试剂的作用下具有独特的反应形式，可以通过观察颜色变化或者气体产生等判断。
4. 分子生物学鉴定-利用PCR（聚合酶链式反应）及其变体技术，可以对结核分枝杆菌的特定基因进行检测和鉴定。
这些特定基因包括IS6110序列和16S rRNA基因等。
分子生物学鉴定方法通过特定的引物和核酸杂交可以迅速、准确地确认分枝杆菌的存在。
5. 药敏试验-由于结核分枝杆菌对抗结核药物的敏感性存在变异，药敏试验可以帮助确定分枝杆菌的抗药性。
该试验通过将分枝杆菌分离株培养在含有不同抗结核药物浓度的培养基上，观察菌落的生长情况，从而确定其对抗结核药物的敏感性。
总之，结核分枝杆菌的鉴定是一项复杂而关键的工作。
通过镜检、培养、生化鉴定、分子生物学鉴定和药敏试验等多种方法的综合应用，可以准确、快速地确定结核分枝杆菌的存在及其特性，为结核病的诊断和治疗提供有力的依据。
结核分枝杆菌
实养法、分子生物 学方法、免疫学方法和噬菌体法。 痰涂片直接镜检是检测抗酸杆菌（AFB）最普遍 的实验室诊断方法，特异性较高，但灵敏性较低， 涂片中分枝杆菌要达到103-104cfu/ml才可检测出 阳性结果，且仅能检出1/2—3/4的活动性结核患 者，漏检率相当高 。
罗氏（LÖwenstein Jensen）培养法是目前检测 MTB的“金标准”，但其检测周期长（8周）， 导致无法及时确诊结核患者，并无法及时治疗； 新近发展起来并广泛使用的快培检测技术无疑大 大缩短了检测周期，但确诊仍需2-3周，依然无 法实现结核病快速诊疗； 基于免疫学的检测方法快速，操作简单，成本低 廉，但灵敏度有限； 基于核酸扩增的检测方法快速、准确，但成本高 昂、技术要求高，难以在发展中国家常规实验室 中广泛开展。
分枝杆菌属
1982年，Robert Koch首次发现结核分枝杆菌为 结核病德致病菌。在微生物分类上，分枝杆菌归 属原核生物界，厚壁菌门，放线菌目，分枝杆菌 科，分枝杆菌属。 临床将分枝杆菌分为结核分枝杆菌，非结核分枝 杆菌，麻风杆菌及腐物寄生性分枝杆菌。
致病性
肺结核是一种因感染结核分枝杆菌（MTB）， 偶尔为牛分枝杆菌，非洲分枝杆菌而引发的传染 病，在低收入地区发病率相对较高。据WHO统 计，全球约1/3的人口感染MTB，每年新增患者 900万，并有300万人死于该病。
结核分枝杆菌
结核分枝杆菌L型的研究进展临床1班 王小蕾 90301136结构严谨，内容翔实，但缺少英文文献是为憾事9分细菌L型，即细菌细胞壁缺陷型，是指细菌细胞壁的肽聚糖结构受到理化或生物因素的直接破坏或合成被抑制，而能够继续生长和分裂的菌株。
[1]1935年klieneberger首先从念珠状链杆菌的菌落中发现，并以她工作的Lister研究院命名为“L型”。
迄今为止, 几乎所有的细菌、螺旋体和真菌中都发现L 型的存在。
[2]结核分枝杆菌L型的发现实际上要早于细菌L型概念的提出。
1908年，Much在结核性冷性脓肿、浆液性渗出液、淋巴结和痰液中发现了结核分枝杆菌非抗酸染色的微小颗粒样异常,被后人称为Much 颗粒。
一般认为, Much 颗粒是结核杆菌的非耐酸性细胞, 有感染豚鼠并发育成正常抗酸杆菌的能力。
有人认为Much粒可能是个体发育过程中的一个阶段。
结核杆菌L型主要有三种形态：球菌相、颗粒相和滤过相。
球菌相: 1936年由Steenken发现，杆菌在某些因素作用下,失去细胞壁成分而形成球状体。
球状相结核菌由双层质膜包裹, 原生质中核糖体丰富, 间体消失。
在适宜条件下可以发生返祖。
颗粒相:即Much颗粒。
滤过相: Khomenko 于1991 年发现，是形态小于常杆菌20 倍的超小型结核杆菌,具有电子致密的外壳和很低的蛋白含量,可以通过除菌滤膜,并可在宿主体内持续存在。
[3]随着研究工作的开展，对结核分枝杆菌L型的研究逐渐深入，该菌与一些疾病的关系也逐渐明朗，现将结核分枝杆菌L型的产生原因、生物学特性、致病性和检查、治疗方法方面的进展综述如下：一、结核分枝杆菌L型的诱导产生结核分枝杆菌既可以体外诱导产生也可以在患者体内产生。
已知的诱导剂及其作用机制概括起来有: (1) 使细菌细胞突变, 如物理因素的紫外线, 化学因素的人胆汁, 尿素, 微量元素铁、锌、镁。
(2) 干扰细菌细胞壁的合成, 如氨基酸类的甘氨酸、蛋氨酸、苏氨酸等, 抗菌药物如青霉素、先锋霉素、万古霉素、异烟肼、链霉素、环丝氨酸等。
结核分枝杆菌
硬结径小于0.5cm。
问题讨论：
如果一个成年人的结核菌素试验阳性， 他一定就是结核病人吗？
应用
➢选择BCG接种对象及测定接种效果，结核菌素 反应阴性者应接种BCG；
➢ 结核菌素试验对婴幼儿可做诊断结核病之用； ➢ 可在未接种BCG的人群中作结核分枝杆菌感染
的流行病学调查； ➢可借用其测定肿瘤病人的细胞免疫功能。
干酪样坏死 肺
结核结节
局部病变发生快 不易扩散
特点：成人多见，病变发生快。有特异性 பைடு நூலகம்疫，病变不易扩散。
肺外感染：
➢进入血液循环引起肺外播散，如 脑、肾、肠、腹腔等
➢大多与结核分枝杆菌L型有关
三、免疫性与超敏反应
免疫性（三个“同时”）
结核病病人发病时机体： 同时有结核分枝杆菌的感染 同时有抗结核的细胞免疫 同时有迟发型超敏反应（Ⅳ型变态反应）
结核分枝杆菌
结核分枝杆菌的发现
结核分枝杆菌是结核病的病原菌，俗名结 核杆菌。
肺结核俗称“肺痨”，是一个古老的疾 病。在几千年前的埃及、印度等文明古国的 文献里就有结核病记载，世界各国的文学经 典作品中也有描述。
1882年3月24日，德国人科霍（Koch）在 柏林生理学会宣布发现结核分枝杆菌，距今 已有124年，结核病这种“白色瘟疫”仍在严 重地威胁人类的健康。
➢生长缓慢，14～18h分裂1次，在固体培养基 上2～5w才出现肉眼可见的菌落。（懒）
➢典型菌落为粗糙型，表面干燥呈颗粒状，不 透明，乳白色或淡黄色，如菜花样。（丑）
抵抗力（四怕、四不怕）
✓四怕 –乙醇 –湿热 –紫外线 –抗痨药物
✓四不怕 –干燥 –酸或碱 –碱性染料 –青霉素等抗生素
注意：
1ml痰液中含有10万个结核分枝杆菌， 在干燥的环境里可以存活6-8个月，能 保持良好的传染性8-10天，据报道：1 个开放性肺结核病人每年可以传播1213人。
问题讨论：
如果一个成年人的结核菌素试验阳性， 他一定就是结核病人吗？
应用
➢选择BCG接种对象及测定接种效果，结核菌素 反应阴性者应接种BCG；
➢ 结核菌素试验对婴幼儿可做诊断结核病之用； ➢ 可在未接种BCG的人群中作结核分枝杆菌感染
的流行病学调查； ➢可借用其测定肿瘤病人的细胞免疫功能。
干酪样坏死 肺
结核结节
局部病变发生快 不易扩散
特点：成人多见，病变发生快。有特异性 பைடு நூலகம்疫，病变不易扩散。
肺外感染：
➢进入血液循环引起肺外播散，如 脑、肾、肠、腹腔等
➢大多与结核分枝杆菌L型有关
三、免疫性与超敏反应
免疫性（三个“同时”）
结核病病人发病时机体： 同时有结核分枝杆菌的感染 同时有抗结核的细胞免疫 同时有迟发型超敏反应（Ⅳ型变态反应）
结核分枝杆菌
结核分枝杆菌的发现
结核分枝杆菌是结核病的病原菌，俗名结 核杆菌。
肺结核俗称“肺痨”，是一个古老的疾 病。在几千年前的埃及、印度等文明古国的 文献里就有结核病记载，世界各国的文学经 典作品中也有描述。
1882年3月24日，德国人科霍（Koch）在 柏林生理学会宣布发现结核分枝杆菌，距今 已有124年，结核病这种“白色瘟疫”仍在严 重地威胁人类的健康。
➢生长缓慢，14～18h分裂1次，在固体培养基 上2～5w才出现肉眼可见的菌落。（懒）
➢典型菌落为粗糙型，表面干燥呈颗粒状，不 透明，乳白色或淡黄色，如菜花样。（丑）
抵抗力（四怕、四不怕）
✓四怕 –乙醇 –湿热 –紫外线 –抗痨药物
✓四不怕 –干燥 –酸或碱 –碱性染料 –青霉素等抗生素
注意：
1ml痰液中含有10万个结核分枝杆菌， 在干燥的环境里可以存活6-8个月，能 保持良好的传染性8-10天，据报道：1 个开放性肺结核病人每年可以传播1213人。
结核分枝杆菌实验室检测方法
基于rpoB（利福平）和katG/inhA（异烟肼）的基因突变，对耐多药结核病做出快速诊断。
高会霞等，五种结核病实验室检测方法对结核病诊断价值的效果评价.实用检验医师杂志，2012，4（3）：157-160.
五种结核检测方法效果评价
结核组：1260例
非结核组：100例
改良罗氏培养
荧光PCR
涂片法
萋尼染色法—红色—普通显微镜（高倍）
3
涂片镜检--抗酸染色
联染法：敏感性高，特异性好，速度快！
敏感性差，一般1mL痰中有5000-10000条菌时可检出，而培养可检出>10-100条菌.
04
不能区分活菌和死菌
抗酸染色对分枝杆菌非特异，其他如Nocardia（奴卡）、Rhodococcus（红球菌属）、Legionella micdadei（军团菌）、cryptosporidium（隐孢子虫）、Isospora（等孢球虫）等有抗酸菌特点
1
结核分枝杆菌属于缓慢生长分支杆菌
2
结核分枝杆菌群
偶发分枝杆菌、龟分枝杆菌龟/脓肿、胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌、戈登分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、偶然分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、浅黄分枝杆菌、土分枝杆菌、草分枝杆菌、不产色分枝杆菌、海-溃疡分枝杆菌、金色分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌等
偶发分枝杆菌、龟分枝杆菌龟亚种、龟分枝杆菌脓肿亚种属于迅速生长型，鸡蛋培养基上3-5天可见菌落
发光二极管荧光显微镜（LED）
结核菌培养仍是目前诊断的金标准．尤其是药敏试验结果在指导临床用药及耐药性检测等方面具有重要作用, 是鉴定是否为活菌的可靠方法．
传统的固态培养法 需要4～6周才能检测到结核菌的生长．而且阳性率也只有30％-40％；特异性差．各种分枝杆菌均可生长。要确定是否为结核菌．需结合分枝杆菌菌种鉴定和药物敏感性试验。
高会霞等，五种结核病实验室检测方法对结核病诊断价值的效果评价.实用检验医师杂志，2012，4（3）：157-160.
五种结核检测方法效果评价
结核组：1260例
非结核组：100例
改良罗氏培养
荧光PCR
涂片法
萋尼染色法—红色—普通显微镜（高倍）
3
涂片镜检--抗酸染色
联染法：敏感性高，特异性好，速度快！
敏感性差，一般1mL痰中有5000-10000条菌时可检出，而培养可检出>10-100条菌.
04
不能区分活菌和死菌
抗酸染色对分枝杆菌非特异，其他如Nocardia（奴卡）、Rhodococcus（红球菌属）、Legionella micdadei（军团菌）、cryptosporidium（隐孢子虫）、Isospora（等孢球虫）等有抗酸菌特点
1
结核分枝杆菌属于缓慢生长分支杆菌
2
结核分枝杆菌群
偶发分枝杆菌、龟分枝杆菌龟/脓肿、胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌、戈登分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、偶然分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、浅黄分枝杆菌、土分枝杆菌、草分枝杆菌、不产色分枝杆菌、海-溃疡分枝杆菌、金色分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌等
偶发分枝杆菌、龟分枝杆菌龟亚种、龟分枝杆菌脓肿亚种属于迅速生长型，鸡蛋培养基上3-5天可见菌落
发光二极管荧光显微镜（LED）
结核菌培养仍是目前诊断的金标准．尤其是药敏试验结果在指导临床用药及耐药性检测等方面具有重要作用, 是鉴定是否为活菌的可靠方法．
传统的固态培养法 需要4～6周才能检测到结核菌的生长．而且阳性率也只有30％-40％；特异性差．各种分枝杆菌均可生长。要确定是否为结核菌．需结合分枝杆菌菌种鉴定和药物敏感性试验。
14 结核分枝杆菌
第十四章 分枝杆菌属
分枝杆菌属（Mycobacterium）是一类细长 略弯曲的杆菌，因有分枝生长趋势而得名。
本属细菌的主要特点是细胞壁含有大量脂 质，主要是分枝菌酸（mycolic acid），占细胞 壁干重的60%。
分枝杆菌属可分为结核分枝杆菌复合群， 非结核分枝杆菌，麻风分枝杆菌三类。
结核病是一种古老的疾病。从新石器时代 人类的遗骨和古代木乃伊的骨关节的病理 组织中，已发现人类在史前时代已患过结 核病。
合成烟酸 硝酸盐还原 热触酶 触酶
人结核分枝杆菌 +
+
_
+
牛结核分枝杆菌 _
_
_
+
非结核分枝杆菌
+
+
安徽医科大学微生物学教研室
19
4. 抵 抗 力：
对某些理化因素抵抗力较强
1）抗 干 燥：干痰中可存活6～8个月； 2）抗酸、碱：
在3％HCl、6％H2SO4或4％NaOH溶液中能 耐受30min，因而常以酸碱处理严重污染的样本， 杀死杂菌和消化粘稠物质，以提高检出率。 3）抗 染 料：
二、致病性
1、致 病 物 质
1）脂质（Lipid）： 占菌体干重20～40%，占细胞壁干重60%，
脂质含量与结核分枝杆菌的毒力呈平行关系，含 量愈高毒力愈强。
①索状因子→破坏细胞线粒体膜，影响细胞 呼吸，抑制白细胞游走及引起慢性肉芽肿。
结核分枝杆菌的索状生长
② 磷 脂：
能刺激单核细胞增生， 并可抑制蛋白酶的分解作 用，使病灶组织溶解不完 全，形成结核结节和干酪 样坏死。
德国科学家Robert Koch
在1882年发现了一种特 殊的微生物—结核杆菌， 结核病的致病细菌。他还 证明了这种微生物是可以 在培养基里培养出来的。 这一发现使得结核的实验 研究成为现实。
分枝杆菌属（Mycobacterium）是一类细长 略弯曲的杆菌，因有分枝生长趋势而得名。
本属细菌的主要特点是细胞壁含有大量脂 质，主要是分枝菌酸（mycolic acid），占细胞 壁干重的60%。
分枝杆菌属可分为结核分枝杆菌复合群， 非结核分枝杆菌，麻风分枝杆菌三类。
结核病是一种古老的疾病。从新石器时代 人类的遗骨和古代木乃伊的骨关节的病理 组织中，已发现人类在史前时代已患过结 核病。
合成烟酸 硝酸盐还原 热触酶 触酶
人结核分枝杆菌 +
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_
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牛结核分枝杆菌 _
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非结核分枝杆菌
+
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安徽医科大学微生物学教研室
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4. 抵 抗 力：
对某些理化因素抵抗力较强
1）抗 干 燥：干痰中可存活6～8个月； 2）抗酸、碱：
在3％HCl、6％H2SO4或4％NaOH溶液中能 耐受30min，因而常以酸碱处理严重污染的样本， 杀死杂菌和消化粘稠物质，以提高检出率。 3）抗 染 料：
二、致病性
1、致 病 物 质
1）脂质（Lipid）： 占菌体干重20～40%，占细胞壁干重60%，
脂质含量与结核分枝杆菌的毒力呈平行关系，含 量愈高毒力愈强。
①索状因子→破坏细胞线粒体膜，影响细胞 呼吸，抑制白细胞游走及引起慢性肉芽肿。
结核分枝杆菌的索状生长
② 磷 脂：
能刺激单核细胞增生， 并可抑制蛋白酶的分解作 用，使病灶组织溶解不完 全，形成结核结节和干酪 样坏死。
德国科学家Robert Koch
在1882年发现了一种特 殊的微生物—结核杆菌， 结核病的致病细菌。他还 证明了这种微生物是可以 在培养基里培养出来的。 这一发现使得结核的实验 研究成为现实。
结核分枝杆菌 GroEL1蛋白过表达的生理效应分析
结核分枝杆菌 GroEL1蛋白过表达的生理效应分析郝珂威;张鹭;何磊;刘丹;秦正松;王洪海【摘要】为研究结核分枝杆菌热休克蛋白GroEL1在耻垢分枝杆菌中过表达所引发的生理效应，本实验采用透射电子显微镜观察细菌个体形态，并绘制细菌群体生长曲线；药敏试验检测重组耻垢分枝杆菌的药物耐受性；细菌攻毒BALB/c小鼠以检测细菌在体内的存活能力；通过病理切片观察细菌毒力。
结果显示，GroEL过表达细菌菌体内核糖体数量显著增加，细菌生长分裂能力及群体适应能力提高，但对常用的一线、二线抗结核药物耐受性无影响。
GroEL1过表达有助于延长细菌在宿主体内的生存周期，增强细菌毒力。
结果提示，结核分枝杆菌GroEL1蛋白过表达会对细菌体内、体外生长产生明显影响。
%The purpose of the current study is to investigate the in vivo and in vitro impacts of Mycobacterium tuberculosis GroEL1 overexpression in Mycobacterium smegmatis(M .smegmatis) .Bacterial morphological changes were observed using transmission electron microscope (TEM ) , and bacterial population growth curve was plotted . Drug susceptibility of recombinant M . smegmatis was assayed using serial dilution . BALB/c mice infected by recombinantM .smegmatis were used as model to detect bacterial viability in vivo and virulence changes related to GroEL1 overexpression .As GroEL1 overexpressed ,the detected level of bacterial ribosome increased significantly , as did the population growth and adaptive capacity . The resistance to commonly used first-line and second-line anti-tuberculosis drugs did not change . The results showed that overexpression of GroEL1could help M . smegmatis extend life cycle in hosts ,and enhance bacterial virulence ,with a significant impact on growth of bacteria in vivo or in vitro .【期刊名称】《微生物与感染》【年(卷),期】2014(000)001【总页数】7页(P14-20)【关键词】结核分枝杆菌;GroEL1;生存能力;毒力;药敏试验【作者】郝珂威;张鹭;何磊;刘丹;秦正松;王洪海【作者单位】复旦大学生命科学学院遗传学研究所遗传工程国家重点实验室，上海200433;复旦大学生命科学学院遗传学研究所遗传工程国家重点实验室，上海200433;复旦大学附属华山医院感染科，上海200040;上海中医药大学病原生物学教研室，上海201203;复旦大学生命科学学院遗传学研究所遗传工程国家重点实验室，上海200433;复旦大学生命科学学院遗传学研究所遗传工程国家重点实验室，上海200433【正文语种】中文GroEL蛋白是热休克蛋白60(heat shock protein 60，HSP60)的类似物，在生物体内帮助折叠10%～15%的细胞内蛋白[1,2]，尤其是在新生蛋白质的正确折叠和组装及变性蛋白质的恢复过程中起重要作用。
结核菌素试验名词解释微生物
结核菌素试验名词解释微生物
结核菌素试验是一种常用的诊断方法,用于检测患者是否感染了结核分枝杆菌(PPNG)。
下面是对结核菌素试验的名词解释和相关扩展:
1. 结核分枝杆菌(PPNG)
结核分枝杆菌是一种革兰氏阴性杆菌,是结核分枝杆菌分枝杆菌复合群中的一种。
这种细菌可以引起结核病,包括结核分枝杆菌性肺炎、肺结核和淋巴结核等。
PPNG是指患者感染了结核分枝杆菌后,细菌在肺部或其他部位的寄存状态。
寄存场所可以是肺、淋巴结、骨骼、关节、皮肤等。
2. 结核菌素
结核菌素是一种合成的抗生素,可以杀死结核分枝杆菌和其他一些细菌。
结核菌素试验通常通过注射一定剂量的结核菌素,观察患者是否出现症状,如发热、咳嗽、乏力等。
如果患者出现症状,说明他们感染了结核分枝杆菌。
3. 抗结核药物
抗结核药物是用于治疗结核病的药物,包括异烟肼、利福平、乙胺丁醇等。
抗结核药物可以杀死结核分枝杆菌,并缓解结核病的症状。
使用抗结核药物需要遵循医生的建议和处方,以确保安全和有效。
4. 试验结果
结核菌素试验的结果通常使用标准曲线来表示,标准曲线是由已知的正常样本制成的。
根据标准曲线,可以计算出患者是否感染了结核分枝杆菌,以及感染的程度。
试验结果通常使用滴度(d值)来表示,滴度越高,说明感染越严重。
5. 微生物学
微生物学是研究微生物的学科,包括细菌、病毒、真菌等微生物。
微生物学
可以帮助我们了解微生物的特性、结构和行为,以及如何用于治疗微生物感染。
结核菌分枝杆菌涂片抗酸染色
查体：T 37.8℃，P 86次／分，R 20次／分，BP120／ 80mmHg。 一般状况无明显异常，无皮疹，浅表淋巴结无肿大， 巩膜无黄染，咽（－）、气管居中。右上肺叩诊稍浊，语 颤稍增强，可闻及支气管肺泡呼吸音和少量湿性啰音，心 腹检查未见异常。 实验室检查：Hb130g／L，WBC 9.0×109／L，N 68%，L 32%，PLT l38×109／L，ESR 35mm／h；尿 常规（－），粪便常规（－），PPD试验强阳性。
病案分析：
病例摘要：男性，30岁，技师，因低热伴咳嗽1个月来诊。 患者于1个月前受凉后出现低热，下午明显，体温最高不 超过38℃。咳嗽，咳少量白色粘痰，无咯血和胸痛，自认为 感冒，服用各种抗感冒药和止咳药，无明显好转，因工作忙 未去医院检查，但逐渐乏力，工作力不从心，有时伴夜间盗 汗。病后进食和睡眠稍差，体重稍有下降（具体未测量）， 二便正常。 既往体健，无结核和支气管、肺疾患史，无药物过敏史。 平时不吸烟，有肺结核接触史。
一、概述
肺结核：结核分枝杆菌入侵人体后在
一定条件下引起的肺部慢性传染病。
结核分枝杆菌可侵及多个脏器，以肺部受累 形成肺结核最为常见。
二、结核病在人群中的传播
1. 2. 3. 4. 5. 传染源：排菌肺结核病人的痰 传播途径：带菌雾滴传播飞沫感染 易感人群 影响传染性的因素 化疗对结核病传染性的影响
成人如用1/10000 0.1ml（1结素单位） 强阳性，表示体内有活动性结核病灶； 阴性提示未受结核菌感染，或感染在4 ～ 8周内 机体变态反应尚未建立； 无反应，可在一周后再用5结素单位皮试，若仍 为阴性，则大多数可除外结核菌感染。
（三）其他检查
血常规 血沉 血清结核菌抗体 纤维支气管镜 浅表淋巴结活检
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• 致敏淋巴细胞可产生多种淋巴因子，如IL-2、 IL-6、INF- α，他们与TNF-α的共同作用可 杀死病灶中的结核分枝杆菌。淋巴因子中INFα是主要的，有多种细胞能产生INF- α，浸润 的先后为NK、Ts/Th和CD4+、CD8+α/βT细 胞。上述细胞有的可直接杀伤靶细胞，有的产 生淋巴因子激活巨噬细胞，使吞噬作用加强引 起呼吸暴发，导致活性氧中介物和活性氮中介 物的产生而将病菌杀死。
菌阴结核
• 三次涂片及一次培养阴性的肺结核，诊 断标准：①典型临床症状和胸部x线表现； ②抗结核治疗有效；③临床可排除其他 非结核性肺部疾患；④PPD强阳性，结 核抗体阳性；⑤痰结核菌PCR和探针检 测阳性；⑥肺外组织病理证实结核病变； ⑦支气管肺泡灌洗液检出分枝杆菌；⑧ 支气管或肺部组织病理证实结核病变。 具备①～⑥中3项或⑦、⑧中1项可确诊。
• 故结核标本用4% NaOH消化时，一般 细菌很快杀死，但结核分枝杆菌可耐受 数十分钟。结核分枝杆菌入侵后荚膜还 可抑制吞噬体与溶酶体的融合。
脂质
• 据实验研究细菌毒力可能与其所含复杂的脂质 成分有关，特别是糖脂更为重要。 • ①索状因子 ： 是分枝菌酸和海藻糖结合的一 种糖脂。能使细菌在液体培养基中呈蜿蜒索状 排列。此因子与结核分枝杆菌毒力密切相关。 它能破坏细胞线粒体膜，影响细胞呼吸，抑制 白细胞游走和引起慢性肉芽肿。若将其从细菌 中提出，则细菌丧失毒力。 • ②磷脂：能促使单核细胞增生，并使炎症灶中 的巨噬细胞转变为类上皮细胞，从而形成结核 结节。
• 结核的免疫属于感染免疫(infection immunity)，又称有菌免疫，即只有当 结核分枝杆菌或其组分存在体内时才有 免疫力。一旦体内的结核分枝杆菌或其 组分全部消失，免疫也随之不存在。 • 随着机体对结核分枝杆菌产生保护作用 的同时，也可以看到有迟发型超敏反应 的产生，二者均为T细胞介导。
• 2.试验方法与意义：常规试验分别取2种PPD 5个单位注射两前臂皮内，48～72h后: 硬结≤4mm者为阴性； 5-9mm为弱阳性； 10-19mm为阳性； ≥20mm或虽＜20mm，但局部出现水 泡和淋巴管炎，为强阳性。 若PPD-C侧红肿大于BCG-PPD侧为感染。反 之，BCG-PPD侧大于PPD-C侧，可能系卡介 苗接种所致。
浓缩集菌
• 先集菌后检查，可提高检出率。培养与动物试 验也必须经集菌过程以除去杂菌。脑脊液和胸、 腹水无杂菌，可直接离心沉淀集菌。痰、支气 管灌洗液、尿、粪等污染标本需经4% NaOH （痰和碱的比例为1:4,尿、支气管灌洗液和碱 的比例为1:1）处理15min，时间过长易使结 核分枝杆菌L型与非结核分枝杆菌死亡。尿标 本先加5% 鞣酸、5% 乙酸各0.5ml于锥形量 筒内静置，取沉淀物处理。处理后的材料再离 心沉淀。取沉淀物作涂片染色镜检。若需进一 步作培养或动物接种，应先用酸中和后再离心 沉淀。
• 常用的有罗氏 （LowensteinJensen）固体培养基， 内含蛋黄、甘油、马铃薯、 无机盐和孔雀绿等。孔雀 绿可抑制杂菌生长，便于 分离和长期培养。蛋黄含 脂质生长因子，能刺激生 长。根据接种菌多少，一 般2～4周可见菌落生长。 菌落呈颗粒、结节或花菜 状，乳白色或米黄色，不 透明。
抵抗力
• 近来研究表明结核分枝杆菌诱导机体产 生免疫和超敏反应的物质不同。超敏反 应主要由结核菌素蛋白和蜡质Ｄ共同引 起，而免疫则由结核分枝杆菌核糖体 RNA引起。二种不同抗原成分激活不同 的T细胞亚群释放出不同的淋巴因子所致。
结核菌素试验
• 结核菌素试验是应用结核菌素进行皮肤试验来 测定机体对结核分枝杆菌是否能引起超敏反应 的一种试验。 1.结核菌素试剂：旧结核菌素：系将结核分枝 杆菌接种于甘油肉汤培养基，培养4～8周后加 热浓缩过滤制成。稀释2 000倍，每0.1ml含 5u。目前都用纯蛋白衍化物，PPD有二种： 人结核分枝杆菌制成的PPD-C和卡介苗制成的 BCG-PPD。每0.1ml含5u。 •
• 阴性反应表明未感染过结核分枝杆菌， 但应考虑以下情况： ①感染初期，因结核分枝杆菌感染后 需4周以上才能出现超敏反应 ②老年人 ③严重结核患者或患有其他传染病， 如麻疹，水痘导致的细胞免疫低下 ④获得性细胞免疫低下，如艾滋病或 肿瘤等用过免疫抑制剂者。
涂片法
• 抗酸杆菌（－）：连续观察300视野未 发现； • 抗酸杆菌（±）：连续观察300视野发 现1-3条; • 抗酸杆菌（1＋）：1-9条/100视野 • 抗酸杆菌（2＋）：1-9条/10视野 • 抗酸杆菌（3＋）：1-9条/1视野 • 抗酸杆菌（4＋）：≥10条/1视野
培养
• 罗氏培养基，一般需2-6周，阳性结果随 时报告，8周无菌生长，报为阴性结果， 阳性结果按生长菌落占斜面1/4,1/2,3/4 和全部划分1+到4+
快速诊断
• 一般涂片检查菌数需5x103～4/ml,培养需 1x102/ml,标本中菌数少于此数时不易获得阳 性结果，且培养需时较长。目前已将多聚酶链 反应（PCR）扩增技术应用于结核分枝杆菌 DNA鉴定，每ml中只需含几个细菌即可获得 阳性，且1-2d得出结果。操作中需注意实验器 材的污染问题，以免出现假阳性。细菌L型由 于缺壁并有代偿性细胞膜增厚，而一般常用的 溶菌酶不能使细胞膜破裂释出DNA，以致造 成PCR假阴性。用组织磨碎器充分研磨使细胞 破裂后，则可出现阳性。
• 结核分枝杆菌细胞壁中含有脂质，故对乙醇敏 感，在70%乙醇中2min死亡。此外，脂质可 防止菌体水分丢失，故对干燥的抵抗力特别强。 粘附在尘埃上保持传染性8～10d，在干燥痰 内可存活6～8个月。结核分枝杆菌对湿热敏感， 在液体中加紫外线敏感。直接日光照 射数小时可被杀死，可用于结核患者衣服、书 籍等的消毒。
• ③硫酸脑苷脂：可抑制吞噬细胞中吞噬 体与溶酶体的结合，使结核分枝杆菌能 在吞噬细胞中长期存活。 • ④蜡质D:是一种肽糖脂和分枝菌酸的复 合物，可从有毒株或卡介苗中用甲醇提 出，具有佐剂作用，可激发机体产生迟 发型超敏反应。
蛋白质
• 有抗原性，和蜡质D结合后能使机体发生 超敏反应，引起组织坏死和全身中毒症 状，并在形成结核结节中发挥一定作用。
一、 生物学性状
• 形态与染色 结核分枝 杆菌为细长略带弯曲的 杆菌，大小1～ 4X0.4m。牛分枝杆菌 则比较粗短。分枝杆菌 属的细菌细胞壁脂质含 量较高，约占干重的 60%，特别是有大量分 枝菌酸包围在肽聚糖层 的外面，可影响染料的 穿入。
分群（Mitchson假说）
• A菌群：快速繁殖， 巨噬细胞外和肺空洞 干酪液化部分； • B菌群：半静止状态， 巨噬细胞内和空洞璧 坏死组织中； • C菌群：半静止状态， 可突然间歇生长。 • D菌群：休眠状态， 不繁殖，数量很少。
• 结核分枝杆菌不产生内、外毒素。其致 病性可能与细菌在组织细胞内大量繁殖 引起的炎症，菌体成分和代谢物质的毒 性以及机体对菌体成分产生的免疫损伤 有关。 • 致病物质与荚膜、脂质和蛋白质有关。
荚膜
• 荚膜的主要成分为多糖，部分脂质和蛋 白质。其对结核分枝杆菌的作用有： • ①荚膜能与吞噬细胞表面的补体受体3结 合，有助于结核分枝杆菌在宿主细胞上 的粘附与入侵； • ②荚膜中有多种酶可降解宿主组织中的 大分子物质，供入侵的结核分枝杆菌繁 殖所需的营养； • ③荚膜能防止宿主的有害物质进入结核 分枝杆菌，甚至如小分子NaOH也不易 进入。
耐药性
• 在固体培养基中对常用的含异烟肼1mg、 链霉素10mg、利福平50mg能生长的 结核分枝杆菌为耐药菌。耐药菌株毒力 有所减弱。异烟肼可影响细胞壁中分枝 菌酸的合成，诱导结核分枝杆菌成为L型, 此可能是耐异烟肼的一种原因。药物敏 感试验表明对异烟肼耐药，而对利福平 和链霉素大多仍敏感。
二、致病性
免疫性
• 免疫机制 结核分枝杆菌是胞内感染菌， 其免疫主要是以T细胞为主的细胞免疫。 T细胞不能直接和胞内菌作用，必须先与 感染细胞反应，导致细胞崩溃，释放出 结核分枝杆菌。机体对结核分枝杆菌虽 能产生抗体，但抗体只能与释出的细菌 接触起辅助作用。
• 结核分枝杆菌侵入呼吸道后，由于肺泡 中80%～90% 是巨噬细胞，10% 是淋 巴细胞（T细胞占多数）；原肺泡中未活 化的巨噬细胞抗菌活性弱，不能防止所 吞噬的结核分枝杆菌生长，反可将结核 分枝杆菌带到他处。但可递呈抗原，使 周围T淋巴细胞致敏。
染色
• 分枝杆菌一般用齐尼（ZiehlNeelsen)抗酸染色法，以5% 石炭酸 复红加温染色后可以染上，但用3%盐酸 乙醇不易脱色。若再加用美蓝复染，则 分枝杆菌呈红色，而其他细菌和背景中 的物质为蓝色。
培养特性
• 专性需氧。最适温度为37℃，低于30℃ 不生长。结核分枝杆菌细胞壁的脂质含 量较高，影响营养物质的吸收，故生长 缓慢。在一般培养基中每分裂1代需时 18～24h，营养丰富时只需5h。