实验三、蛋白质的盐析分离和凝胶层析曹志贱

一、实验目的1. 了解凝胶分离蛋白的基本原理和方法。

2. 掌握凝胶分离蛋白的实验操作步骤。

3. 通过实验，验证凝胶分离蛋白的可行性。

二、实验原理凝胶分离蛋白实验是利用凝胶的分子筛作用，根据蛋白质分子大小和形状的差异进行分离。

实验中，将蛋白质样品加入凝胶层析柱中，通过洗脱液的作用，使不同大小的蛋白质在凝胶中停留不同的时间，从而实现分离。

三、实验材料1. 凝胶层析柱2. 蛋白质样品3. 洗脱液4. 试剂：考马斯亮蓝、乙醇、乙酸、苯酚等5. 仪器：紫外分光光度计、凝胶成像系统、离心机等四、实验步骤1. 制备凝胶层析柱：将凝胶层析柱装满凝胶，确保凝胶紧密填充。

2. 准备蛋白质样品：将蛋白质样品与适量的洗脱液混合，使其成为均匀的溶液。

3. 加样：将制备好的蛋白质样品加入凝胶层析柱中。

4. 洗脱：用洗脱液对凝胶层析柱进行洗脱，收集不同时间的洗脱液。

5. 分析：将收集到的洗脱液进行考马斯亮蓝染色，用紫外分光光度计测定吸光度，分析蛋白质的分离效果。

6. 结果记录：记录实验过程中观察到的现象和结果。

五、实验结果与分析1. 蛋白质分离效果：通过考马斯亮蓝染色，观察到不同大小的蛋白质在凝胶层析柱中分离效果良好，表明凝胶分离蛋白实验成功。

2. 蛋白质纯度：根据洗脱液吸光度变化，分析蛋白质的纯度。

实验结果表明，分离得到的蛋白质纯度较高。

3. 实验误差分析：实验过程中可能存在的误差有凝胶层析柱制备不均匀、样品处理不当等。

为减小误差，应严格控制实验条件，提高实验精度。

六、实验结论凝胶分离蛋白实验成功实现了蛋白质的分离，证明了凝胶分离蛋白的可行性。

实验结果表明，凝胶分离蛋白具有操作简便、分离效果良好、纯度高等优点，是一种有效的蛋白质分离方法。

七、实验讨论1. 实验过程中，凝胶层析柱制备是关键步骤。

为提高分离效果，应确保凝胶层析柱制备均匀。

2. 实验过程中，样品处理对分离效果有较大影响。

应严格控制样品处理条件，提高实验精度。

3. 实验结果与分析表明，凝胶分离蛋白是一种有效的蛋白质分离方法，具有广泛的应用前景。

实验三凝胶过滤法分离蛋白质【实验目的】了解凝胶层析的基本原理，并学会用凝胶层析分离纯化蛋白质。

【基本原理】凝胶过滤其基本原理是利用被分离物质分子大小不同及固定相（凝胶）具有分子筛的特点，将被分离物质各成分按分子大小分开，达到分离的方法。

凝胶过滤的主要装置是填充凝胶颗粒的层析柱。

目前使用较多的凝胶时交联葡聚糖凝胶（商品名是Sephadex）。

这种高分子材料具有一定孔径的网络结构。

高亲水，在水溶液里吸水可膨胀。

其交联高的小号胶Sephadex-G-25适用于脱盐。

当在填充好凝胶颗粒的层析柱顶加入被分离的分子大小不同的混合物并用洗脱液洗脱时，小分子物质可进入胶粒内部，而受排的大分子不能进入胶粒内部，由此二者在洗脱过程所经路程长短不同而得以分离。

由于大分子物质只能沿着胶粒之间的间隙向下流动，所经路程短，最先流出；而渗入胶粒内部的小分子物质受迷宫效应的影响，要经过层层扩散向下流动，所经路程长，最后流出；通透性居中的分子则后于大分子而先于小分子流出。

从而按由大到小的顺序流出实现分离的目的。

凝胶过滤的操作条件温和，适于分离不稳定的化合物。

凝胶颗粒不带电荷，不与被分离物质发生反应，因此溶质回收率接近100%，而且设备简单、分离效果好、重现性强，凝胶柱还可反复使用，所以广泛应用于蛋白质等大分子物质非分离纯化、分子质量测定、脱盐等用途。

在含有血红蛋白（M w=64500）的溶液中加入过量的高铁氰化钾（K3Fe（CN）6，M w=327.25）,血红蛋白与高铁氰化钾反应生成高铁血红蛋白（MetHb）。

为了除去多余的高铁氰化钾，等到较纯的MetHb（红褐色）洗脱较快，而小分子高铁氰化钾（黄色）洗脱较慢，从而达到将MetHb完全分离出来的目的。

【实验试剂、材料和器材】（一）试剂（1）0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）：称取磷酸氢二钠20.7472g和磷酸二氢钠3.1167g，溶于约900mL的蒸馏水中，调pH值到7.0，最后定容到1000mL。

一、实验目的1. 理解并掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法；2. 掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法；3. 通过实验，了解球蛋白的特性及其分离纯化过程；4. 验证实验结果，提高实验操作技能。

二、实验原理1. 盐析法：利用蛋白质在不同浓度的盐溶液中溶解度差异，通过沉淀和溶解的方式实现蛋白质的分离。

在实验中，清蛋白和球蛋白在高浓度中性盐溶液中（常用硫酸铵）溶解度不同，清蛋白溶解，球蛋白沉淀。

2. 凝胶层析法：根据蛋白质与无机盐类之间分子量的差异，通过凝胶颗粒的网孔分离蛋白质。

分子直径大的蛋白质不能进入凝胶颗粒的网孔，而分子直径小的无机盐能进入凝胶颗粒的网孔，从而达到去盐的目的。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：血清、硫酸铵、Sephadex G-25凝胶柱、醋酸纤维素薄膜、染色剂、缓冲液等。

2. 实验仪器：离心机、电泳仪、凝胶层析仪、紫外检测仪、移液器、烧杯、试管等。

四、实验步骤1. 盐析法分离球蛋白（1）取一定量的血清，加入等体积的半饱和硫酸铵溶液，充分混匀。

（2）将混合液在4℃下静置过夜。

（3）将混合液以3000r/min离心10分钟，收集沉淀。

（4）将沉淀用少量去离子水洗涤，重复洗涤两次。

（5）将洗涤后的沉淀溶解于适量去离子水中，得球蛋白粗制品。

2. 凝胶层析法纯化球蛋白（1）将Sephadex G-25凝胶柱用去离子水充分浸泡，使其充分膨胀。

（2）将球蛋白粗制品加入凝胶柱中，让其自然流出。

（3）收集流出的蛋白质溶液，得纯化后的球蛋白。

3. 球蛋白鉴定（1）将纯化后的球蛋白用醋酸纤维素薄膜电泳法鉴定其纯度。

（2）观察电泳图谱，判断球蛋白的纯度。

五、实验结果与分析1. 盐析法分离球蛋白通过实验，观察到清蛋白溶解于硫酸铵溶液中，而球蛋白沉淀，说明盐析法可以有效地分离清蛋白和球蛋白。

2. 凝胶层析法纯化球蛋白通过凝胶层析法，观察到蛋白质在凝胶柱中分离，纯化后的球蛋白分子量较小，表明凝胶层析法可以有效地去除无机盐，纯化球蛋白。

沪科教版选修1生物技术实践《蛋白质的提取和分离》评课稿摘要本文是对沪科教版选修1生物技术实践课程中《蛋白质的提取和分离》这一实验的评课稿。

本文将从实验目的、实验原理、实验过程、实验结果及讨论、实验评价等方面对该实验进行详细描述和评价。

1. 实验目的本次实验的目的是让学生了解蛋白质的提取和分离技术的原理和方法，并通过实际操作掌握蛋白质的提取和分离过程。

2. 实验原理蛋白质的提取和分离是通过一系列的化学和分离方法，将混合物中的蛋白质分离出来。

通常的提取和分离方法包括碱解法、酸解法、溶解法等。

在本次实验中，我们采用了酸解法，利用酸性环境下蛋白质的溶解性进行提取。

具体操作流程如下： 1. 准备样品：准备需要提取的蛋白质样品，如鸡蛋白、牛奶等。

2. 酸解：将样品与酸性溶液（如盐酸）混合，使蛋白质溶解于溶液中。

3. 过滤：将溶液过滤，去除杂质和固体颗粒。

4. 蛋白质沉淀：向过滤后的溶液中加入饱和盐溶液，蛋白质在饱和盐溶液中会沉淀出来。

5. 蛋白质分离：将蛋白质沉淀进行离心、洗涤等处理，最终得到分离的蛋白质。

3. 实验过程本次实验的实验过程如下：步骤1：准备样品 - 准备需要提取的蛋白质样品，如鸡蛋白或牛奶。

步骤2：酸解 - 取一定量的样品，加入适量的酸性溶液（如盐酸），搅拌均匀。

步骤3：过滤 - 将酸解的样品通过滤纸或滤膜进行过滤，去除杂质和固体颗粒。

步骤4：蛋白质沉淀 - 将过滤后的溶液中加入饱和盐溶液（如硫酸铵），搅拌均匀。

- 静置一段时间，观察到有白色沉淀产生。

步骤5：蛋白质分离 - 将产生的蛋白质沉淀用离心机进行离心分离，去除上清液。

- 重复离心和洗涤的步骤，直至洗涤液中不再有颜色。

- 最后用无菌去离子水洗涤蛋白质沉淀。

4. 实验结果及讨论本次实验的实验结果可以通过观察蛋白质提取和分离的过程得出。

观察到酸解后的样品溶液变得浑浊，说明蛋白质溶解于溶液中。

经过过滤后，观察到溶液中有白色沉淀生成，这是蛋白质在饱和盐溶液中沉淀的结果。

一、实验目的1. 了解蛋白质盐析的原理和方法。

2. 掌握蛋白质盐析实验的基本操作步骤。

3. 分析蛋白质盐析过程中可能出现的现象及其原因。

二、实验原理蛋白质盐析是指在蛋白质溶液中加入一定浓度的中性盐，使蛋白质从溶液中沉淀析出的过程。

这是因为中性盐中的离子与蛋白质分子争夺水分子，破坏了蛋白质的水化层，导致蛋白质溶解度降低，从而发生沉淀。

蛋白质盐析是一个可逆过程，当降低盐浓度或去除盐离子时，蛋白质可以重新溶解。

盐析过程中，蛋白质的沉淀和溶解受多种因素影响，如盐的种类、浓度、pH值、温度等。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：新鲜鸡蛋清、硫酸铵、蒸馏水、pH试纸、移液器、试管、烧杯、搅拌器等。

2. 实验仪器：电子天平、恒温水浴锅、显微镜等。

四、实验步骤1. 准备蛋清溶液：取新鲜鸡蛋，轻轻敲破蛋壳，取出蛋清，按新鲜鸡蛋清1份，九份0.9%NaCl溶液的比例稀释配制蛋清液，混匀，用四层纱布过滤后备用。

2. 配制硫酸铵溶液：称取适量硫酸铵，溶于适量蒸馏水中，配制成所需浓度的硫酸铵溶液。

3. 盐析实验：将蛋清溶液分为若干份，分别加入不同浓度的硫酸铵溶液，充分搅拌，观察蛋白质沉淀情况。

4. 沉淀与溶解实验：将沉淀的蛋白质用蒸馏水洗涤，观察蛋白质是否能够重新溶解。

5. 分析实验现象：记录蛋白质沉淀和溶解的情况，分析实验结果。

五、实验结果与分析1. 实验现象（1）随着硫酸铵浓度的增加，蛋清溶液中蛋白质沉淀逐渐增多。

（2）当硫酸铵浓度达到一定值时，蛋白质沉淀量达到最大。

（3）继续增加硫酸铵浓度，蛋白质沉淀量不再增加。

（4）用蒸馏水洗涤沉淀后的蛋白质，部分蛋白质重新溶解。

2. 实验分析（1）蛋白质盐析过程中，随着硫酸铵浓度的增加，蛋白质溶解度降低，导致蛋白质沉淀。

（2）当硫酸铵浓度达到一定值时，蛋白质沉淀量达到最大，说明此时蛋白质溶解度最低。

（3）继续增加硫酸铵浓度，蛋白质沉淀量不再增加，说明蛋白质已经达到饱和状态。

（4）用蒸馏水洗涤沉淀后的蛋白质，部分蛋白质重新溶解，说明盐析是一个可逆过程。

蛋白质的盐析实验报告蛋白质的盐析实验报告引言：蛋白质是生命体内最基本的分子之一，它们在细胞内发挥着重要的生物学功能。

了解蛋白质的性质和结构对于深入研究生物学和医学领域具有重要意义。

蛋白质的盐析实验是一种常用的方法，可以通过溶液中添加盐类来使蛋白质发生沉淀，从而进一步研究其性质和结构。

本实验旨在探究蛋白质的盐析现象及其影响因素。

材料与方法：1. 蛋白质溶液：选取适量的蛋白质样品，溶解于适量的缓冲液中，调节pH至所需范围。

2. 盐溶液：选取不同种类和浓度的盐溶液，如氯化铵、硫酸铵等。

3. 试管：清洁干净的试管，用于混合蛋白质溶液和盐溶液。

4. 离心机：用于离心实验样品，分离沉淀和上清液。

5. 分光光度计：用于测定上清液中蛋白质的浓度。

实验步骤：1. 准备蛋白质溶液：将适量的蛋白质样品溶解于缓冲液中，调节pH至所需范围。

2. 准备盐溶液：选取不同种类和浓度的盐溶液，如氯化铵、硫酸铵等。

3. 将蛋白质溶液和盐溶液按照一定比例混合，轻轻摇匀。

4. 放置混合液在室温下静置一段时间，观察是否出现沉淀。

5. 将混合液置于离心机中，以适当的速度离心一段时间，使沉淀和上清液分离。

6. 取出上清液，用分光光度计测定蛋白质的浓度。

结果与讨论：在本次实验中，我们选取了不同种类和浓度的盐溶液，与蛋白质溶液按照一定比例混合。

在观察和离心过程中，我们发现不同盐溶液对蛋白质的盐析现象有着不同的影响。

首先，我们发现盐溶液的种类对蛋白质的盐析现象有着重要的影响。

以氯化铵为例，当其浓度逐渐增加时，蛋白质的盐析现象逐渐明显。

这是因为氯化铵中的氯离子和铵离子与蛋白质中的极性基团发生相互作用，从而导致蛋白质分子间的相互作用增强，形成较大的聚集体，最终发生沉淀。

其次，我们还观察到盐溶液的浓度对蛋白质的盐析现象有着明显的影响。

随着盐溶液浓度的增加，蛋白质的盐析现象逐渐加剧。

这是因为盐溶液的浓度增加会导致溶液中盐离子的浓度增加，从而增强了与蛋白质分子间的相互作用，使其更容易形成沉淀。

蛋白质盐析实验报告一、引言蛋白质作为生命的基本组成单位，在维持细胞结构和功能方面起着重要作用。

研究蛋白质结构和特性的方法有很多，其中蛋白质盐析是一种常用的分离和纯化方法。

本实验旨在通过蛋白质盐析实验，探索蛋白质与盐溶液相互作用的原理和规律。

二、实验原理蛋白质盐析是利用电解质溶液与蛋白质之间的相互作用来分离和纯化蛋白质。

当蛋白质和盐溶液混合后，盐的存在会引起蛋白质和溶液中水分子之间的电荷作用力的变化。

如果盐浓度适当，蛋白质会被盐吸引而出现沉淀。

反之，当盐浓度过高时，蛋白质会溶解。

三、实验步骤1. 准备工作：准备所需的蛋白质溶液和盐溶液。

选择合适的盐和浓度，通常常用的是氯化铵或硫酸铵溶液。

2. 将一定量的蛋白质溶液倒入试管中。

3. 逐渐加入适量的盐溶液，同时用玻璃杯轻轻摇晃试管。

4. 观察试管中的现象，记录出现沉淀的盐浓度，称之为盐析点。

5. 测定盐析点后，可以尝试不同浓度的盐溶液，观察蛋白质的溶解和沉淀情况。

四、实验结果和讨论在实验中，我们选择了牛血清蛋白（BSA）作为蛋白质溶液，采用氯化铵作为盐溶液。

通过逐渐加入氯化铵溶液，我们观察到以下现象：当盐溶液浓度较低时，蛋白质溶液呈现均匀的透明状态，没有出现明显的沉淀。

随着盐浓度的逐渐增加，当盐浓度达到一定值时，蛋白质开始出现沉淀。

这表明盐的存在改变了蛋白质和溶液中水分子之间的相互作用力，导致蛋白质被吸引而形成沉淀。

随着盐浓度的继续增加，蛋白质的沉淀量逐渐增多，直到盐浓度过高时，蛋白质又重新溶解。

通过不断尝试不同盐浓度的溶液，我们可以得到蛋白质盐析的曲线。

曲线上的盐析点表示蛋白质在该浓度下开始出现沉淀的临界浓度。

进一步调整盐溶液的浓度，还可以观察到蛋白质的再溶解点。

实验结果表明，蛋白质盐析的发生与盐浓度密切相关。

合适的盐浓度可以促使蛋白质沉淀，从而实现蛋白质的分离和纯化。

这是因为盐溶液中的离子与蛋白质分子之间相互作用的改变，导致蛋白质出现沉淀。

而当盐浓度过高时，离子作用力过于强大，蛋白质再次溶解。

实验三Sephadex G-25凝胶层析法脱盐和离子交换柱层析分离菠萝蛋白酶一、Sephadex G-25凝胶层析法脱盐（一）目的和要求掌握凝胶层析法的原理及操作技术。

（二）原理凡盐析所获得的粗制蛋白质（盐析得到的IgG）中均含有硫酸铵等盐类，这类将影响以后的纯化，所以纯化前均应除去，此过程称为“脱盐”（desalthing）。

脱盐常用透析法和凝胶过滤法，这两种方法各有利弊。

前者的优点是透析后析品终体积较小，但所需时间较长，且盐不易除尽；凝胶过滤法则能将盐除尽，所需时间也短，但其凝胶过滤后样品体积较大。

凝胶过滤（gel filtration），又称为凝胶层析（gel chromatography）、分子筛过滤（molecular sieve filtration）、凝胶渗透层析（gel osmotic chromatography）等。

它是20世纪60年代发展起来的一种层析技术。

其基本原理是利用被分离物质分子大小不同及固定相（凝胶）具有分子筛的特点，将被分离物质各成分按分子大小分开，达到分离的方法。

凝胶是由胶体粒子构成的立体网状结构。

网眼里吸满水后凝胶膨胀呈柔软而富于弹性的半固体状态。

人工合成的凝胶网眼较均匀地分布在凝胶颗粒上有如筛眼，小于筛眼的物质分子均可通过，大于筛眼的物质分子则不能，故称为“分子筛”。

凝胶之所以能将不同分子的物质分开是因为当被分离物质的各成分通过凝胶时，小于筛眼的分子将完全渗入凝胶网眼，并随着流动相的移动沿凝胶网眼孔道移动，从一个颗粒的网眼流出，又进入另一颗粒的网眼，如此连续下去，直到流过整个凝胶柱为止，因而流程长、阻力大、流速慢；大于筛眼的分子则完全被筛眼排阻而不能进入凝胶网眼，只能随流动相沿凝胶颗粒的间隙流动，其流程短、阻力小、流速快，比小分子先流出层析柱；小分子最后流出。

分子大小介于完全排阻不能进入或完全渗入凝胶筛眼之间的物质分子，则居中流出。

这样被分离物质即被按分子的大小分开。

凝胶过滤法分离蛋白质一、实验目的了解凝胶层析的基本原理，并学会用凝胶层析分离纯化蛋白质。

二、实验原理凝胶过滤其基本原理是利用被分离的分子大小不同及固定相（凝胶）具有分子筛的特点：本实验使用交联葡聚凝胶，其具有一定孔径的网络结构。

高亲水，在水溶液里吸水可膨胀。

当其填充完成后，加入混合分子大小不同的分离液。

由于大分子物质只能沿着胶粒之间的间隙向下流动，所经路短，最先流出；而涌入胶粒内部的小分子物质，受迷宫效应的影响，要经过层层扩散向下流动，所经路程长，最后流出，通透性居中的分子则后于大分子而先于小分子流出。

从而按大到小的顺序流出实现分离的目的。

三、试剂与仪器0.1mol/L磷酸缓冲液（PH7.0），0.4%K3Fe(CN)6,交联葡聚凝胶，鸡的抗凝全血1.5*20cm的层析柱，试管，量筒，大烧杯，玻璃棒四、实验步骤1.凝胶溶胀2.装柱：从层析柱加入缓冲液，打开出口，将气泡赶走，关闭下端开口，然后加入约6cm的缓冲液，灌注凝胶，打开下端开口。

使其自然沉降高度约17cm，并使其床面覆盖缓冲液，关闭出口盖上小形圆形滤纸。

待凝胶形成后，再用缓冲液洗脱2~3次。

3.样品处理4.上样和过滤：吸取约0.5ml混合液，在距离床面1mm处沿管内壁轻轻加入样品。

打开出口，让样品溶液慢慢浸入凝胶内。

凝胶柱面加上一层磷酸盐缓冲液，并用1~2倍体积的此缓冲洗脱。

5.部分收集：控制速度为0.5ml/min左右，用试管收集洗脱液。

并观察柱上的色带，待黄色的0.4%完全脱下来后，再继续收集两管透明洗脱液作对照，关闭出口。

6.凝胶回收：收集样品后，凝胶柱用3~5倍体积洗脱液继续洗脱，从回收凝胶留给下一组。

五、实验现象结果及其讨论颜色：开始时为无色透明，但时间过去，试管中收集的红褐色开始变深，到最后，试管的颜色为深褐色，接着溶液的颜色开始变浅，红褐色几乎要消失。

接着又开始出现浅黄色，再到黄色，再黄色开始慢慢变浅，最后又变成无色透明。

原因：1.开始时，由于先加进缓冲液，而加入的全血扩散没有那么快，所以白色透明液体为缓冲液。

实验二血清清蛋白的分离及电泳鉴定一、实验目的1．掌握盐析法、凝胶层析、分离提纯蛋白质的原理和方法。

2．掌握醋酸纤维薄膜电泳分离蛋白质的原理和方法。

二、实验原理血清蛋白主要由清蛋白和球蛋白组成，各行使其重要的功能。

本实验利用盐析方法将血清中的清蛋白和球蛋白分离，并用电泳技术观察蛋白质分离教果。

1．蛋白质分子能稳定存在于水溶液中是因为有两个稳定因素：水化膜和表面电荷。

当维持蛋白质的稳定因素破坏时，蛋白质分子可相互聚集沉淀而析出，蛋白质分子沉淀析出的方法很多，根据对蛋白质稳定因素破坏的不同有中性盐析法、有机溶溶剂法、重金属盐法以及生物碱试剂法等。

盐析法是以中性盐如硫酸铵((NH４)２SO4)等对蛋白质作用破坏蛋白质表面水化膜而使蛋白质相互聚集而析出。

不同的蛋白质沉淀需要的中性盐浓度不同，在不同盐浓度下，蛋白质溶解度不同。

球蛋白在半饱和状态下发生沉淀，而请蛋白在完全饱和状态下沉淀，利用此特性可把蛋白质分段沉淀下来，此种盐析法称分段盐析。

盐析后蛋白质沉淀经水溶后，最大特点是保持蛋白质生物学活性，因此，盐析法是研究蛋白质分子的结构和功能的最常用方法。

除盐析法，有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、柱层析法和超速离心法等也是蛋白质分离的常用方法。

2．水溶后的蛋白质含有高浓度中性盐，需要有脱盐过程去除蛋白质遗留的中性盐，常用方法有：透析法脱盐和凝胶层析法脱盐。

本实验采用凝胶层析法脱盐，在葡聚糖凝胶柱中，蛋白质与盐的分子量不同，当样品通过层析柱时，分子量较大的蛋白质因为不能通过网孔而进入凝胶颗粒，沿着凝胶颗粒间的间隙流动，所以流程较短，向前移动速度较快，最先流出层析柱；反之，盐的分子量较小，可通过网孔而进入凝胶颗粒，所以流程长，向前移动速度较慢，流出层析柱的时间较后。

分段收集蛋白质洗脱液，即可得到脱盐的蛋白质。

3．蛋白质分离效果可用电泳方法检测，根据电泳图谱与未分离前蛋白质溶液和标准蛋白质比较，判断蛋白质的分离纯化的效果。

蛋白质盐析实验报告一、引言蛋白质是生物体内重要的功能分子之一，具有多种生理活性，如酶活性、结构功能等。

研究蛋白质的结构与功能对于理解生命活动具有重要意义。

而蛋白质盐析是一种常用的分离和纯化蛋白质的方法，通过改变蛋白质与溶剂中离子浓度之间的平衡关系，使其发生沉淀，从而实现蛋白质的分离。

二、实验目的本实验旨在通过盐析方法分离纯化蛋白质，了解蛋白质溶液在不同离子浓度条件下的溶解性变化，探究蛋白质与溶液离子之间的相互作用机制，并验证盐析方法的分离效果。

三、实验步骤1. 实验前准备：准备好所需的蛋白质溶液、盐溶液和缓冲溶液，并将其调整至所需浓度。

同时准备好离心管、试管、移液管等实验用具。

2. 盐析实验操作：a. 取一系列试管，分别加入不同浓度的盐溶液，如氯化铵、硫酸铵等。

b. 向每个试管中加入相同体积的蛋白质溶液，并充分混匀。

c. 静置一段时间，观察是否出现蛋白质沉淀。

d. 将试管放入离心机中，以一定速度离心，使蛋白质沉淀到离心管底部。

e. 倒掉上清液，留下蛋白质沉淀。

f. 加入适量的缓冲溶液溶解蛋白质沉淀，得到纯化的蛋白质溶液。

四、实验结果与分析通过实验操作，观察到在不同离子浓度条件下，蛋白质溶液的溶解性发生变化。

当盐溶液浓度较低时，蛋白质溶液呈现较好的溶解状态，无明显沉淀现象；而当盐溶液浓度逐渐增加时，蛋白质溶液逐渐出现沉淀。

这是因为在高离子浓度条件下，离子与蛋白质分子之间的相互作用增强，导致蛋白质分子间的相互吸引力增大，进而发生沉淀现象。

通过离心操作，我们可以将蛋白质沉淀分离出来，从而实现蛋白质的纯化。

在离心过程中，蛋白质沉淀到离心管底部，上清液中则含有较少的蛋白质。

通过倒掉上清液，留下蛋白质沉淀，我们可以得到纯化的蛋白质溶液。

为了保持蛋白质的活性和稳定性，我们在溶解蛋白质沉淀时添加了适量的缓冲溶液。

五、实验总结蛋白质盐析实验是一种常用的蛋白质分离和纯化方法。

通过改变蛋白质与溶剂中离子浓度之间的平衡关系，实现了蛋白质的分离。

血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、纯化与鉴定实验报告生物化学实验报告姓名：学号：专业年级：组别：生物化学与分子生物学实验教学中心格式要求：正文请统一用：小四号，宋体，1.5倍行距；数字、英文用Times New Roman；标题用：四号，黑体，加粗。

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一、实验目的1、掌握盐析法、凝胶层析法、离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法。

2、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法。

3、了解柱层析技术。

二、实验原理1、粗提（盐析法）：蛋白质分子能稳定存在于水溶液中是因为有两个稳定因素：表面的电荷和水化膜。

当维持蛋白质的稳定因素破坏时，蛋白质分子可相互聚集沉淀而析出。

盐在水溶液中电离所形成的正负离子可吸引水分子，从而夺取蛋白质分子上的水化膜，还可中和部分电荷使蛋白质分子聚集而沉淀，从而达到盐析沉淀蛋白质的目的。

由于血清中各种蛋白质颗粒大小、所带电荷多少及亲水程度不同，因此，利用不同浓度的硫酸铵溶液分段盐析，便可将血清中清蛋白和球蛋白从溶液中沉淀出来，达到初步分离清蛋白、球蛋白的目的。

2、脱盐（凝胶层析法）凝胶层析法利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异。

当溶液通过凝胶柱时，溶液中分子量较大的蛋白质因为不能通过网孔进入凝胶颗粒，沿着凝胶颗粒间的间隙流动，所以流程较短，向前移动速度较快，最先流出层析柱。

而盐的分子量较小，可通过网孔进入凝胶颗粒，所以流程长，向前移动速度较慢，较晚流出层析柱。

从而可达到去盐的目的。

3、纯化（离子交换层析法）离子交换是溶液中的离子和交换剂上的离子进行可逆的的交换过程。

带正电荷的交换剂称为阴离子交换剂；带负电荷的交换剂称为阳离子交换剂。

本实验采用的DEAE纤维素是一种阴离子交换剂，溶液中带负电荷的离子可与其进行交换结合，带正电荷的离子则不能，这样便可达到分离纯化的目的。

脱盐后的蛋白质溶液尚含有各种球蛋白，利用它们的等电点的不同可进行分离。

实验一蛋白质分子量的测定——凝胶层析法一、实验目的1.掌握凝胶层析的基本原理。

2.学习利用凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量的实验技能。

二、实验原理凝胶层析法也称分子筛层析法，是利用具有一定孔径大小的多孔凝胶作固定相的层析技术。

当混合物随流动相经过凝胶层析柱时，其中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。

该法设备简单、操作方便、重复性好、样品回收率高。

凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构、呈珠状颗粒的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，像筛子，小的分子可以进入凝胶网孔，而大的分子则排阻于颗粒之外。

当含有分子大小不一的蛋白质混合物样品加到用此类凝胶颗粒装填而成的层析柱上时，这些物质即随洗脱液的流动而发生移动。

大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动，流程短，移动速率快，先被洗出层析柱；而小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，故流程长，移动速度慢，最后被洗出层析柱，从而使样品中不同大小的分子彼此获得分离。

若分子大小介于上述完全排阻或完全渗入凝胶的物质，则居二者之间从柱中流出。

总之，各种不同相对分子质量的蛋白质分子，最终由于它们被排阻和扩散的程度不同，在凝胶柱中所经过的路程和时间也不同，从而彼此可以分离开来。

将凝胶装在柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt表示。

实质上Vt是由V o，Vi与Vg三部分组成，Vo称为“孔隙体积”或“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积，相应于一般层析法中柱内流动相的体积；Vi为内体积，即凝胶颗粒内部所含水相的体积。

Vg为凝胶本身的体积。

洗脱体积（Ve）与Vo与Vi之间的关系可用下式表示：Ve=Vo+KdVi式中Ve为洗脱体积，自加入样品时算起，到组分最大浓度（峰）出现时所流出的体积；Kd为样品组分在二相间的分配系数，也可以说Kd是分子量不同的溶质在凝胶内部与外部的分配系数。

它只与被分离的物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关，而与柱的长度粗细无关，也就是说它对每一物质为常数，与柱的物理条件无关。